專利名稱：一種快速檢測和鑒別惡性瘧和間日瘧的試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及利用單克隆抗體及免疫層析技術制備一種試劑盒，來定性檢測人全血 中是否含有間日瘧原蟲特異的乳酸脫氫酶(pLDH)和惡性瘧原蟲特異性的組胺酸富集蛋白 2 (HRP-2)，以檢測和鑒別受試者是否惡性瘧和間日瘧患者。其特征在于所述的試劑盒的由 兩大部分組成，包括試劑條和樣本裂解液。試劑條由4部分組成，依次是1)樣品墊；2)抗 PLDH抗體和抗HRP-2抗體標記的膠體金顆粒，標記好的膠體金顆粒干燥于玻璃纖維或者聚 酯膜上；3)在檢測區T1/T2位置分別包被了抗pLDH抗體和抗HRP-2抗體，在質控區C位置 包被了羊抗鼠抗體的硝酸纖維素膜；4)吸水紙。本發明的產品具有靈敏度高，特異性強，能 夠通過測試而檢測和鑒別受試者是否惡性瘧和間日瘧患者，操作過程簡單，無須復雜設備， 檢測速度快、準確。
背景技術：
瘧疾是由雌性按蚊叮咬人體時將其體內寄生的瘧原蟲子孢子傳入人體而引起的。 臨床表現為間歇性、定時性、發作性的寒戰、高熱和大汗，以及貧血和脾腫大。造成人類瘧疾 是由四種不同的瘧原蟲引起，即惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲，其中 后兩種僅在少數的幾個地區存在較多。瘧原蟲乳酸脫氫酶(pLDH)是同廣泛存在于動物、植 物及微生物細胞內的乳酸脫氫酶同工酶一樣，是糖酵解途徑的末端酶，pLDH在瘧原蟲的整 個紅內期均表達，在瘧原蟲能量代謝中發揮重要作用。早期的研究表明，PLDH是一種具有 瘧原蟲種屬特異性的循環抗原，它的保守基因序列為所有瘧原蟲所共有，而它同宿主動物 LDH在理化、免疫學特性和酶學方面有很大的差異，pLDH是檢測瘧原蟲的理想靶抗原之一。 HRP-2(組氨酸富集蛋白)是惡性瘧原蟲含有的特異性蛋白，是檢測惡性瘧原蟲的理想靶抗 原之一。本試劑盒用于檢測全血中是否含有pLDH/HRP-2，從而可檢測和區分是否有瘧原蟲 或者惡性瘧原蟲存在。
發明內容
試劑盒采用高度特異性的抗體抗原反應及免疫層析分析技術來定性檢測全血中 是否含有瘧原蟲特異PLDH和惡性瘧原蟲特異性HRP-2，試劑盒含有被事先固定于膜上測試 區(Tl)的抗HRP-2抗體和pLDH抗體，質控區(C)的羊抗鼠抗體。測試時，血標本滴入試劑 盒加樣孔(S)內，血標本中的pLDH/HRP-2與預包被在膜上的抗體膠體金結合物反應。然后， 混合物隨之在毛細效應下向上層析，在測試區(T1/T2)與固定在膜上的抗HRP-2/pLDH抗體 反應。如果血清中含有HRP-2/pLDH，在測試區內(T1/T2)會各出現一條紫紅色條帶，表明 是惡性瘧原蟲陽性結果。如果血清中含有PLDH，在測試區內(T2)會出現一條紫紅色條帶， (Tl)不會出現一條紫紅色條帶，表明是間日瘧原蟲陽性結果。如果在測試區內(T1/T2)沒 有出現紫紅色條帶，則血清中不含有HRP-2/pLDH，表明是陰性結果。無論HRP-2/pLDH是否 存在于標本中，混合物都會繼續向上層析至質控區(C)，與質控區的抗鼠膠體反應出現一條紫紅色條帶。質控區內(C)所顯現的紫紅色條帶是判定是否有足夠血標本，層析過程是否 正常的標準，同時也作為試劑的內控標準。操作步驟
在進行任何測試前必須先完整閱讀使用說明，使用前將檢測試劑盒和全血標本恢 復至室溫，取出反應緩沖液并放置20分鐘使其恢復至室溫(20-30°C )。1.從原包裝鋁箔袋中取出試劑盒(注意在打開鋁箔袋前應先恢復至室溫)。在 一小時內進行測試會得到最佳效果，特別是在室溫高于30°C或是在高度潮濕的環境中應盡 快地使用。2.將試劑盒置于干凈平坦的臺面上，用一次性毛細吸管垂直滴入IOul全血標本 于加樣孔S中，然后滴入3滴緩沖液于加樣孔S中。3.等待紫紅色條帶的出現，在15分鐘左右讀取測試結果。關鍵要注意，在紫紅色 條帶出現以前，背景要清晰，特別當樣本中含有低滴度的HRP-2/pLDH，會導致出現的T1/T2 線顏色很淡，此時更需注意背景要清晰。在20分鐘后讀取的結果無效。
圖結果判定陽性(+)1.惡性瘧原蟲陽性(P. f.)質控區(C)出現一條紫紅色條帶，在測試區內(Tl/ T2)會各出現一條紫紅色條帶，樣本中含有HRP-2/pLDH，表明是惡性瘧原蟲陽性結果。2.間日瘧原蟲陽性(P. v.)質控區(C)出現一條紫紅色條帶，在測試區內(T2)出 現一條紫紅色條帶，(Tl)沒有出現一條紫紅色條帶，樣本中含有pLDH，無HRP-2，表明是間 日瘧原蟲陽性結果。陰性㈠質控區(C)出現一條紫紅色條帶，在測試區內(T1/T2)都不出現一條紫 紅色條帶，樣本中不含有HRP-2/pLDH，表明是瘧原蟲陰性結果。無效質控區(C)未出現紫紅色條帶，表明不正確的操作過程或試劑盒已變質損 壞。在任何情況下，應重新測試。如果問題仍然存在，應立即停止使用此批號產品，并與當 地供應。注意測試區(T)內的紫紅色條帶可顯現出顏色深淺的現象。但是，在規定的觀察 時間內，不論該色帶顏色深淺，即使只有非常弱的色帶也應判為陽性結果。
具體實施例方式包裝組成檢測試劑盒(20人份)反應緩沖液(8ml)使用說明書(1份)所需設備秒表一次性試管采血針
標本收集標本收集后應盡快使用。標本若不能及時送檢，可冷藏在2V ~8V 3天。長期保 存需冷凍于-20°C，忌反復凍融。預計評估本檢測試劑盒與血片檢測法進行了比較，兩者之間的符合率達到了 95 %。
存儲和穩定性原包裝儲存于4-30°C C，并裝在密封的袋中。反應緩沖液保存于4-30°C。試劑盒 在有效期內是穩定的，切忌冷凍或在過有效期后使用。
權利要求
一種快速檢測和鑒別惡性瘧和間日瘧的試劑盒，包括檢測試劑條和樣本裂解液線)，其特征在于所述的檢測試紙條由四部分組成，依次是經處理溶液處理的樣品墊、抗pLDH抗體和抗HRP-2抗體的膠體金顆粒、在檢測區T1/T2位置分別包被了抗pLDH抗體和抗HRP-2抗體以及在質控區C位置包被了羊抗鼠抗體的硝酸纖維素膜、吸水紙。
2.權利要求1所述的快速檢測和鑒別惡性瘧和間日瘧的試劑盒，其特征在于樣品處 理液含有皂素以及表面活性劑的磷酸緩沖液。
3.權利要求1所述的快速檢測和鑒別惡性瘧和間日瘧的試劑盒，用抗pLDH抗體和抗 HRP-2抗體包被T1/T2以及在質控區C位置包被了羊抗鼠抗體的硝酸纖維素膜，將配制好 的標記膠體金溶液干燥到玻璃纖維上，再與吸水紙、膠板緊密依次粘貼制備成試劑條，其特 征在于標記膠體金溶液的處理溶液組分配比為Tween80 0. 01-2. 5% ；PVA 0. 01-2. 5% ； 蔗糖0. 5-3%，緩沖液PH8. 0-9. 5,0. 01-0. 5的硼砂，所述的測試條的干燥工藝為溫度在 35-45°C，相對濕度在20-30%，干燥時間12-24小時。
全文摘要
本發明涉及利用單克隆抗體及免疫層析技術制備一種試劑盒，來定性檢測人全血中是否含有間日瘧原蟲特異的乳酸脫氫酶(pLDH)和惡性瘧原蟲特異性的組胺酸富集蛋白2(HRP-2)，以檢測和鑒別受試者是否惡性瘧和間日瘧患者。本發明的產品具有靈敏度高，特異性強，能夠通過測試而檢測和鑒別受試者是否惡性瘧和間日瘧患者，操作過程簡單，無須復雜設備，檢測速度快、準確。
文檔編號G01N33/569GK101806799SQ200910147608
公開日2010年8月18日 申請日期2009年6月9日 優先權日2009年6月9日
發明者端青, 許紅偉, 陳浪 申請人:北京金沃夫生物工程科技有限公司