一種改良的雙抗原夾心免疫檢測法的制作方法

專利名稱：：一種改良的雙抗原夾心免疫檢測法的制作方法
技術領域：
：本發明涉及免疫檢測領域，具體地說，是涉及一種改良的雙抗原夾心免疫檢測法。
背景技術：
：免疫檢測是應用免疫學技術測定標本中待測物質的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質。根據檢測原理的不同，免疫檢測可以分為間接法、夾心法(包括雙抗原夾心法和雙抗體夾心法)、捕獲法、競爭法等。雙抗原夾心法屬于夾心法的一種，廣泛應用于免疫檢測領域。其基本原理是用特異性抗原進行包被和制備標記結合物，通過兩次免疫結合，形成包被抗原-抗體-標記抗原復合物，完成待測抗體的檢測。根據抗原標記物及檢測技術的不同，雙抗原夾心法又可進一步具體應用于酶聯免疫(ELISA)、快速診斷(包括基于膠體金、膠體銀、膠體硒、乳膠等的快速診斷)、放射免疫、熒光免疫等檢測中。酶聯免疫的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。雙抗原夾心ELISA法，是雙抗原夾心免疫檢測法在ELISA檢測上面的一個具體應用。在測定時，受檢標本中的抗體與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方式使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢抗體的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產3物的量與標本中受檢抗體的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。故雙抗原夾心ELISA法廣泛應用于傳染病等項目的抗體檢測，具有靈敏度高，特異性好的特點。快速診斷檢測采用膠體金、膠體銀、膠體硒、乳膠等標記物，利用此類標記物可以牢固吸附在抗原/抗體的表面而不影響抗原/抗體的活性，當標記抗體/抗原與待測標本中的抗原/抗體反應聚集到一定濃度時，可以直接呈現顏色，從而達到快速診斷的效果。快速診斷檢測又可進一歩具體為斑點滲濾法，免疫層析法等。免疫層析法是上世紀九十年代興起的一種基于免疫膠體金技術的快速診斷技術，其原理是將特異的抗體/抗原先固定于硝酸纖維膜的某一區帶，當該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體/抗原的區域時，樣品中相應的抗原/抗體即與該抗體/抗原發生特異性結合，若用免疫膠體金可使該區域顯示一定的顏色，從而實現特異性的免疫診斷。雙抗原夾心免疫層析法，是雙抗原夾心免疫檢測法在免疫層析檢測上面的一個具體應用，此方法檢測待測樣品中的目標抗體，具有迅速便捷的優勢。化學發光免疫觀lj定(Chemiluminescentimmunoassay,CLIA)是將抗原與抗體特異性反應與敏感性的化學發光反應相結合而建立的一種免疫檢測技術。放射免疫測定法將放射性的靈敏度與免疫的特異度相結合，既簡便準確又靈敏可靠。雙抗原夾心法均可具體應用于這兩種檢測方法。但是，雙抗原夾心法在具體實施時，常常會由于試劑、材料、環境等因素，特別是待測樣品中的一些干擾性物質會引起非特異性結合，導致有一定程度的假陽性，影響了檢測結果的可信度。常規的處理方法就是調低包被或者標記抗原的用量，提高抗原純度，嚴格控制雙抗原夾心法試劑盒材料的質量等方面去緩解。但是調低包被或者標記抗原的用量勢必會降低檢測的靈敏度，提高抗原純度也不可能使抗原純度達到百分之百，試劑盒材料的質量也不是自己可以隨意可調控的因素。因此雙抗原夾心法檢測目4的抗體時，背景過高以及假陽率高始終是一個難以解決的問題。為此，必須尋求一種方法來降低雙抗原夾心法的背景和假陽率，提高檢測的特異性。
發明內容發明目的本發明的目的就是為了提供一種改良的雙抗原夾心免疫檢測法，降低檢測的背景和假陽率，提高檢測的特異性。技術方案在雙抗原夾心法檢測樣品時，有多種因素可能導致假陽，包括操作員，待測樣品本身含有的干擾性物質，試劑盒所采用的抗原抗體以及其它輔料等等因素。在這些因素當中，檢測中由于樣品含有的干擾性物質的非特異性結合是引起假陽的重要因素。非特異性結合的是指在待測樣品中除待測抗體以外的其他物質與包被抗原或者檢測系統中的固相支持物結合，使得檢測結果為假陽。為了減少和降低這種非特異性結合，本發明將抗人IgG加入到檢測體系中，利用抗人IgG的非特異性結合特性，使其與待測樣品中的其他蛋白或者抗體產生非特異性的結合，由于這種結合將對兩者的空間構象產生影響，增大了非待測抗體與包被抗原或者標記抗原產生非特異性結合的空間位阻，降低了結合的幾率，從而降低了由于非特異性結合的干擾帶來的假陽。而對于待測抗體，由于抗原抗體間的結合是特異性的，抗人IgG即使結合到待測抗體上，對靈敏度的影響不大(可參看實施例中的具體試驗數據)。進一步具體來說，本發明將抗人IgG單克隆抗體或者多克隆抗體，以合適的使用比例加入到雙抗原夾心法檢測的反應體系之中，例如將抗人IgG單克隆抗體或者多克隆抗體加入到ELISA檢測法的樣品稀釋液、免疫層析檢測法的加樣墊或者標記物墊上，按照免疫層析試劑盒的一般結構組裝成雙抗原夾心法檢測試劑盒。因此，本發明提供一種改良的雙抗原夾心免疫檢測法，此方法在雙抗原夾心法的反應體系中加有抗人IgG抗體。通過抗人IgG在檢測體系中的作用，尤其是抗人IgG抗體與檢測體系中各種成分的復合作用的綜合影響，達到最終降低假陽的效果。本發明中利用的抗人IgG經驗證可以是單克隆抗體，多克隆抗體。通過一系列的實驗證明了抗人IgG在雙抗原夾心法中具有普遍適應性。本發明可以應用于酶聯免疫法、快速檢測法、放射免疫檢測法、熒光免疫檢測法等，相應的，其標記物可以是酶、膠體金、膠體銀、膠體硒、乳膠、化學發光物質、熒光物質、放射性物質。更進一歩，本發明公開了該方法在快速診斷檢測中的應用。可將抗人IgG抗體加入加樣墊或標記物墊。相應的，本發明公開了上述方法制備的快速診斷檢測試劑盒，由PVC底板、加樣墊、標記物墊、NC膜、吸水紙、對照線和檢測線組成，在加樣墊或者標記物墊中含有抗人IgG抗體。此外，本發明還公開了該方法在酶聯免疫檢測上的應用，具體可將抗人工gG抗體加入樣品稀釋液中。相應的，本發明公開了上述方法制備的酶聯免疫檢測試劑盒，由多孔板、樣品稀釋液、酶結合物稀釋液、顯色液組成，在樣品稀釋液中加有抗人IgG抗體。實施例的數據證明了抗人IgG在雙抗原夾心法的應用可以在不影響檢測靈敏度的條件下，降低檢測系統中由非特異性結合干擾所帶來的假陽，保證檢測的準確度。本發明的詳細技術方案，將在以下的實施例中進行說明。實施例以雙抗原夾心法檢測丙型肝炎病毒(H印atitisCVirus,HCV)抗體和梅毒螺旋體(Tr印onemaPallidum,TP)抗體為例詳細闡述，對于其它項目的雙抗原夾心法，本領域的普通技術人員可以以此類推。需要說明的是，在現有技術中，采用捕獲法測定特異IgM時，也有人在樣品稀釋液中加入抗人IgG抗體。之所以加入抗人IgG抗體，是因為樣品中的IgG抗體會跟待測IgM抗體競爭性的結合抗原標記物，導致檢測的靈敏度降低；加入抗人IgG抗體，會減少這種競爭性結合，保證了IgM檢測的靈敏度。所以說，這項現有技術，和本發明的技術是有很大區別的。發明優點本發明通過引入抗人IgG實現了對雙抗原夾心法的改良，在現有技術的靈敏度條件下，大大降低了檢測的背景和假陽率，提高了檢測的特異性。具體實施例方式本發明的目的、技術方案及優點將結合實施例作進一步詳細闡述。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限定本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如文獻(薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯，等.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南[M].北京科學出版社，1992)中所述的條件，或者試劑盒生產廠家推薦的方法進行，在此不必贅述。實施例1加樣墊加有抗人IgG多克隆抗體的HCV雙抗原夾心法金標試紙條1.1HCV包被抗原的制備PCR擴增丙型肝炎病毒基因NS3部分如SEQIDNO.1所對應的DNA區段(屬于NS3蛋白的一部分)，其上游引物如SEQIDN0.2所示，帶有BamHI位點，下游引物如SEQIDN0.3所示，帶有HindIII位點。PCR的片段經回收之后，用BamHI和HindIII酶切，連接到用BamHI和HindIII酶切之后的PQE30載體(Qiagen公司)中，得到的陽性重組質粒PQE30-NS3。將質粒PQE30-NS3轉化ER2566菌(美國NewEnglandBiolabs公司)，用500ml含lOOug/ml氨芐西林鈉(上海生工生物工程技術服務有限公司，貨號A0339)的LB培養基37t:振蕩培養至OD600=1.0左右，用終濃度為0.5mM的IPTG(上海生工生物工程技術服務有限公司，貨號IB0168)，37。C誘導4小時。74°C5000g離心20分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20ml裂解緩沖液(50mMTirs-HCl，pH8.0，ImMEDTA，lOOmMNaCl)重懸，超聲破碎，4°C12000g離心20分鐘，經SDS-PAGE電泳鑒定后，部分目的蛋白分布在包涵體。包涵體用含2%TritonX_100(上海生工生物工程技術服務有限公司，貨號T0694)的溶液I(20mMTirs-HCl，pH8.5，5mMEDTA，lOOmMNaCl)重懸，超聲，4°C12000rpm離心20分鐘收集包涵體，用溶液I配制的4M尿素溶解后，對100倍體積的PB緩沖液(pH7.0,20mM)透析，換液3次，4°C12000rpm離心20分鐘去除沉淀后制成粗抗原，用同一PB緩沖液平衡S印hacrylS_200凝膠柱(美國AmershamBiosciences公司)后將上述粗抗原過柱，收集合并含目的蛋白的溶液，用平衡緩沖液(10mMNa2HPO"1.8mMKH2P04，140mMNaCl，2.7mMKC1，25mM咪唑(美國Sigma-Aldrich公司，貨號15513)，pH8.0)充分透析。用10倍柱床體積的平衡緩沖液平衡Ni-NTA親和柱(Qiagen公司，貨號30210)之后，加入透析之后的蛋白樣，用10倍介質體積的平衡緩沖液洗去未結合的蛋白，再用5倍體積洗脫緩沖液(20mMNa2HP04，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0)，洗脫目的蛋白，再用PB緩沖液透析，去除咪唑，測定蛋白濃度，蛋白命名為PQE-NS3，此為本發明的包被抗原。1.2HCV標記抗原的制備將上述經過BamHI和HindIII酶切之后的NS3片段連接到經過BamHI和HindlII酶切之后的PET-30a載體(Novagen公司，貨號69909-3)中，得到的陽性重組質粒PET30a-NS3轉化ER2566菌，用500ml含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程技術服務有限公司，貨號KB0286)的LB培養基37。C振蕩培養至0D60(^1.0左右，用終濃度為O.5mM的IPTG，37。C誘導4小時。4°C5000g離心20分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20ml裂解緩沖液重懸，超聲破碎，4°C12000g離心20分鐘，經SDS-PAGE電泳鑒定后，部分目的蛋白分布在裂解液包涵體。后續純化步驟和PQE-NS3—樣，純化得到的蛋白命名為30a-NS3，此為本發明的標記抗原。81.3膠體金的制備在三角燒瓶中加入100ml超純水，磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，加入lml1%氯金酸(Sigma-Aldrich公司，貨號16961-25-4)溶液，沸騰后立刻加入lml1%檸檬酸三鈉(Sigma-Aldrich公司，貨號6132-04-3)水溶液，繼續沸騰10分鐘，然后自然冷卻即可。1.4HCV抗原-膠體金標記物的制備取10ml上述膠體金放入燒杯中，攪拌中加入150ul的0.2MK^03調節pH至7.0，繼續攪拌30秒；加入150-300ug的HCV標記抗原30a-NS3，繼續攪拌10分鐘；加入O.lml10%BSA，繼續攪拌5分鐘；5000g離心10分鐘，吸出上清，將沉淀收集至一合適容器；對上清再用10000g離心15分鐘，重復第一次離心的操作；對上清再用12000g離心30分鐘，棄掉上清，將三次離心的沉淀收集到同一離心管中，用膠體金稀釋液(20mMPB，150mMNaCl，1%BSA，0.l%TritonX-100，2%Sucrose，0.01%Proclin300)定容至lml充分混勻后放-4'C保存。1.5試紙條的組裝將上述金標復合物用膠體金稀釋液10倍稀釋后以0.45u1/腿2加到標記物墊上，_50°0真空冷凍干燥5&后于41:存放，即制成標記物墊。鼠抗人IgG多克隆抗體，采用一般實驗室的制備方法，在此并無特別之處，所以不需要贅述。將鼠抗人IgG多克隆抗體用PBS緩沖液稀釋到0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4,0、5.0、8.0、10.Omg/ml，分別浸泡玻璃纖維(Watman公司)，-5(TC真空冷凍干燥6h后于4。C存放，作為加樣墊。沒有加鼠抗人IgG多克隆抗體的PBS作為對照。用檢測線稀釋液(lOmMPBS+2。/。蔗糖)稀釋HCV包被抗原PQE-NS3以及對照線抗體到工作濃度，分別為2.Omg/ml和1.Omg/ml，隨后用點膜儀(噴液量均為0.05ul/匪，噴液速度為70ml/S)分別包被在硝酸纖維素膜(Millipore公司，貨號HF135002)上，形成間隔0.5cm的測試線(T線)和質控線(C線)，室溫晾干。將h述標記物墊、包被好的硝酸纖維素膜以及吸水紙、PVC底板、加樣墊等輔料組裝成HCV金標雙抗原夾心法檢測試紙條。1.6試紙條的檢測方法加100ul待測樣品(例如饑清)到加樣墊處，室溫放置20分鐘之后，判定結果。結果判定標準如下①僅質控區出現一條帶，在測試區內無條帶出現，為陰性(-);②有兩條條帶出現，其中一條位于質控區，另一條位于測試區，表示陽性(十)；③質控區未出現條帶，表明不正確的操作過程或試紙條己變質損壞。在此情況下，應用新的試紙條重新測試。1.7檢測結果選用經過RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)驗證過的100份HCV陽性血清和3000份陰性血清，同時用本發明加樣墊用鼠抗人IgG多克隆抗體預處理之后的HCV金標雙抗原夾心法檢測試紙條，以及本發明的對照試紙條來檢測，得到了表l的結果。表1:不同濃度的鼠抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條假陽性評價<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>對于100份陽性血清，本發明試紙條和對照試紙條都全部檢出，且信號強度差別不大。對于3000份陰性血清，對照試紙條有77份檢出(假陽)，假陽率為2.57%，在3.0mg/ml的鼠抗人IgG多克隆抗體處理之后的加樣墊制備的試紙條有17份檢出(假陽)，假陽率為0.57%，二者有顯著差異。我們將100份經過RIBA2.0驗證過的HCV陽性標本，用PBS稀釋25、50、100、200倍，以及不稀釋作為對照，考察不同濃度的鼠抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度，得到的結果如表2所示。表2:不同濃度的鼠抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度情況鼠抗人IgG多克隆抗體的濃度(mg/ml)PBS對照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0標本稀釋倍數ioo份標本中檢出陽性數110010010010010010010010010010099982510010010010010010010010010099958950999999999998989897959176100979797979796969693928361200848383818079787874716549從表2可以看出，抗人IgG的濃度越高，對靈敏度的影響越大，在8.0和10.0mg/ml時，原倍的標本也有漏檢，說明，并不是抗人IgG的使用濃度越高，效果越好。綜合表1和表2的結果，為了同時保證試紙條有最佳的靈敏度和最好的特異性，本發明的加樣墊上鼠抗人IgG多克隆抗體的使用濃度是0.055.Omg/ml，優選為0.54.Omg/ml，更優選為2.03.Omg/ml。實施例2標記物墊加有抗人IgG多克隆抗體的HCV雙抗原夾心法金標試紙條分別參見實施例l.l、1.2、1.3、1.4制備HCV包被抗原、HCV標記抗原、膠體金以及標記抗原-膠體金復合物。2.5試紙條的組裝將鼠抗人IgG多克隆抗體用PBS緩沖液稀釋到0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3,0、4.0、5.0、8.0、10.Omg/ml，分別浸泡玻璃纖維(Watman公司)，-5(TC真空冷凍干燥6h后于4r存。沒有加鼠抗人IgG多克隆抗體的PBS作為對照。將標記抗原-膠體金復合物用膠體金稀釋液10倍稀釋后以丄/irrf加到上述加有鼠抗人IgG多克隆抗體處理之后的玻璃纖維上，-5(TC真空冷凍干燥5h后于4'C存放，即制成標記物墊。用檢測線稀釋液(10mMPBS+2》〕蔗糖)稀釋HCV包被抗原PQE-NS3以及對照線抗體到工作濃度，分別為2.Omg/ml和1.OmgZml，隨后用點膜儀(噴液量均為0.05ul/mm，噴液速度為70ml/S)分別包被在硝酸纖維素膜(Millipore公司,貨號HF135002)上，形成間隔0.5cm的測試線(T線)和質控線(C線)，室溫晾十。將上述標記物墊、包被好的硝酸纖維素膜以及吸水紙、PVC底板、加樣墊等輔料組裝成HCV金標雙抗原夾心法檢測試紙條。2.6試紙條的檢測方法參見實施例1.6進行檢測。2.7檢測結果選用經過RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)驗證過的100份HCV陽性血清和3000份陰性血清，同時用本發明加樣墊預處理之后的HCV金標雙抗原夾心法檢測試紙條，以及本發明的對照試紙條來檢測，得到了表3的結果。表3:不同濃度的鼠抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條假陽性評價鼠抗人IgG多克RIBAPBS對照隆抗體的濃度2.0對照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0(mg/ml)陽性檢出份數1001001001001001001001001001001009898檢出率(%)1001001001001001001001001001001009898假陽檢出份數0773431282423211920202120假陽率02.571.131.030.930.800.770.70C.630.670.670.700.67對于100份陽性血清，本發明試紙條和對照試紙條都全部檢出，且信12號強度差別不大。對于3000份陰性血清，對照試紙條有77份檢出(假陽)，假陽率為2.57%,在3.0mg/ml的鼠抗人IgG多克隆抗體處理之后的加樣墊制備的試紙條有19份檢出(假陽)，假陽率為0.63%，二者有顯著差異。我們將100份經過RIBA2.0驗證過的HCV陽性標本，用PBS稀釋25、50、100、200倍，以及不稀釋作為對照，考察不同濃度的鼠抗人工gG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度，得到的結果如表4所示。表4:不同濃度的鼠抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度情況鼠抗人IgG多克隆抗體的濃度(mg/ml)PBS對照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0標本稀釋倍數ioo份標本中檢出陽性數110010010010010010010010010010098972510010010010010010010010010099948750999999999998989797%90741009797979796%%9593918362200848484848281797874716651從表4可以看出，鼠抗人IgG多克隆抗體的濃度越高，對靈敏度的影響越大，在8.0和10.0mg/ml時，原倍的標本也有漏檢，說明，并不是鼠抗人IgG多克隆抗體的使用濃度越高，效果越好。綜合表3和表4的結果，為了同時保證試紙條有最佳的靈敏度和最好的特異性，本發明的加樣墊上鼠抗人IgG多克隆抗體的使用濃度是0.055.0mg/ml，優選為0.54.Omg/ml，更優選為2.03.Omg/ml。實施例3加樣墊或者標記物墊加有抗人IgG單克隆抗體的HCV雙抗原夾心法金標試紙條參見實施例1、2，制備加樣墊或者標記物墊加有抗人IgG單克隆抗體的HCV雙抗原夾心法金標試紙條，最后得到了跟實施例1.7和2.7類似的結果，這說明，在加樣墊或者標記物墊加入抗人IgG單克隆抗體或者多克隆抗體都可以提高金標試紙條檢測的特異性。實施例4樣品稀釋液加有抗人IgG多克隆抗體的HCV雙抗原夾心法ELISA13試劑盒分別參見實施例1.1、1.2制備HCV包被抗原、HCV標記抗原。4.3HCV標記抗原-HRP標記物的制備HCV標記抗原和服P的偶聯采用Nal04氧化法。稱取10mg辣根過氧化物酶(HRP，美國SIGMA公司，貨號P8375)溶解于lml超純水中，再緩慢滴加lml超純水新鮮配制的5mg/mlNaI04(生工，貨號ST1244)溶液，室溫下避光輕柔攪拌40分鐘后加入20%乙二醇(生工，貨號E0582)溶液0.05ml，室溫下避光攪拌40分鐘。然后立即加入事先對100mM，pH9.51碳酸鹽緩沖液透析2小時，2.5mg/ml的純化好的30a_NS3抗原lml，4。C避光對100mM，pH9.51碳酸鹽緩沖液透析過夜。次日，向混合物中滴加0.lml新鮮配制的4mg/mlNaBH4(生工，貨號ST1268)溶液，混勻，4。C靜置2小時。將上述溶液裝入透析袋中，對PBS緩沖液(150mM，pH7.4)透析，4。C過夜。加入酶保護劑及終濃度50。/。的甘油混勻后-2(TC避光保存備用，此標記物下文稱為30a-NS3-HRP。4.4試劑盒的檢測方法將PQE30-NS3抗原以一定比例用碳酸鹽緩沖液(50mM，pH9.51)稀釋，100ul/孔加入酶標板(深圳金燦華實業有限公司輻照酶標板)，4。C包被24小時，次日用PBST(10mMPB，150raMNaCl，0.05%Tween-20，pH7.4)洗滌液洗板二次，拍干，120ul/孔加入含30%新生牛血清(北京元亨圣馬生物技術研究所)，8%蔗糖，5%。酪蛋白(美國Sigma-Aldrich公司，貨號C-8645)，150mMNaCl的pH7.4，lOmMPB封閉液，37。C封閉2小時，甩掉孔內液體，拍干，置室溫20-25°C、濕度55%-65%、有通風設備的房間內風干。封裝于加有干燥劑的鋁膜袋中，包被完畢。在包被酶標板中每孔加入100ul樣品稀釋液(配方PH7.4PB，0.15MNaCl，20%NBS，0.5%明膠，1%Tween-20，0.04。％TtitonX-100，0.1%巰基乙醇，預先以1:10000，1:5000，1:2000，1:1000，1:500，1:200，1:100，1:50的稀釋比例加入抗人IgG多克隆抗體，設陰性對照14樣品稀釋液，不加抗人IgG多克隆抗體)，50Ul待測樣品、陰性參照樣品(正常人陰性血清)、陽性參照樣品(HIV抗體陽性血清)對照，37'C溫育30分鐘；用PBST洗滌液洗板五次，拍干。再100ul/孔加入含有20。/。新生牛血清，以一定比例稀釋的30a-NS3-HRP綴合物的pH7.4的20mMPB緩沖液，37°C溫育30分鐘；用PBST洗滌液洗板五次，拍干。每孔加入含0.5%。過氧化氫尿素(生工，貨號UB1753)、4.76%。三水合乙酸鈉、0.9。；冰醋酸的顯色劑A及含0.32。；TMB(生工，貨號TB0514)、5mM檸檬酸、0.5mMEDTA-2Na、5。/。甲醇、2^。二甲基甲酰胺的顯色劑B各50ul，37'C避光顯色10分鐘。每孔加50ul，含2M硫酸的終止液終止反應，酶標儀450nm波長(參考波長630nm)空白孔校零后讀取OD值。截值(CutoffValue(COV))計算COV二陰性對照平均OD值X2.0(陰性對照OD值低于0.075按0.075計算，高于0.075按實際OD值計算)，待測樣品OD值》COV為陽性，待測樣品OD值〈COV為陰性。4.5檢測結果選用經過RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)驗證過的100份HCV陽性血清和3000份陰性血清，同時用本發明的樣品稀釋液加有抗人IgG多克隆抗體的HCV雙抗原夾心法ELISA試劑盒，以及本發明的對照試紙條來檢測，得到了表5的結果。表5:不同濃度的抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試劑盒假陽性評價樣品稀釋液中抗人IgG多克隆抗體的稀釋比例RIBA2.0對照樣品稀釋液無抗人IgG多克隆抗體1000050002000100050020010050陽性檢出份數檢出率(%)假陽檢出份數100100100100211001001001001009998971001001001001009998971913814假陽率(%)0.700.630.430.270.170.230.270.300.47對于100份陽性血清，本發明試劑盒在1:10000到1:500區間抗人IgG多克隆抗體處理條件下和對照試劑盒都全部檢出，在l:200以及更高濃度抗人IgG多克隆抗體處理條件下，有漏檢。對于3000份陰性血清，對照試劑盒有21份檢出(假陽)，假陽率為0.70%，在本發明的試劑盒最好條件下，1:1000的抗人IgG處理條件下的試劑盒有5份檢出(假陽)，假陽率為O.17%，二者有顯著差異。我們將100份經過RIBA2.0(Ortho-ClinicalDiagnostics)驗證過的HIV陽性標本，用PBS稀釋25、50、100、200倍，以及不稀釋作為對照，考察不同濃度的抗人IgG多克隆抗體加入樣品稀釋液之后制備的試劑盒靈敏度，得到的結果如表6所示。表6:不同濃度的抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試劑盒靈敏度情況<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結果顯示，抗人IgG多克隆抗體在l:10000至l:500的使用比例范圍內，對試劑盒的靈敏度影響不大。綜合表5和表6的結果，為了同時保證試劑盒有最佳的靈敏度和最好的特異性，本發明的試劑盒樣品稀釋液里抗人IgG多克隆抗體的使用比例是l:2000到l:500，最優選為l:1000。本發明又采用抗人IgG單克隆抗體重復了本實施例的實驗，結果跟上述抗人IgG多克隆抗體的效果類似。實施例5加樣墊加有抗人IgG多克隆抗體的TP雙抗原夾心法金標試紙條5.1TP包被抗原的制備PCR擴增梅毒螺旋體17Kda(TP17)基因部分如SEQIDNO.4所對應的DNA區段，其上游引物如SEQIDNO.5所示，帶有BamHI位點，下游引物如SEQIDNO.6所示，帶有EcoRI位點。PCR的片段經回收之后，用BamHI和EcoRI酶切，連接到用BamHI和EcoRI酶切之后的表達載體PET_32a中，得到重組質粒PET-32a-TP17，即本發明的包被抗原的重組質粒。質粒PET-32a-TP17轉化ER2566(美國NewEnglandBiolabs公司)，用含100ug/ml氨芐西林鈉的500mlLB培養基37"振蕩培養至0D600=1.0左右，用終濃度為0.5mM的IPTG(生工，貨號IB0168)37。C誘導4小時。4°C5000g離心20分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20ml裂解緩沖液(50mMTirs-HCl，pH8.0，lmMEDTA，lOOmMNaCl)重懸，超聲破碎，4°C12000g離心20分鐘，經SDS-PAGE電泳鑒定后，大部分目的蛋白分布在裂解液上清中。收集上清，逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液(廣東光華化學試劑公司，貨號7783-20-2，調pH7.4)至硫酸銨終濃度為30%，4。C靜置30min，4°C12000g離心20分鐘，收集上清，繼續逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至硫酸銨終濃度為60%，4。C靜置30min，4°C12000g離心20分鐘，收集沉淀，用5ml平衡緩沖液(10mMNa2HP04，1.8raMKH2P04，140mMNaCl，2.7mMKCl，25mM咪唑(美國Sigma-Aldrich公司，貨號15513)，pH8.0)溶解。用10倍柱床體積的平衡緩沖液平衡Ni-NTA親和柱(Qiagen公司，貨號30210)之后，加入蛋白樣，用10倍介質體積的平衡緩沖液洗去未結合的蛋白，再用5倍體積洗脫緩沖液(20mMNa2HP04，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0)，洗脫目的蛋白，測定蛋白濃度，-2(rC保存備用，蛋白命名為32a-TP17。5.2TP標記抗原的制備用2.1中的TP17片段，連接到用BamHI和EcoRI雙酶切處理之后的表達載體pGEX-6P-l(Phamacia公司，貨號27-4597-01)中得到重組質粒pGEX-6P-1-TP17，即本發明的標記抗原的重組質粒，以下簡稱6P-TP17。上述陽性克隆，接種于含100ug/ml氨節西林鈉(生工，貨號A0339)的500mlLB培養基37。C振蕩培養至OD600=1.0左右，用終濃度為0.5mM的IPTG37。C誘導4小時。4°C5000g離心20分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20ml裂解緩沖液(50mMTirs-HCl，pH8.0，ImMEDTA，lOOmMNaCl)重懸，超聲破碎，4°C12000g離心20分鐘，經SDS-PAGE電泳鑒定后，大部分口的蛋白分布在裂解液上清中。收集上清，逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至石Jj充酸銨終濃度為25%，4'C靜置30min，4。C12000g離心20分鐘，收集上清，繼續逐滴緩慢加入飽和硫酸銨溶液至硫酸銨終濃度為45W，4t:靜置30min，4'C12000g離心20分鐘，收集沉淀，用10ml平衡緩沖液(pH7.3PBS，140mMNaCl，2.7mMKC1，lOraMNa2HP04，1.8mMNaH2P(M)溶解。用10倍柱床體積的平衡緩沖液平衡GSTrap親和柱(Amcrsham公司，貨號17-5130-02)之后，加入蛋A樣，用IO倍介質體積的平衡緩沖液洗去未結合的蛋白，再用5倍體積洗脫緩沖液(50mMTris-HC1，10mM還原型谷胱甘肽(Araresco公司，貨號0399)，pH8.0)，洗脫目的蛋白，測定蛋白濃度，-2(TC保存備用，蛋Q命名為GST-TP17。5.3膠體金的制備參見實施例1.3制備膠體金。5.4TP標記抗原-膠體金標記物的制備參見實施例].4制備TP標記抗原-膠體金標記復合物。5.5試紙條的組裝參見實施例1.5組裝加樣墊加有抗人IgG多克隆抗體的TP雙抗原夾心法金標試紙條。5.6檢測方法參見實施例1.6進行檢測。5.7檢測結果選用經過梅毒螺旋體確診試驗(TPPA)驗證過的100份TP陽性血清和3000份陰性血清，同時用本發明加樣墊預處理之后的的TP金標雙抗原夾心法檢測試紙條，以及木發明的對照試紙條來檢測，得到了表7的結果。表7:不同濃度的抗人TgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條假陽性評價抗人igc;rpp/ipk;gmq10205102fl"ino多克隆抗對照對照18體的濃度(mg/ml)陽性檢出份數10010010。1001001001001001001001009897檢出率(%)100100100100100丄OO100丄OO1001001009897假陽檢出份數0483928242219181516161818假陽率(%)01.601.300.930.800.730.630.600.500.600.600.600.60對于100份陽性血清，本發明試紙條和對照試紙條都全部檢出，且信號強度差別不大。對于3000份陰性血清，對照試紙條有48份檢出(假陽)，假陽率為1.60%，在3.0mg/ml的抗人IgG多克隆抗體處理之后的加樣墊制備的試紙條有15份檢出(假陽)，假陽率為0.50%，二者有顯著差異。.我們將100份經過梅毒螺旋體確診試驗(TPPA)驗證過的TP陽性標本，用PBS稀釋25、50、100、200倍，以及不稀釋作為對照，考察不同濃度的抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度，得到的結果如表8所示。表8:不同濃度的抗人IgG多克隆抗體處理加樣墊后制備的試紙條靈敏度情況抗人TgG多克隆抗體的PBS對照0.050.10.20.51.02.03.04.05.08.010.0濃度(mg/ml)___IOO份標本中檢出陽性數100100丄OO1001001001001001001009896100100100100100100100100100999489999999999898989897959078979797979796969594948165200_848483828281807978786151從表8可以看出，抗人IgG多克隆抗體的濃度越高，對靈敏度的影響越大，在8.0和10.0mg/ml時，原倍的標本也有漏檢，說明，并不是抗人IgG多克隆抗體的使用濃度越高，效果越好。綜合表7和表8的結果，為了同時保證試紙條有最佳的靈敏度和最好的特異性，本發明的加樣墊上抗人IgG多克隆抗體的使用濃度是0.055.OmgZml，優選為0.54.Omg/ml，更優選為2.03.Omg/ml。標本稀釋子;數12550100此外，在TP項目中采用本發明并進行實施例2-4類似的實驗，結果顯示本發明應用于TP項目與HCV項目有相似的檢測效果，證明抗人IgG對TP項目同樣具有改善假陽和提高檢測特異性的效果。對于HCV、TP項目之外的其它項目，本發明也做了驗證實驗，結果基本跟上面的實施例類似，本
技術領域：
的研究人員根據本發明皆可實踐，故這里不再贅述。序列表〈110〉深圳市菲鵬生物股份有限公司<120>—種經過改進的雙抗原夾心法免疫層析試紙條〈160〉6<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211>795<212〉腿〈213>南型肝炎病毒(H印atitisCvirus)<220〉<223〉丙型肝炎病毒NS3部分序列<■〉1CTAGAAACTACCACGCGGTCTCCGGTTTTCACAGACAACTCATCCCCCCCGGCCGTACCG60CAGACATTCCAAGTGGCCCATCTACACGCTCCTACTGGCAGCGGCAAGAGCACTAAAGTG120CCGGCTGCATATGCGGCCCAAGGGTACAAGGTGCTCGTCCTGAACCCGTCCGTTGCCGCC180ACCTTAGGTTTTGGGGCGTATATGTCTAAGGCACATGGTATCGACCCTAGCGTCAGGACC240GGGGTAAGGACCATCACCACGGGTAGCCCCATCACGTACTCCACCTATGGCAAGTTCCTT300GCTGATGGTGGTTGCTCTGGGGGTGCCTATGACATTATAATATGTGATGAGTGCCATTCA360ACTGACTCGACTACTATCTTGGGCATCGGCACGGTCCTGGACCAAGCGGAGACGGCTGGA420GCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACCGCTACGCCTCCGGGATCGGTCACCGTGCCACATCCC480AACATCCAGGAGGTGGCCCTGTCCAATACTGGAGAGATCCCCTTCTATGGTAAAGCCATC540CCCATCGAGGCCATCAGGGGGGGAAGGCATCTCATTTTCTGCCACTCCAAGAAGAAGTGT600GACGAGCTCGCTGCAAAGCTATCATCC、CTCGGACTCAACGCTGTGGCGTACTACCGGGGT660CTTGATGTGTCCGTCATACCATCTAGCGGAGACGTCGTTGTCGTGGCAACAGACGCTCTA720ATGACGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACGTGCGTCACCCAG780ACAGTCGATTTCAGC79521<210>2<211>28<212>DNA<213〉人工合成〈220〉<223>HCVNS3上游引物〈400〉2GGAGGATCCCTAGAAACTACCACGCGGT28<210〉3<211>28〈212〉腿〈213〉人工合成〈220〉〈223〉HCVNS3下游引物〈400〉3GGGAAGCTTGCTGAAATCGACTGTCTGG28〈210>4〈211〉405〈212〉DNA〈213〉梅毒螺旋體(Treponemapallidum)<220>22〈223〉梅毒螺旋體17Kda蛋白的基因序列(TP17)〈400〉4TGTGTCTCGTGCATAACCGTGTGTCCGCACGCCGGGAAGGCCAAAGCGGAAAAGGTAGAG60TGCGCGTTGAAGGGAGGTATCTTTCGGGGTACGCTACCTGCGGCCGATTGCCCGGGAATC120GATACGACTGTGACGTTCAACGCGGATGGCACTGCGCAAAAGGTAGAGCTTGCCCTTGAG180AAGAAGTCGGCACCTTCTCCTCTTACGTATCGCGGTACGTGGATGGTACGTGAAGACGGA240ATTGTCGAACTCTCGCTTGTGTCCTCGGAGCAATCGAAGGCACCGCACGAGAAAGAGCTG300TACGAGCTGATAGACAGTAACTCCGTTCGCTACATGGGCGCTCCCGGCGCAGGAAAGCCT360TCAAAGGAGATGGCGCCGTTTTACGTGCTCAAAAAAACAAAGAAA405<210>5〈211〉28〈212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈223〉梅毒螺旋體17Kda蛋白的上游引物〈400〉5GGGGGATCCTGTGTCTCGTGCATAACCG28〈210〉6<211>30〈212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈223〉梅毒螺旋體17Kda蛋白的下游引物<400〉6GGGGAATTCTTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC30權利要求1.一種雙抗原夾心免疫檢測法，其特征在于反應體系中加有抗人IgG抗體。2.根據權利要求1的雙抗原夾心免疫檢測法，其特征在于抗人IgG抗體與待測樣品有接觸反應。3.根據權利要求2的雙抗原夾心免疫檢測法，其抗人IgG抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。4.根據權利要求2的雙抗原夾心免疫檢測法，其采用的標記物為酶。5.根據權利要求2的雙抗原夾心免疫檢測法，其采用的標記物為膠體金、膠體銀、膠體硒、乳膠。6.根據權利要求2的雙抗原夾心免疫檢測法，其采用的標記物為化學發光物質、熒光物質、放射性物質。7.—種根據權利要求3、4制備的雙抗原夾心法ELISA試劑盒，由多孔板、樣品稀釋液、酶結合物稀釋液、顯色液組成，其特征在于樣品稀釋液中含有抗人IgG抗體。8.—種根據權利要求3、5制備的雙抗原夾心法試紙條，由PVC底板、加樣墊、標記物墊、NC膜、吸水紙、對照線和檢測線組成，其特征在于在加樣墊或者標記物墊中含有抗人IgG抗體。全文摘要一種改良的雙抗原夾心免疫檢測法，其旨在降低現有雙抗原夾心檢測法的假陽率，提高檢測的特異性。該方法通過將抗人IgG單克隆抗體或者多克隆抗體，以合適的使用比例加入到雙抗原夾心法檢測的反應體系之中參與檢測，可具體應用于快速診斷、酶聯免疫檢測、化學發光檢測等多種檢測方法。本發明的雙抗原夾心免疫檢測法與現有雙抗原夾心免疫檢測法相比，檢測的背景和假陽率有顯著降低，特異性有大大提高。文檔編號G01N33/577GK101498730SQ20091010605公開日2009年8月5日申請日期2009年3月16日優先權日2009年3月16日發明者婧孫,孫興寶,亮彭,娟洪,潘少麗,王寧燕,王榮娥,鵬胡,顏文豪申請人:深圳市菲鵬生物股份有限公司