體外檢測精子-卵母細胞相互作用的方法

專利名稱：體外檢測精子-卵母細胞相互作用的方法
技術領域：
本發明涉及體外檢測精子-卵母細胞相互作用的方法，更具體 地，涉及體外聯合檢測精子-卯母細胞相互作用的方法。
背景技術：
哺乳動物的精子必須具備良好的生理功能才能完成受精過程。受 精是一個復雜的過程，需要經歷精子與卵細胞透明帶結合、透明帶誘 發頂體反應和精子穿過透明帶并與卯黃膜結合等過程才能完成，任何 一個環節出現問題均可導致受精失敗。可通過精子-卵母細胞相互作 用試驗對這些過程進行體外評估，從而尋找不孕不育的病因，并為輔 助生殖助孕方式的選擇提供直接的科學依據。
精子-卵母細胞相互作用試驗包括精子-透明帶結合試驗、透明帶
誘發精子頂體反應試驗和精子-透明帶穿透試驗，通常需要分成三個 不同檢測項目分別進行檢測，需要消耗4吏多標本資源，檢測成本高， 檢測時間長且檢測效率低。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于減少標本資源的消耗，降低檢測成 本，降低檢測時間并提高檢測效率。
為解決上述技術問題，本發明提供了一種體外檢測精子-卵母細
胞相互作用的方法，所述方法包括如下步驟a.上泳法或密度梯度法 提取精子；b.在培養液中按一定比例混合經步驟a提取后的精子與卵 母細胞，另設立卵母細胞空白對照，并均置于培養箱中反應；c.去除 步驟b中未與卵母細胞表面結合的精子，倒置相差顯微鏡下檢測與卵母細胞透明帶結合的精子數量；d.使步驟c中與卯母細胞透明帶結合 的精子和卵母細胞分離，分別收集分離后的精子和卵母細胞；e.將卵 母細胞空白對照精子、經步驟d分離后的精子涂于載玻片上，干燥， 固定液固定，洗滌，加入熒光素-凝集素標記物，反應后再次洗滌， 熒光顯微鏡下檢測精子頂體反應率；f.倒置相差顯微鏡下檢測經步驟 d分離的卵母細胞胞內已穿透進入其中的精子數量。
其中所述步驟c中通過以下方法去除步驟b中未與卵母細胞表面 結合的精子將反應后的卵母細胞轉移至另 一盛有培養液的細胞培養 皿中，反復吹打卵母細胞，然后轉移精子-卵母細胞結合物至另一盛 有培養液的細胞培養皿中。
其中所述步驟d中通過以下方法使步驟c中與卵母細胞透明帶結 合的精子和卵母細胞分離將精子-卵母細胞結合物移入微滴中，反 復吹打卵母細胞，然后將卵母細胞轉移至另一盛有培養液的細胞培養 皿中。
其中所述培養液的NaCl重量含量為0.28-1.11%、 KC1重量含量 為0.02-0.07°/。、 CaCl2'2H20重量含量為0.01-0.05°/。、 1012 04重量含 量為0.01-0.03%、 MgS04.7H20重量含量為0.01-0.06%、酚紅重量含 量為0.0005-0.003%。、 NaHC03重量含量為0.10-0.42%、葡萄糖重量 含量為0.05-0.20%、焦丙酮酸鈉重量含量為0.015-0.060%。、 BSA重量 含量為0.17-0.70%、青霉素的含量為10000-20000單位％、硫酸鏈霉 素重量含量為0.05-0.50%。和乳酸鈉糖漿(600 g/L)體積含量為 0.18-0.74%,余量為蒸餾水。
其中所述步驟b中的卵母細胞可以是新鮮卵母細胞或者是保存
在卵細胞保存液中的卵母細胞，其中所述卵細胞保存液的(NH4)2S04
重量含量為6.6-26.4%和Tris重量含量為0.12-0.48%,余量為蒸餾水， 其pH值為7.0-7.8。
其中可在步驟e中焚光顯微鏡下計數精子頂體反應率之前加入熒 光封固液，所述熒光封固液是含對苯二胺的磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.5-9.0。
其中所述步驟e中固定液是多聚曱醛、丙酮和曱醇的混合液。
其中所述步驟e中洗滌所使用的洗滌液是含Tween-20的磷酸鹽 緩沖液，其pH值為7.2-7.6。
其中所述步驟e中熒光素-凝集素標記物中的熒光素為異硫氰酸 熒光素(FITC)或四曱基異硫氰酸若丹明(TRITC),凝集素為刀豆蛋白 A、豌豆凝集素或花生凝集素。
本發明的有益效果在于實現了精子-透明帶結合試驗、透明帶誘 發精子頂體反應和精子-透明帶穿透試驗三個項目的聯合檢測，并由 此減少了精子標本的消耗，尤其是減少了來源困難的卵母細胞的消 耗，較大程度地節約了標本資源；減少了操作環節，較大程度地降低 了檢測成本；減少了操作步驟，降低了操作時間，大大提高了檢測效 率；同時所述4全測方法具有較高的準確性，有利于臨床常規應用與推 廣。
具體實施例方式
下文對本發明作進一步的詳細描述。 一樣本
精子來源于新鮮液化精液，也可采用液氮超低溫保存的解凍精子。
卵母細胞為新鮮卵母細胞或以卵細胞保存液2-8。C5fc存的卵母細 胞。臨用前用培養液洗滌以卵細胞保存液貯存的卵母細胞3次。
二試劑 1.培養液
培養液用于提取高活力精子，洗滌活體配子，并為精子和卵母細 胞提供能量和適宜的反應條件。
6本發明培養液的NaCl重量含量為0.28-1.11%、 KC1重量含量為 0.02-0.07%、 CaCl2'2H20重量含量為0.01-0.05%、 KH2P04重量含量 為0.01-0.03%、 MgSO小7H20重量含量為0.01-0.06%、酚紅重量含量 為0.0005_0.003%。、 NaHC03重量含量為0.10-0.420/。、葡萄糖重量含 量為0.05-0.20%、焦丙酮酸鈉重量含量為0.015-0.060%。、 BSA重量含 量為0.17-0.70%、青霉素的含量為10000-20000單位％、硫酸鏈霉素 重量含量為0.05-0.50%。和乳酸鈉糖漿(600 g/L)體積含量為 0.18-0.74%,余量為蒸餾水。
如下配制本發明培養液稱取NaCl 2.77-11.08 g、KCl 0.17-0.70 g、 CaCl2.2H20 0.12-0.50 g、 KH2P04 0.08-0.32 g、 MgS04.7H20 0.14-0.58 g、酚紅0.5-3 mg置燒杯中，加蒸餾水至1000ml，攪拌溶解備用；稱 取NaHC03 0.10-0.42 g、葡萄糖0.05-0.20 g、焦丙酮酸鈉1.5-6.0 mg、 BSA 0.17-0.70 g、青霉素10000-20000單位和硫酸鏈霉素5-50 mg,向 其加入乳酸鈉糖漿(600 g/L) 0.18-0.74 ml和上述步驟配制好的溶液 100 ml,攪拌溶解即可。
優選每1000 ml本發明培養液包含NaCl 5.54 g、 KC1 0.35 g、 CaCl2.2H20 0.25g、 KH2PO40.16g、 MgS04.7H20 0.29 g、酚紅1 mg、 NaHC032.1 g、葡萄糖1.0g、焦丙酮酸鈉30mg、 BSA 3.5 g、青霉素 100000單位、疏酸鏈霉素100 mg和乳酸鈉糖漿(600 g/L) 3.7 mL。
所述培養液還可用其他培養液^替，例如HTF、 F10和Earle培
養液等。
2.卵細胞保存液
卯細胞保存液用于在2-8。C條件下保持卵母細胞的功能穩定性。 本發明卵細胞保存液為pH 7.4的三羥甲基氨基曱烷(Tris)緩沖
液。所述卵細胞保存液的(NH4)2S04重量含量為6.6-26.4%和Tris重量
含量為0.12-0.48%，余量為蒸餾水。
如下配制本發明卵細胞保存液稱取(NH4)2S04 66.0-264.2 g和
Tris 1.2-4.8g置燒杯中，加蒸餾水至900 ml,攪拌溶解；調pH調至7.0-7.8,加蒸餾水至1000ml， 4。C保存。
優選1000 ml本發明卵細胞保存液包含(NH4)2S04 132.1 g和Tris 2.4 g， pH為7.4。
所述Tris還可用其他緩沖物質代替，而且Tris的含量也可為其他 值，只要能夠確保卵細胞保存液的pH值為7.0-7.8且不影響卵細胞保 存液穩定卵細胞功能的作用即可。
3. 熒光封固液
熒光封固液用于延長熒光標記物在熒光照射下的淬滅時間。
本發明熒光封固液為含對苯二胺和甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)。 所述熒光封固液的Na2HPO(12H20重量含量為0.4-0.8%、 KH2P04重 量含量為0.02-0.10%、 NaN3重量含量為0.01-0.5%、對苯二胺重量含 量為0.05-0.5%和甘油體積含量為5-50%,余量為蒸餾水。
如下配制本發明熒光封固液稱取Na2HP0412H20 0.4-0.8 g、 KH2P04 0.02-0.10 g、 NaN3 0.01-0.5 g、對苯二胺0.05-0.5 g置燒杯中， 加蒸餾水至45ml，攪拌溶解；加入甘油5-50ml;調pH至7.5-9.0， 加蒸餾水至100ml， 4。C保存。
優選每100 ml本發明熒光封固液包含Na2HP04'12H20 0.6 g、 KH2P04 0.05 g、 NaN3 0.02 g、對苯二胺0.25 g和甘油25 ml, pH為 8.0。
所述NaN3還可用其他防腐劑代替，而且防腐劑的含量也可為其 他值，只要能抑制細胞生長且對檢測無影響即可；所述PBS還可用 其他緩沖物質代替，而且PBS的含量也可為其他值，只要能夠確保 熒光封固液的pH值為7.5-9.0即可，含量的多少基本不會加速熒光素 在熒光照射下的淬滅時間。
4. 固定液
固定液可終止反應，使精子的蛋白質分子形成交聯鍵沉淀，從而 達到穩定精子結構和增加精子在載玻片上的粘合力的效果。
本發明固定液是多聚曱醛、丙酮和曱醇的混合液。所述固定液的多聚曱醛重量含量為1%-3%、丙酮體積含量為40%-50%和曱醇體積 含量為30%-45%，余量為蒸餾水。
如下配制本發明固定液稱取多聚曱醛1-3 g置燒杯中，加蒸餾 水20ml，攪拌溶解；加入丙酮40-50 ml和曱醇30-45 ml,混勻后室 溫保存。
優選本發明固定液的多聚曱醛重量含量為2°/。、丙酮體積含量為 45%和曱醇體積含量為40%。
本發明固定液也可用其他能夠使精子蛋白質變性并保持精子形 態結構不變的物質代替。
5.洗滌液
洗滌液用于在檢測透明帶誘發精子頂體反應時洗滌載玻片，以去 除固定液和未結合的熒光素-凝集素標記物，減少非特異性熒光。
本發明濃縮洗滌液為含Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBS)。所述濃 縮洗滌液的NaCl重量含量為0.5-1.5%、 KH2P04重量含量為 0.21-0.82°/。、 Na2HPCV12H20重量含量為1.63-6.52%、 NaN3重量含量 為0.05-0.20%和Tween-20體積含量為0.5-2.0%,余量為蒸餾水。
如下配制本發明濃縮洗滌液稱取NaCl 5.0-15.0 g、 KH2P04
2.1- 8.2 g、 Na2HP04'12H20 16.3-65.2 g和NaN3 0.5-2.0 g置燒杯中，加 蒸餾水900 ml，攪拌溶解；加入Tween-20 5-20 ml，混勻；調pH至
7.2- 7.6，加蒸餾水至1000ml， 4TM呆存。
優選每1000 ml本發明濃縮洗滌液包含NaCl 10.0 g、 KH2P04 4.2 g、 Na2HP04*12H20 32.6 g、 NaN3 1.0 g和Tween-20 10 ml, pH為7.4。 臨用前，以蒸餾水稀釋上述濃縮洗滌液20倍，4""C貯存備用。 所述NaN3還可用其他防腐劑代替，而且防腐劑的含量也可為其 他值，只要能抑制細胞生長且對反應無影響即可；所述Tween-20還 可用其他表面活性劑代替，只要能去除非特異性反應物且對檢測結果 無影響即可；所述PBS還可用其他緩沖物質代替，而且PBS的含量 也可為其他值，只要能夠確保洗滌液的pH值為7.2-7.6即可，含量的多少基本不會影響透明帶誘發精子頂體反應的檢測結果。
6.熒光素-凝集素標記物
熒光素-凝集素標記物用于與精子頂體區發生結合反應從而指示 是否發生了頂體反應。
本發明熒光素-凝集素標記物中的熒光素為異硫氰酸熒光素、四 曱基異硫氰酸若丹明或這兩種熒光染料的代用品，凝集素為刀豆蛋白
A、豌豆凝集素或花生凝集素。臨用前將所述熒光素-凝集素標記物加 入到Tris-HCl緩沖液中，標記物的加入量視不同標記物的不同活性而 有所變化。
Tris-HCl緩沖液的Tris重量含量為1.2-4.8%、 NaCl重量含量為 0.4-1.6%、 BSA重量含量為0.1-0.5。/。和NaN3重量含量為0.01-0.05%,
余量為蒸餾水。
如下配制本發明熒光素-凝集素標記物稱取Tris 1.2-4.8 g、 NaCl 0.4-1.6 g、 BSA 0.1-0.5 g、 NaN3 0.01-0.05g，溶于80毫升蒸餾水中， 攪拌溶解；用1 mol/L HC1調pH至7.0-7.8,用蒸餾水定容至100毫 升，置4。C保存；在上述溶液中加入熒光素-凝集素標記物。
優選每100 ml所述Tris-HCl緩沖液包含Tris 2.4 g、 NaCl 0.8 g、 BSA 0.2 g和NaN3 0.02g， pH為7.5。
所述NaN3還可用其他防腐劑代替，而且防腐劑的含量也可為其 他值，只要能抑制細胞生長且對反應無影響即可；所述Tris還可用其 他緩沖物質代替，而且Tris的含量也可為其他值，只要能夠確保 Tris-HCl緩沖液的pH值為7.0-7.8即可，含量的多少基本不會影響熒 光素-凝集素標記物與精子頂體區發生結合反應。
三體外檢測精子-卵母細胞相互作用 1、上泳法收集高活力精子，提取方法如下 (1)于試管底部加入精液1 ml，輕輕在試管精液上層加入1.5 ml 培養液(培養液:精液=1.5:1 (體積))。(2) 輕輕地將試管置于傾斜45度角的試管架上，置37°C 、 5% C02 培養箱中孵育1小時。
(3) 小心吸取最上層1 ml培養液。
(4) 500g離心5分鐘。
(5) 吸走精子沉淀團上方的培養液。
(6) 力口入0.2ml培養液。
2. 在細胞培養皿中加入1 ml培養液、3-6個卵母細胞和約2xl06 個提取后的高活力精子。在另一細胞培養亞中加入l ml培養液和約 2xl(^個提取后的高活力精子作為"透明帶誘發精子頂體反應"空白 對照。
3. 置于C02培養箱(37。C、 5。/。C02)中孵育2小時。
4. 在倒置相差顯微鏡下以200-400 fim內徑吸管將反應后的卵母 細胞轉移至另 一盛有培養液的細胞培養亞中，反復吹打卵母細胞以去 除未與卵母細胞結合的精子，然后轉移精子-卵母細胞結合物至另一 盛有培養液的細胞培養mi中。
5. 將洗滌后的卵母細胞置于倒置相差顯微鏡下，計數與透明帶 結合的精子數量，并依據下式計算每個卵母細胞透明帶結合的精子的 平均數
每個卵母細胞透明帶結合的精子的平均數=與卵母細胞結合的 精子總數+卵母細胞個數
此即"精子-透明帶結合試驗，，結果。
觀察到4個卵母細胞透明帶共結合精子160個，則每個卵母細胞 透明帶結合的精子的平均數=160 + 4=40個/透明帶。
6. 將所有精子-卵母細胞結合物移入約10 pl的孩￡滴內，在倒置相 差顯微鏡下以100-200 (im內徑吸管反復吹打以去除與卵母細胞透明 帶表面結合的精子，然后將卵母細胞轉移至另一盛有培養液的細胞培
養JD1中。
7. 將步驟6處理過的精子懸液和空白對照精子加到載玻片上，在一定范圍內(12-40 mm勺均勻涂片。
8. 載玻片自然干燥后加入固定液室溫覆蓋30分鐘，用洗滌液洗 滌載玻片3次，每次2分鐘。
9. 在載玻片上覆蓋熒光素-凝集素標記物，溫室反應1-2小時； 用洗滌液洗滌載玻片3次，每次2分鐘；然后吹干或自然干燥。
10. 蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下至少計數200個精子觀察精 子頂體反應率
精子頂體反應率(°/。)=(發生頂體反應的精子總數+被觀察精子總 數)x 100%-空白對照精子反應率(°/。)
此即"透明帶誘發精子頂體反應試驗，，結果。
計數透明帶誘發精子300個，其中已發生頂體反應的精子數72個； 計數空白對照精子300個，其中已自動發生頂體反應的精子數18個； 則精子頂體反應率(％)=(72 + 300) x 100% - (18 + 300) x 100%=18%。
11. 將步驟6處理過的卵母細胞置于倒置相差顯微鏡下，計數頭 部已穿透進入卵母細胞的精子數量，并依據下式計算每個卵母細胞中 穿透精子的平均數
每個卵母細胞中穿透精子的平均數-穿入卯母細胞的精子個數 +卵母細胞個數
此即"精子-透明帶穿透試驗"結果。
觀察到共計20個精子頭部穿透進入4個卵母細胞，則每個卵母 細胞中穿透精子的平均數=20 + 4=5個。
其中可任選在上述方法步驟9之后載玻片臨用前，在載玻片上滴 加l滴熒光封固液，然后蓋上蓋玻片，并置于熒光顯《鼓鏡下至少計數 200個精子觀察精子頂體反生率。
目前認為每個卯母細胞透明帶結合的精子的平均數《40個/透明 帶，透明帶誘發精子頂體反應率<16%，將嚴重影響精子與卵母細胞 自然受精，從而導致不育，是采取經胞漿內精子注射(ICSI)輔助生殖 的適應癥措標。精子-透明帶穿透試驗結果與透明帶誘發精子頂體反應率具有良好的相關性，當透明帶誘發精子頂體反應率<10%時，幾
乎沒有精子可以穿透透明帶；當透明帶誘發精子頂體反應率< 16 %時， 精子穿透透明帶的機率<20% 。
1權利要求
1. 一種體外檢測精子-卵母細胞相互作用的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟a. 上泳法或密度梯度法提取精子；b. 在培養液中按一定比例混合經步驟a提取后的精子與卵母細胞，另設立卵母細胞空白對照，并均置于培養箱中反應；c. 去除步驟b中未與卵母細胞表面結合的精子，倒置相差顯微鏡下檢測與卵母細胞透明帶結合的精子數量；d. 使步驟c中與卵母細胞透明帶結合的精子和卵母細胞分離，分別收集分離后的精子和卵母細胞；e. 將卵母細胞空白對照精子、經步驟d分離后的精子涂于載玻片上，干燥，固定液固定，洗滌，加入熒光素-凝集素標記物，反應后再次洗滌，熒光顯微鏡下檢測精子頂體反應率；f. 倒置相差顯微鏡下檢測經步驟d分離的卵母細胞胞內已穿透進入其中的精子數量。
2. 權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟c中通過 以下方法去除步驟b中未與卵母細胞表面結合的精子將反應后的卵 母細胞轉移至另一盛有培養液的細胞培養亞中，反復吹打卵母細胞， 然后轉移精子-卵母細胞結合物至另一盛有培養液的細胞培養皿中。
3. 權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟d中通 過以下方法使步驟c中與卵母細胞透明帶結合的精子和卵母細胞分 離將精子-卵母細胞結合物移入微滴中，反復吹打卵母細胞，然后 將卵母細胞轉移至另 一盛有培養液的細胞培養亞中。
4. 權利要求l、 2或3所述的方法，其特征在于，其中所述培養 液的NaCl重量含量為0.28-1.11%、 KC1重量含量為0.02-0.07%、 CaCl2'2H20重量含量為0.01-0.05%、 KH2P04重量含量為0.01-0.03%、 MgS04.7H20重量含量為 0.01-0.06% 、 酚紅重量含量為.0.0005-0.003%。、 NaHC03重量含量為0.10-0.42%、葡萄糖重量含量為 0.05-0.20%、焦丙酮酸鈉重量含量為0.015-0.060%。、 BSA重量含量為 0.17-0.70%、青霉素的含量為10000-20000單位％、碌u酸鏈霉素重量 含量為0.05-0.50%。和乳酸鈉糖漿(600 g/L)體積含量為0.18-0.74%,余量為蒸餾水。
5. 權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟b中的 卵母細胞可以是新鮮卵母細胞或者是保存在卵細胞保存液中的卵母 細胞，其中所述卵細胞保存液的(NH4)2S04重量含量為6.6-26.4%和 Tris重量含量為0.12-0.48%,余量為蒸餾水，其pH值為7.0-7.8。
6. 權利要求1所述的方法，其特征在于，其中可在步驟e中熒光 顯微鏡下計數精子頂體反應率之前加入熒光封固液。
7. 權利要求6所述的方法，其特征在于，其中所述熒光封固液 是含對苯二胺的^#酸鹽緩沖液，其pH值為7.5-9.0。
8. 權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟e中固定 液是多聚曱醛、丙酮和曱醇的混合液。
9. 權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟e中洗滌 所使用的洗滌液是含Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.2-7.6。
10. 權利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步驟e中熒 光素-凝集素標記物中的熒光素為異硫氰酸熒光素FITC或四曱基異 硫氰酸若丹明TRITC,凝集素為刀豆蛋白A、豌豆凝集素或花生凝集 素。
全文摘要
一種體外檢測精子-卵母細胞相互作用的方法，包括a.上泳法或密度梯度法提取精子；b.在培養液中按一定比例混合經步驟a提取后的精子與卵母細胞，另設立卵母細胞空白對照，并均置于培養箱中反應；c.去除步驟b中未與卵母細胞表面結合的精子，倒置相差顯微鏡下檢測與卵母細胞透明帶結合的精子數量；d.使步驟c中與卵母細胞透明帶結合的精子和卵母細胞分離，分別收集分離后的精子和卵母細胞；e.將卵母細胞空白對照精子、經步驟d分離后的精子涂于載玻片上，干燥，固定液固定，洗滌，加入熒光素-凝集素標記物，反應后再次洗滌，熒光顯微鏡下檢測精子頂體反應率；f.倒置相差顯微鏡下檢測經步驟d分離的卵母細胞胞內已穿透進入其中的精子數量。所述方法減少了標本資源的消耗，降低了檢測成本和檢測時間，提高了檢測效率。
文檔編號G01N33/48GK101482555SQ200910104998
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月13日 優先權日2009年1月13日
發明者瑜 劉 申請人:瑜 劉