來自苛求芽孢桿菌的兩種尿酸酶和其突變體及它們的聚乙二醇修飾與應用的制作方法

專利名稱：來自苛求芽孢桿菌的兩種尿酸酶和其突變體及它們的聚乙二醇修飾與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及苛求芽孢桿菌胞內和胞外兩種可溶天然單純蛋白質同四聚體尿酸酶， 及這兩種天然尿酸酶的突變體和它們的聚乙二醇單甲醚修飾產物，這些尿酸酶和其聚乙二 醇單甲醚修飾產物在臨床檢驗測定血清尿酸含量和降低哺乳動物體內的血漿尿酸水平中 的應用。發明的
背景技術：
尿酸酶可特異性氧化尿酸，并生成尿囊素和過氧化氫。人體缺乏尿酸酶，尿酸是體 內嘌呤堿代謝終產物，主要經腎臟排泄。血漿中尿酸濃度過高稱為高尿酸血癥。尿酸在血 漿中的溶解度低，濃度過高會在血管壁沉積，誘發組織器官損傷和引起痛風等疾病，嚴重時 造成腎衰，危及生命。故血清尿酸水平是診斷痛風和腎臟功能的常規指標，而尿酸酶是實驗 診斷領域測定血清尿酸含量的關鍵工具酶。尿酸的前體黃嘌呤是尿酸酶的強效競爭性抑制 劑，而血漿高尿酸通常伴隨血漿高黃嘌呤。因此，需要抗黃嘌呤且催化效率高的尿酸酶。在白血病、淋巴瘤等血液腫瘤化療時腫瘤細胞大量死亡裂解，胞內核酸大量降 解造成血漿尿酸急劇升高，形成以高尿酸血癥為代表的腫瘤溶解綜合癥(tumor lysis syndromeJLS)，容易造成患者腎衰而死亡。所以，在腫瘤化療過程中，需快預防和速降低血 漿尿酸應對TLS。另外，降尿酸也是治療痛風的關鍵策略；別嘌呤醇等藥物都有明顯肝腎毒 性易引起過敏反應，在初始尿酸濃度很高時無效且對某些難治性痛風無效。尿囊素的優良 水溶性和腎臟對尿囊素的高效排泄使尿酸酶成為治療高尿酸血癥相關疾病的候選藥物。臨 床研究表明尿酸酶可快速高效降低血清尿酸，且幾乎沒有毒副作用；在應對腫瘤裂解綜合 癥時尿酸酶比別嘌呤醇更安全有效；尿酸酶可用于治療痛風，給予一次尿酸酶后嚴重痛風 患者血漿尿酸水平可長時間維持正常。因此，抗黃嘌呤、催化效力高的尿酸酶也是治療高尿 酸血癥相關疾病的理想藥物。已報道苛求芽孢桿菌可產生胞內和分泌到胞外的兩種尿酸酶，但至今未明確此兩 種尿酸酶的編碼基因和對應的氨基酸序列。實驗數據已證實苛求芽孢桿菌胞外尿酸酶和胞 內尿酸的催化能力都很高，且抗黃嘌呤，在治療高尿酸血癥和血清尿酸測定兩方面都可有 重要應用。苛求芽孢桿菌的天然胞內和胞外尿酸酶都可直接用于尿酸含量測定。外源尿酸 酶用于治療高尿酸血癥相關疾病時都需將其注射到血液中才能發揮作用。異源蛋白在人體 內半衰期短且易誘發機體免疫反應。用聚乙二醇單甲醚修飾蛋白是延長其體內半衰期、降 低其免疫原性的有效方法。常用的聚乙二醇單甲醚修飾試劑與蛋白質表面氨基或巰基反 應。對來自苛求芽孢桿菌的胞內和胞外尿酸酶及其突變體也可用活化聚乙二醇單甲醚修飾 其表面的氨基或巰基，從而延長其體內半衰期并降低此外源蛋白的免疫原性，保障用藥的 安全性。所以，本發明涉及來自苛求芽孢桿菌的兩種天然尿酸酶及其對應突變體和聚乙二 醇單甲醚修飾產物，及它們在血清尿酸測定和應對哺乳動物高尿酸血癥相關疾病等方面的 應用。
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發明概述本發明提供來自苛求芽孢桿菌兩種可溶性尿酸酶的氨基酸序列和編碼它們的 cDNA序列及對兩種酶蛋白和其突變體，及這些尿酸酶用聚乙二醇單甲醚進行修飾的方式和 這些對應尿酸酶的應用。同時，本發明還提供進行重組表達獲得所需要尿酸酶和其突變體 的途徑，及對此苛求芽孢桿菌尿酸酶表面的氨基用聚乙二醇單甲醚修飾或將特定位點的中 性氨基酸殘基突變成半胱氨酸后對其巰基進行選擇性修飾的方式。本發明所述來自苛求芽孢桿菌的兩種天然尿酸酶都可直接用于臨床檢驗測定血 清尿酸含量；重組表達的此類尿酸酶和其突變體在其N端或C端帶有連續的六個組氨酸殘 基可作為標簽用于親和純化；來自苛求芽孢桿菌的兩種天然尿酸酶和這些尿酸酶的突變體 重組表達產物都可用于動力學方法或者終點平衡法測定血清尿酸。用N-羥基琥珀酰亞胺酯活化的分子量在2000DaltOn及以上的聚乙二醇單甲醚可在堿性條件下修飾本發明所述的天然尿酸酶或重組表達突變體酶蛋白表面的氨基；如是帶 有特定位置發生定點突變所生成的半胱氨酸殘基的重組表達突變體尿酸酶，就可用聚乙二 醇單甲醚的碘乙酸酯或溴乙酸酯修飾這些巰基從而實現位點特異性修飾。用上述聚乙二醇 單甲醚修飾后的這些尿酸酶及其突變體都可用于治療和預防哺乳動物，尤其是靈長類動物 高尿酸血癥相關的疾病，包括腫瘤溶解綜合癥和痛風等；在應用中單次給藥后體內尿酸在 較長時間內可維持在正常水平，從而有效緩解和預防高尿酸血癥相關的疾病。應用實施例實施例1 血清尿酸測定本實施例說明此尿酸酶在直接動力學方法測定血清尿酸中的應用。尿酸酶活性用 75μΜ尿酸在25°C的硼酸鈉緩沖液(pH 9. 2)中測定，每分鐘氧化一微摩爾尿酸的酶量為一 個單位。(1).反應體系含15μ 1血清，5μ 1重組表達的胞內尿酸酶(>6U/mg，如未聲明則 其濃度大于6. OU/ml，在反應體系的終濃度大于0. 0025U/ml)和pH9. 2的硼酸鈉緩沖液共 1. 20ml ο(2).測定加入尿酸酶啟動反應前體系在293nm的吸收，校正加入酶液的體積效應 (0.3% )和酶制劑吸收(低于0. 004)得酶作用前吸收(AO)。(3).將加入酶后的混合物在石英比色杯內混勻，在加酶30秒后以10到30秒間隔 監測293nm吸收在5min內的變化(最大吸收低于1. 270)，代表性反應曲線如附圖1。(4).尿酸消光系數固定為11. 5(mmol -Γ1 κπιΓ1，米氏常數(Km)固定為0. 22mmol/ L (如用來自苛求芽孢桿菌尿酸酶的突變體則需要實驗測定其米氏常數)，用以反應時間為 自變量的積分速度方程擬合反應曲線(見附圖1)預測本底(Ab)。Atl和Ab之差，S卩ΔΑ，代 表反應體系中尿酸的吸收(詳細數據處理方法見中國發明專利專利ZL03135649. 4)。實施例2 重組表達苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶的聚乙二醇單甲醚5000修飾用分子量為5000的聚乙二醇單甲醚修飾苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶重組表達產物 是其用于哺乳動物體內降低血漿尿酸水平的前提，修飾其氨基的代表性操作過程如下(1).在25°C的0. IM硼酸鈉緩沖液中(pH 9. 2)用75. 0 μ M尿酸測定尿酸酶活性。(2).將序列5對應苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶重組表達，Ni-NTA柱親和層析純化到 10. OU/mg以上，凍干濃縮到6. Omg/ml后對含有0. IM硼酸鈉的緩沖液透析12小時，每4小時更換一次透析外液，直到用2，4，6_三硝基苯磺酸或熒光胺測定無明顯的小分子氨基化 合物為止。(2).用分子量為5000的聚乙二醇單甲醚和丁二酸酐生成其羧基衍生物，純化后 與N-羥基琥珀酰亞胺用二環己基碳二亞胺脫水生成對應的N-羥基琥珀酰亞胺酯，純化產 物。(3).測定透析后無氨基化合物的重組胞內尿酸酶的蛋白濃度，按編碼序列對應分 子量計算其所含氨基數量，按照摩爾當量比值遞增方式逐步增加N-羥基琥珀酰亞胺酯活 化的聚乙二醇單甲醚5000量，然后在pH9. 0的硼酸鈉緩沖液中混勻，室溫反應3小時后取 樣測定剩余的尿酸酶活性；反應體系活化聚乙二醇單甲醚5000量對修飾后剩余酶活性的 影響如附圖2。(4).將聚乙二醇單甲醚修飾的此重組表達胞內尿酸酶對生理鹽水多次換液透析 后備用。實施例3 離體人血漿中聚乙二醇單甲醚修飾重組苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶的降 尿酸作用用離體血漿中的降尿酸活性表征聚乙二醇單甲醚修飾的重組苛求芽孢桿菌胞內 尿酸酶的降尿酸活性比用氧嗪酸抑制內源性尿酸酶的動物灌胃給尿酸后測定的降尿酸活 性更可靠，因為消除了所用氧嗪酸對藥用聚乙二醇單甲醚修飾尿酸酶抑制作用的干擾。(1).通過跟蹤293nm吸收變化檢測反應進程，在25°C硼酸鈉緩沖液(pH 9. 2)測 定其氧化75 y M尿酸的初速度表示活性，每分鐘氧化一微摩爾尿酸的酶活性為一個單位。(2).將聚乙二醇單甲醚修飾重組苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶對生理鹽水換液透析， 用0. 22 y m的微孔濾膜除菌后備用。(3).來自血液中心的健康個體血漿，加入固體尿酸粉末到終濃度高于0. 40mM以 上，加入體積比例小于2%而終濃度為16U/L的聚乙二醇單甲醚修飾重組苛求芽孢桿菌胞 內尿酸酶，在指定時間取樣0. 20ml，迅速加入20iU濃度為55%的高氯酸混勻終止尿酸酶作用。(4).在上述終止反應的樣品中加入在25 °C飽和的碳酸鉀溶液20 u 1使得體系的 PH高于7. 0，劇烈震蕩混勻后2000g離心10分鐘后取上清液為待測樣品，按照應用實施例 1中所述測定殘余尿酸的含量；所得血漿尿酸水平隨著時間變化的代表性結果如附圖3。(5).在血漿中加入0. 30mM黃嘌呤考察其對降尿酸效力表明此尿酸酶明確抗黃嘌 呤。實施例4 聚乙二醇單甲醚修飾的重組苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶在大鼠體內的變 化。未經過聚乙二醇單甲醚修飾的重組苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶在哺乳動物體內2 小時內活性降低到10%以下；而經過聚乙二醇單甲醚修飾的重組苛求芽孢桿菌胞內尿酸 酶在哺乳動物體內血漿中活性衰減速度明顯減慢。(1).在25°C硼酸鈉緩沖液(pH 9. 2)測定其氧化75 y M尿酸的初速度表示活性， 每分鐘氧化一微摩爾尿酸的酶活性為一個單位。(2).將聚乙二醇單甲醚修飾重組苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶對生理鹽水換液透析， 用0. 22 y m的微孔濾膜除菌后備用。
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(3).將成年的健康大鼠乙醚麻醉，尾靜脈注射滅菌的聚乙二醇單甲醚修飾重組苛 求芽孢桿菌胞內尿酸酶0. 60U總量(0. 25ml)。(4).在注射尿酸酶之前、之后指定時間眼球取血，肝素鈉抗凝制備血漿，測定血漿 中的尿酸酶活性變化，代表性的結果如附圖4。


圖1.重組苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶測定血清尿酸含量的反應進程。圖2.重組苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶用N-羥基琥珀酰亞胺酯活化聚乙二醇單甲醚 5000修飾后的剩余活性隨所用活化聚乙二醇單甲醚對氨基當量比值的變化。圖3.離體人血漿中尿酸在聚乙二醇單甲醚5000修飾重組苛求芽孢桿菌胞內尿酸 酶作用下的衰減曲線。圖4.重組苛求芽孢桿菌胞內尿酸酶經聚乙二醇單甲醚5000修飾后在大鼠體內活 性衰減過程。氨基酸和編碼區DNA序列表
<110> 重慶醫科大學
<120>來自苛求芽孢桿菌的兩種尿酸酶和其突變體及它們的聚乙二醇修飾與應用
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1權利要求
兩種尿酸酶蛋白，所述這兩種尿酸酶蛋白中天然酶蛋白都是來自苛求芽孢桿菌的同四聚體單純蛋白質，都可用分子氧催化尿酸氧化并生成過氧化氫。
2.按照權利要求1所述的兩種尿酸酶，其包括從苛求芽孢桿菌胞內和胞外蛋白中純化 的且具有序列1和序列3的氨基酸序列的可溶天然尿酸酶，及這兩種天然尿酸酶蛋白N端 前七個氨基酸殘基中有部分殘基被替換或缺失的突變體、或前述兩種天然尿酸酶蛋白C端 缺失不多余14個殘基的突變體、或前述兩種天然尿酸酶蛋白中N端前七個氨基酸殘基被替 換或缺失且同時C端缺失不多于14個氨基酸殘基的突變體、或在兩種天然尿酸酶的N端前 七個氨基酸殘基中存在替換且N端朝前延伸了不多于十個中性側鏈氨基酸殘基的突變體、 或在兩種天然尿酸酶的N端前七個氨基酸殘基中存在替換且N端朝前延伸了不多于十個中 性側鏈氨基酸殘基同時C端缺失不多于十四個氨基酸殘基的突變體，及這些尿酸酶和其突 變體的聚乙二醇單甲醚修飾產物。
3.按照權利要求2所述的兩種尿酸酶，可從苛求芽孢桿菌胞內或分泌到胞外的可溶蛋 白中純化，對應天然尿酸酶蛋白同四聚體每個亞基含有332個氨基酸，其氨基酸序列分別 為序列表中的序列1和序列3 ；對應的尿酸酶蛋白突變體可通過基因重組后原核表達獲得， 在重組表達時可在C端或N端再添加五個到七個連續組氨酸殘基作為親和層析純化的標 簽，對應尿酸酶蛋白同四聚體的每個亞基含305到360個氨基酸殘基；這兩種尿酸酶及其突 變體的等電點都在4. 0到6. 5之間。
4.按照權利要求2和權利要求3所述的兩種尿酸酶，可通過基因重組表達獲得對應 尿酸酶蛋白突變體，且這些尿酸酶蛋白突變體中部分位置的中性側鏈氨基酸殘基可突變成 半胱氨酸殘基以便用溴乙酰或碘乙酰活化的聚乙二醇單甲醚進行修飾，這些可突變成半胱 氨酸殘基的中性氨基酸殘基包括序列1中16、52、55、81、101、131、156、163、174、187、233、 237、254、263所對應絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等殘基中的任一個或任意多個的 組合，及序列3中對應位置的殘基。
5.按照權利要求2和權利要求3和權利要求4所述兩種尿酸酶蛋白具有以下特征A、來自苛求芽孢桿菌胞內可溶蛋白的天然尿酸酶氨基酸排序如序列1；其N端前七個 氨基酸殘基可被替換或截短仍保留尿酸酶活性，但N端的前七個氨基酸殘基被截短后突變 體尿酸酶的活性會下降；N端可朝前延伸不多于十個中性側鏈氨基酸殘基并可再包含用于 親和純化的連續組氨酸殘基標簽序列；序列1中的第144位氨基酸殘基可以是丙氨酸且仍 保留活性。B、來自苛求芽孢桿菌分泌到胞外的可溶尿酸酶氨基酸排序如序列3，其N端對應的前 七個氨基酸殘基與序列1的N端殘基不同而其余氨基酸序列全部相同，可突變成半胱氨酸 的中性側鏈氨基酸殘基位置和組合方式也與胞內尿酸酶相同；序列3中的第144位氨基酸 殘基可以是丙氨酸且仍保留活性。C、來自苛求芽孢桿菌胞內和分泌到胞外的兩種天然尿酸酶催化能力相當；兩種天然尿 酸酶對黃嘌呤的敏感性相當且都比常見真核尿酸酶敏感性低得多；兩種天然尿酸酶突變體 對底物尿酸的親和力較低，對尿酸的米氏常數在0. 10mmol/L以上；兩種天然尿酸酶對水透 析都會解聚成二聚體而失活，但用高離子強度的緩沖液處理時對水透析失活的這兩種天然 尿酸酶的大部分活性都可恢復。D、這兩種天然尿酸酶和其突變體都可在大腸桿菌中重組表達，并可用N-羥基琥珀酰亞胺活化的平均分子量不低于2000DaltOn的聚乙二醇單甲醚在堿性條件下修飾其氨基， 修飾后可保留45%以上的催化活性；也可用碘乙酰或溴乙酰活化的聚乙二醇單甲醚修飾 突變所得半胱氨酸殘基，并保留更高的比活性。E、這兩種天然尿酸酶及其突變體經平均分子量不低于2000DaltOn的聚乙二醇單甲醚 修飾后，在哺乳動物血漿中可有效降低血漿尿酸，且在動物體內10小時內活性可保留30% 以上；但未經聚乙二醇單甲醚的兩種天然尿酸酶或它們的突變體在大鼠體內2小時內活性 就降到10%以下。
6.這兩種天然尿酸酶及其各種突變體可直接用于終點平衡法測定反應前和反應完成 后293nm紫外吸收之差確定反應體系的底物尿酸含量，或與過氧化物酶聯合用于間接終點 平衡法測定對應于過氧化氫的有色產物量間接確定反應體系的尿酸含量；也可用于動力學 方法預測尿酸酶反應體系本底快速測定反應體系的底物尿酸含量，這種方法的數據處理可 采用中國發明專利ZL03135649. 4所要求的專屬方法。
7.這兩種天然尿酸酶及其突變體經聚乙二醇單甲醚修飾后都可用于預防和治療人體 的高尿酸血癥相關疾病，包括痛風及淋巴瘤、白血病等化療時導致的腫瘤溶解綜合癥；這兩 種天然尿酸酶及其突變體用于降低人體血漿尿酸的應用方式包括靜脈注射到血液和在血 液體外透析時使用；經靜脈注射到血漿中發揮作用時這些天然尿酸酶及其突變體經聚乙二 醇單甲醚修飾封閉抗原決定簇和延長其體內半衰期；這兩種尿酸酶及其突變體也可在血 液透析治療時在體外使用降低血漿尿酸水平，對應這種應用方式所用這兩種天然尿酸酶及 其突變體可不經過聚乙二醇單甲醚修飾，且這種使用方式也不限于本發明所述的各種尿酸 酶。
全文摘要
來自苛求芽孢桿菌的兩種尿酸酶和其突變體及它們的聚乙二醇修飾與應用；具體涉及來自苛求芽孢桿菌胞內和胞外的兩種天然尿酸酶的同四聚體及它們各自的氨基酸序列，及這兩種尿酸酶的N端前七個氨基酸缺失或被替換的突變體、C端缺失不多于十四個氨基酸殘基的突變體和同時出現上述兩類變化的突變體；這兩種天然尿酸酶都抗黃嘌呤且對尿酸親和力較低，在離子強度低時會解聚而失去活性；這些天然尿酸酶和其突變體都可在N端或C端帶組氨酸純化標簽后用大腸桿菌進行重組表達，都可用于測定血清尿酸含量，都可用平均分子量不低于2000的聚乙二醇單甲醚修飾后保留大部分比活性，從而可用于哺乳動物體內降低血漿尿酸水平治療高尿酸血癥相關疾病。
文檔編號G01N21/33GK101875922SQ20091010374
公開日2010年11月3日 申請日期2009年4月30日 優先權日2009年4月30日
發明者馮娟, 卜友泉, 廖飛, 張純, 李想, 楊曉蘭, 謝燕玲, 趙運勝 申請人:重慶醫科大學