專利名稱：一種注射劑中致熱物質含量的全熱原檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種生物醫藥檢測技術，特別涉及一種注射劑中致熱 物質含量的全熱原檢測方法。
背景技術：
自ioo多年前出現注射用藥至今，非腸道使用醫用制品中的熱原
對人體的危害即熱原反應已經為人所共知，臨床上主要表現為如下癥狀發熱、 寒顫、惡心、嘔吐、頭痛、腰及關節痛，膚色灰白，白細胞下降，血管通透性 增強，嚴重者造成昏迷甚至休克、死亡。因此，凡是非腸道使用制品包括藥品、 生物制品和醫療器械裝置都應進行熱原檢査，有效地對其熱原進行控制和檢查 是臨床上安全使用的重要保證。
熱原是指能夠導致機體發熱的物質，主要分為內源性和外源性兩大類。發熱 機理是外源性熱原通過刺激哺乳動物體內的免疫細胞分泌細胞因子產生內源性 熱原，從而引起機體發熱。熱原檢測的目的主要是對外源性的熱原進行總量控 制，使其對機體不產生危害性的影響。
目前的熱原檢測方法主要有家兔檢查法、細菌內毒素檢査法和體外熱原實驗
法。其中前兩種方法已經收錄進入了 2005版《中國藥典》，是國家法定的檢測 方法。
家兔檢査法的優點是能夠真實反映外源性熱原引起哺乳動物復雜升溫反應
過程，用于評價藥品中總的致熱物質。其缺點是(1)由于我國目前的家兔繁 育、詞養管理等一系列問題，使得家兔種屬差異和個體差異較大，造成重復性 較差，而且家兔和人發熱的情況并不完全一致；(2)靈敏度低，容易造成檢測 結果的假陰性；(3)對某些能影響家兔正常生理尤其是體溫的制品如細胞因子、 病毒制品、抗生素、致瀉藥、某些鎮靜劑、止痛劑、胞質蛋右和放射性藥物等也不可能進行正常檢測；(4)試驗費用及日常維護成本較高，且檢測時間長(一 般為5個小時)，特別是當熱原含量嚴重超標而出現毒性時，家兔體溫下降，也 不能正確反映結果。現目前全部中藥注射劑、生物制品類注射劑及部分對細菌 內毒素檢査有干擾的化學注射藥品采用的是家兔檢查法。
細菌內毒素檢査法是以節肢動物鱟的血細胞溶解物與微量細菌內毒素產生 凝集反應為基礎的。自1968年由Liven和Bang建立了細菌內毒素檢查法以來， 在大部分的注射化學藥品和抗生素藥品中應用廣泛。其優點是快速、簡便、可 定量、可標準化、相對兔法而言檢測費用較低。缺點主要是(1)該方法只能 特異性地檢查革蘭氏陰性菌的內毒素，對其他熱原質表現為陰性，且易受到多 種物質的干擾，不能完全反映藥品中所含的熱原物質；(2)細菌內毒素檢査法 不能完全反映哺乳動物對熱原的反應過程，因為來自不同細菌的內毒素對哺乳 動物致熱活性差別很大，從沒有致熱性到有很強的致熱性，這種差異與其凝集 活性的差異沒有相關性，故該法實際能夠檢測到的僅僅是內毒素對鱟血細胞的 凝集活性，而不是內毒素對人體的發熱活性或化學概念上的含量；(3)該方法 對一些酶抑制劑、鈣鎂離子鰲合劑和多聚核苷酸和中藥注射劑等很難進行檢測； (4)研究發現，某些生物制品和抗生素與內毒素之間還存在協同作用，而這種 協同作用是細菌內毒素檢査法無法檢測到的；(5)該法是檢測內毒素的靈敏方 法，其應用的前提是必須確定藥品內的熱原物質主要是內毒素，其他致熱物質 如抗原或半抗原性不是主要致熱物質，并需排除干擾和協同發熱的可能，而我 們都知道藥品中的熱原的種類繁多，而內毒素只是熱原中的一類，現在為了細 菌內毒素的檢測的方便而人為地將內毒素等同于熱原來看待；(6)鱟作為一種 遠古生物，因不合理利用使其瀕臨滅絕，現目前也急需尋找能完全替代它的檢 測方法。體外熱原實驗法(IPT法)是利用內毒素可誘導人血細胞釋放細胞因子這一
原理，采用ELISA方法測定新鮮或冷藏的人全血中IL-1、 IL-6、 TNF、 PG-E2、 干擾素等的釋放量來檢測外源性熱原。該法尚停留在實驗室階段，并未在國際 間廣泛應用，其優點是以人體的發熱機理進行熱原檢測，它消除了種屬差異造
成的結果不準確性，并能夠檢測至今為止所知的各主要發熱物質。其缺點是(1) 現目前對各熱原的致熱活性以及它們之間的相互關系還沒有完全明晰的認識； (2)在實際工作中，外熱原進入血液后可能導致多種因子的不均衡釋放，檢測 單一的因子能否代表其完全的致熱活性還有待進一步地研究評價；(3)試驗中 使用的試劑、培養基、血清等如何去除熱原的問題，以及不同試驗室之間和同 一實驗室不同時間的細胞存在著差異；(4)除了細菌內毒素外，其他的致熱物 質還沒有標準品，對人的致熱閾也不清楚，其限值不易確定；(5)具有內在致 內熱原分泌或抑制的物質不適合用該法檢測；(6)由于釆用的檢測細胞各有優 缺點，存在著人體對熱原敏感度的差異，故采用的檢測指標還沒有完全肯定、 統一。而這些缺點也限制了體外熱原實驗法的推廣應用，至今還沒有被任何一 國藥典正式收載，所以該法還不是一種法定的熱原檢測方法
發明內容
本發明的目的就是針對現有技術的不足，提供一種注射劑中致熱
物質含量的全熱原檢測方法。它的檢測原理是只要當熱原物質刺激人體免疫細
胞時就會產生熱原反應，同時必然會伴隨發熱。而根據氧熱等量原理，發熱是
必須要耗氧的，所以我們可以通過檢測耗氧量的變化程度來間接測定熱原物質
的含量。它的作用原理不同于以往的任何一種熱原檢測方法，可適用于所有熱
原物質的檢測。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案
6一種注射劑中致熱物質含量的全熱原檢測方法，其特征在于包括以下步驟:
a) 、制備人全血試驗液
將采集而來的體外人全血經過阿氏液作抗凝處理后，再將經過阿氏液作抗
凝處理后的體外人全血用生理鹽水0.9%氯化鈉注射液稀釋成為體積比濃度為2
%V/V，的人全血試驗液；
b) 、將細菌內毒素工作標準品用生理鹽水0. 9%氯化鈉注射液稀釋后進行線 性考察，做出標準曲線
將細菌內毒素工作標準品用生理鹽水O. 9%氯化鈉注射液稀釋成100EU/ml、 10EU/ml、 lEU/ml、 0. lEU/ml、 0.01EU/ml，分別取各級稀釋液0. lml和步驟a 中的人全血試驗液1. 5ml到耗氧測定儀的呼吸室內，呼吸室溫度恒定在37. 5± o.rc，混勻速度控制為80轉/分鐘，待平衡后分別進行檢測，以處理濃度為橫 坐標、耗氧水平為縱坐標，根據實驗得到的數據繪制標準曲線，當相關系數I r I > 0.980，變異系數CV〈10。/。，表明試驗條件符合要求； '
相關系數I r I和變異系數CV相關公式和計算方法
變異系數CV為各個實驗數據的標準差s除以平均值x。
公式為CV = s/xX100%， X>0;
相關系數為描述兩個或兩個以上變量間關系密切程度的統計分析指標。公 式較為復雜，為
廣—>1>2 —0>)3 ， 可以通過EXCEL軟件進行計算； c)、選擇適宜的注射劑稀釋濃度
將注射劑樣品用生理鹽水0. 9%氯化鈉注射液稀釋成注射劑樣品原液的濃度， 再從原液濃度開始進行倍半稀釋，即用生理鹽水0.鄉氯化鈉注射液稀釋至2、 4、8、 16、 32、 64倍，分別向各級稀釋液中等量添加lEU/ml的細菌內毒素工作標 準品稀釋液，分別計算其回收率R，當50X《R《200X時，該濃度的稀釋液符 合下一步檢測的要求，可以進行致熱物質的含量檢測；R越接近100X時，檢測 效果越好，選擇R最接近100%的稀釋液進行致熱物質的含量檢測； d)、注射劑樣品中致熱物質含量的確定
根據步驟c的試驗結果所得到的試驗液濃度作為樣品檢査濃度，以生理鹽 水0.9%氯化鈉注射液作為空白對照，分別加入耗氧測定儀進行檢測，然后將扣 除空白對照后的試驗結果按稀釋步驟進行計算后就得到該注射劑樣品中致熱物 質的含量；
e)、注射劑樣品中所含的致熱物質是否超標的判定
將該注射劑樣品中所含的致熱物質的含量和熱原物質的具體標準規定進行 比較，從而判定該注射劑樣品中所含的致熱物質是否超標，最終得到該注射劑 樣品熱原的安全性質量檢査是否合格的結論。
所述的步驟c中將注射劑樣品用生理鹽水0. 9%氯化鈉注射液稀釋成注射劑 樣品原液的濃度；
對注射用的粉針和凍干劑根據其具體的內包裝規格進行稀釋，即凍干劑的 內包裝是5ml規格的西林瓶，則加生理鹽水0. 9%氯化鈉注射液2 5ml進行稀釋 (加氯化鈉注射液進行稀釋的量是根據試驗樣品的內包裝的規格和樣品的溶解 效果而定，具體情況具體分析，沒有一個統一的標準)，然后將稀釋液作為樣品 原液；
對于水針劑而言，則將其直接作為樣品的原液；以此為最高濃度依次進行 稀釋，找到回收率R最接近100%的稀釋液作為最終正式的實驗濃度進行檢査。 在本發明中，實驗載體除了人全血試驗液(WBT)以外，還有人外周血單核細胞(PBMNC)、兔全血和各種細胞株(比如:THP-1、醒6、 RAW264. 7、 J774、 U937、 HL60、應6-CA8、心臟肝臟細胞等)、線粒體(人或動物的心臟、肝臟) 等都可以作為本發明注射劑中致熱物質含量的全熱原檢測方法的實驗載體。如 果采用本發明的方法，用上述載體進行注射劑中致熱物質含量的全熱原檢測， 都將落入本發明的保護范圍。
方案優點
1. 文字說明
我們研究發明的全熱原檢査法和家兔檢査法、細菌內毒素檢查法、體外熱 原實驗法相比較具有很大的優勢，它檢測范圍更廣，可以覆蓋絕大部分中藥、 化學藥、生物制品等非腸道用藥制品；檢測數據更客觀，更真實地模擬了熱原
在人體內的實際情況；而且，其靈敏度高，重復性好，專屬性強，能定量和標 準化，對試驗的底物材料消耗少，試驗成本較低，可大批量的進行試驗，也符
合保護動物的3R (減少、替代、優化)精神，能夠可持續地發展。這在熱原檢 測方法的發展里程中，無疑具有革命性的意義。我們堅信在不久的將來，全熱 原檢査法一定能夠在非腸道用藥制品的熱原檢測中占據極其重要的地位。
2. 方法對比說明
注射用苯巴比妥，收錄入了 2005年版《中國藥典》(二部)，是一種鎮靜催 眠、抗驚厥的藥物，因其對家兔的中樞及外周體溫調節有影響，故現行標準中 均沒有相關的熱原檢測方法，但對其進行熱原的安全性質量控制是十分必要的。 用我們發明的全熱原檢査法進行檢測，線性、重復性、檢測限均符合規定，填 補了該品種熱原檢測的空白。
清開靈注射液，收錄入了 2005年版《中國藥典》(一部)，因其是含有各種 成分的復方中藥注射劑，對細菌內毒素檢査干擾較大而無法用細菌內毒素檢査法進行檢測，故藥典只有采用家兔檢查法。但由于家兔的個體差異及靈敏度低， 容易造成檢測結果的假陰性。用我們發明的全熱原檢査法進行檢測，線性、重 復性、檢測限均符合規定。試驗結果表明，全熱原檢查法可以用于全部中藥注 射劑品種(包括植物類藥和動物類藥)的熱原安全性質量檢測。
人血白蛋白，收錄入了 2005年版《中國藥典》(三部)，因其是生物制品， 組成成分較復雜，對細菌內毒素檢測干擾較大，故藥典采用家兔檢査法。用我 們發明的全熱原檢查法進行檢測，線性、重復性、檢測限均符合規定。試驗結 果表明，全熱原檢測法可以用于生物制品類注射劑的熱原安全性質量檢測。 3.經濟效益分析
根據國家食品藥品監督管理局官方網站數據顯示，我國目前有藥品生產企 業6694家，其中生產注射劑品種的廠家1072家；醫療器械生產企業6322家， 其中生產和血循環相關的醫療器械的廠家有59家。由此推斷，全國有近千家藥 廠生產的幾千個注射劑品種都需進行熱原的質量控制檢査。按照GMP要求，每 個藥廠都應該建有一個標準的動物房。據專家估算，動物房的建安成本為 2050(T26000元/m2，造價大大高于普通試驗室，這還不包括日常維護的照明、 通風、給排水、空調、動物購進、飼養和處理、人工成本等變動成本，這樣算 下來，建造一個中等規模的動物房成本在200 350萬元，每年的運行維護成本 還需近百萬元，投入遠大于產出，這對藥廠而言無疑是個沉重的負擔，可為了 人民群眾的用藥安全又必須進行熱原的質量控制。有沒有什么辦法既能控制藥 品的熱原物質，又能大幅度降低動物試驗的成本呢？
我們研究的全熱原檢査法完全能夠解決上述難題。它在普通的實驗室就可 以進行檢測，成本主要包括耗氧檢測設備和檢測耗材，大約在15萬元左右，大 大低于建設一個動物室的成本，僅此一項就可節約近二百萬元，推廣開來，全國如果有五百家藥廠采用我們的技術，節約的費用就高達十個億。無論對廠商， 還是對整個國家，這項技術所產生的效益都是極具誘惑力的。這也表明，我們 發明的全熱原檢查法未來的市場空間和經濟效益都是巨大的，具有強大的市場 競爭力。
本發明一種注射劑中致熱物質含量的全熱原檢測方法的有益效果是，適用 于所有熱原物質的檢測，既能控制藥品的熱原物質，又能大幅度降低動物試驗 的成本，提高了患者的用藥安全性，市場空間和經濟效益巨大，具有強大的市 場競爭力。
具體實施方式
下面對本發明作進一步的說明 1..試驗材料及設備
1) 試驗儀器設備耗氧測定儀(型號HQ20生產廠家HANSATECH)檢査
用底物材料人全血(WBT)(來源當地血液中心提供)
2) 試驗用標準物質細菌內毒素工作標準品(批號2007-5，規格 100EU/Amp，由中國藥品生物制品檢定所提供)
3) 待測樣品清開靈注射液(06102923， 2ml/支，河北省神威藥業有限公 司生產)
2.檢測步驟
1) 將采集而來的健康人全血經過抗凝處理后用0. 9%氯化鈉注射液稀釋成適 宜的濃度作為人全血試驗液；
2) 將細菌內毒素工作標準品用0.9%氯化鈉注射液稀釋成一系列的濃度，加 入L5ml的人全血試驗液到耗氧測定儀的呼吸室內，呼吸室溫度恒定在 37. 5±0. rC，混勻速度控制為80轉/分鐘，待平衡后連續監測耗氧速率， 作為耗氧率的基礎耗氧水平。將清開靈注射液用0.9%氯化鈉注射液稀釋至適宜的濃度，以0.9%氯化鈉注射液作為空白對照，分別加入耗氧測定 儀檢測耗氧速率，作為樣品或空白處理的耗氧水平。將處理水平減去基 礎水平得到各處理組的致熱物質耗氧水平。以處理濃度為橫坐標、耗氧
水平為縱坐標，作標準曲線，相關系數為0.9892，相對標準偏差(RSD) 為1.13%、可信限(FL)為97%，均符合規定，表明試驗條件符合要求， 可以進行下一步的檢測。待測樣品的檢測方法同上，根據測得的耗氧率， 經標準曲線計算得到對應的致熱物質濃度。
3) 然后將扣除空白對照后的試驗結果按稀釋步驟進行計算后就得到該樣品 中致熱物質的含量為0. 87EU/ml;
4) 將待測樣品致熱物質的含量和熱原物質的具體標準規定進行比較，根據 清開靈注射液臨床人用劑量計算出其熱原物質的限值為3.2EU/ml，從而 判定該樣品中所含的致熱物質在規定的限度內，其熱原的安全性質量檢 査合格。
3.檢測結論
試驗結果表明，全熱原檢査法可以用于清開靈注射液的熱原安全性質量檢測。
權利要求
1、一種注射劑中致熱物質含量的全熱原檢測方法，其特征在于包括以下步驟a)、制備人全血試驗液將采集而來的體外人全血經過阿氏液作抗凝處理后，再將經過阿氏液作抗凝處理后的體外人全血用生理鹽水0.9％氯化鈉注射液稀釋成為體積比濃度為2％v/v，的人全血試驗液；b)、將細菌內毒素工作標準品用生理鹽水0.9％氯化鈉注射液稀釋后進行線性考察，做出標準曲線將細菌內毒素工作標準品用生理鹽水0.9％氯化鈉注射液稀釋成100EU/ml、10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml、0.01EU/ml，分別取各級稀釋液0.1ml和步驟a中的人全血試驗液1.5ml到耗氧測定儀的呼吸室內，呼吸室溫度恒定在37.5±0.1℃，混勻速度控制為80轉/分鐘，待平衡后分別進行檢測，以處理濃度為橫坐標、耗氧水平為縱坐標，根據實驗得到的數據繪制標準曲線，當相關系數|r|>0.980，變異系數CV<10％，表明試驗條件符合要求；c)、選擇適宜的注射劑稀釋濃度將注射劑樣品用生理鹽水0.9％氯化鈉注射液稀釋成注射劑樣品原液的濃度，再從原液濃度開始進行倍半稀釋，即用生理鹽水0.9％氯化鈉注射液稀釋至2、4、8、16、32、64倍，分別向各級稀釋液中等量添加1EU/ml的細菌內毒素工作標準品稀釋液，分別計算其回收率R，當50％≤R≤200％時，該濃度的稀釋液符合下一步檢測的要求，可以進行致熱物質的含量檢測；R越接近100％時，檢測效果越好，選擇R最接近100％的稀釋液進行致熱物質的含量檢測；d)、注射劑樣品中致熱物質含量的確定根據步驟c的試驗結果所得到的試驗液濃度作為樣品檢查濃度，以生理鹽水0.9％氯化鈉注射液作為空白對照，分別加入耗氧測定儀進行檢測，然后將扣除空白對照后的試驗結果按稀釋步驟進行計算后就得到該注射劑樣品中致熱物質的含量；e)、注射劑樣品中所含的致熱物質是否超標的判定將該注射劑樣品中所含的致熱物質的含量和熱原物質的具體標準規定進行比較，從而判定該注射劑樣品中所含的致熱物質是否超標，最終得到該注射劑樣品熱原的安全性質量檢查是否合格的結論。
2、根據權利要求1所述一種注射劑中致熱物質含量的全熱原檢測方法，其特征在于所述的步驟c中將注射劑樣品用生理鹽水0. 9%氯化鈉注射液稀釋成注射劑樣品原液的濃度；對注射用的粉針和凍干劑根據其具體的內包裝規格進行稀釋，即凍干劑的內包裝是5ml規格的西林瓶，則加生理鹽水0. 9%氯化鈉注射液2 5ml進行稀釋，然后將稀釋液作為樣品原液；對于水針劑而言，則將其直接作為樣品的原液；以此為最高濃度依次進行稀釋，找到回收率R最接近100%的稀釋液作為最終正式的實驗濃度進行檢査。
全文摘要
本發明公開了一種注射劑中致熱物質含量的全熱原檢測方法，其特征在于包括以下步驟a)制備人全血試驗液；b)將細菌內毒素工作標準品用生理鹽水0.9％氯化鈉注射液稀釋后進行線性考察，做出標準曲線；c)選擇適宜的注射劑稀釋濃度；d)注射劑樣品中致熱物質含量的確定；e)注射劑樣品中所含的致熱物質是否超標的判定；將該注射劑樣品中所含的致熱物質的含量和熱原物質的具體標準規定進行比較，從而判定該注射劑樣品中所含的致熱物質是否超標，最終得到該注射劑樣品熱原的安全性質量檢查是否合格的結論。本發明適用于所有熱原物質的檢測，既能控制藥品的熱原物質，又能大幅度降低動物試驗的成本，提高了患者的用藥安全性，市場空間和經濟效益巨大。
文檔編號G01N33/15GK101477103SQ20091010300
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月5日 優先權日2009年1月5日
發明者蘭 彭, 羅毅平, 范能全 申請人:范能全