專利名稱：：一種檢測黃酒中氨基甲酸乙酯的方法
技術領域：
：本發明屬于食品分析和食品安全
技術領域：
，尤其涉及一種檢測黃酒中氨基甲酸乙酯含量的方法。
背景技術：
：氨基甲酸乙酯(簡稱EC，又稱脲烷)廣泛存在于各種發酵食品中，特別是飲料酒中，是一種潛在的致癌物質。世界衛生組織國際癌癥研究機構已將氨基甲酸乙酯(EC)歸為2A類致癌物，與丙烯酰胺同等危險。世界衛生組織和聯合國糧農組織(WHO/FAO)食品添加劑專業委員會(JECFA)于2005年對氨基甲酸乙酯進行了系統性的評估，強調氨基甲酸乙酯的攝入主要來源于飲料酒，建議必須采取有效措施降低飲料酒中的氨基甲酸乙酯含量。由于飲料酒中氨基甲酸乙酯濃度過低以及飲料酒中成分復雜，對檢測的干擾太大導致對飲料酒中氮基甲酸乙酯的檢測十分困難。傳統的固相萃取-氣相色譜/質譜聯用法(SPE-GC/MS)已被權威機構美國官方分析化學師協會(AOAC)、國際葡萄與葡萄酒局(OIV)和歐盟寫入標準檢測方法，但該法對樣品的預處理極為復雜，耗時，而且檢測成本較高，不適宜用于實驗室的常規分析。黃酒中存在的氨基甲酸乙酯已經面臨著國際貿易技術壁壘的威脅，并將成為限制我國黃酒產業進一步健康持續發展的一大障礙，同時這也會對廣大消費者的生命安全造成嚴重威脅。因此，建立一種檢測黃酒中氨基甲酸乙酯的方法顯得十分有必要。從目前的研究情況來看，大部分黃酒中氨基甲酸乙酯的檢測方法仍然采用傳統的固相萃取-氣相色譜/質譜聯用法(SPE-GC/MS)，檢測成本髙，耗時，不適合常規分析。
發明內容本發明提供了一種利用高效液相色譜儀熒光檢測器檢測黃酒中氨基甲酸乙酯的方法，具有操作簡單、重復性好、精密度高和檢測成本低等特點。一種檢測黃酒中氨基甲酸乙酯的方法，步驟如下(1)利用減壓蒸餾，對黃酒進行預處理，使得黃酒體積減少為初始體積的1/5—1/10;所述的減壓蒸餾的溫度為30-40°C(優選35°C);(2)將經過預處理的黃酒與鹽酸及9-羥基噸溶液混合進行衍生化反應，得到衍生化后的黃酒；所述的衍生化反應時間為30min，在室溫條件下反應；黃酒、鹽酸、9-羥基噸溶液的體積比為黃酒鹽酸9-羥基噸溶液=(710):1:2，(優選10:1:2);所述的鹽酸的濃度為12.0mol/L(優選1.5mol/L);所述的9-羥基噸溶液為9-羥基噸的正丙醇溶液，9-羥基噸溶液中9-羥基噸的濃度為0.01-0,03mol/L(優選0,02mol/L);氨基甲酸乙酯與9-羥基噸之間的衍生化反應如下氨基甲酸乙酯本身沒有熒光特性，但衍生化反應后得到的產物噸基尿烷在233nni波長光的激發下，能發射出600nm的熒光，因此通過高效液相色譜(HPLC)分離后它能夠被熒光檢測器(FLD)所定量。黃酒鹽酸9-羥基噸溶液合適的用量比以及優選的鹽酸的濃度可以使衍生化反應進行的更徹底，使最終的檢測結果更加精確。(3)利用高效液相色譜儀對衍生化后的黃酒進行組分分離，采用外標法計算氨基甲酸乙酯含量；所述的高效液相色譜儀采用C18反相柱(柱子長度250X柱子直徑4.6mm，填充料直徑4um參數的含義說一下)，檢測溫度35'C，進樣量20uL，氨基甲酸乙酯出峰時間為35-38min;采用甲醇和水作為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫時流動相隨時間變化見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表中甲醇和水的比例為體積百分比。本發明采用特定的分離條件，實現了氨基甲酸乙酯的精確分離以及含量檢測，利用步驟(1)步驟(3)的方法進行測定氨基甲酸乙酯含量時，利用外標法所得標準曲線，峰面積與氨基甲酸乙酯濃度間的相關系數R2=0.9990;對同一樣品進行多次測定得到方法的精密度RSD<5%;利用標準物質加入法測定方法的回收率在98%-101%;由此可見本發明方法具有很高的精度。本發明采用減壓蒸餾對黃酒樣品進行預處理，以達到富集黃酒中氨基甲酸乙酯的目的，處理后的樣品可以用于氨基甲酸乙酯的定量測定。在指定的HPLC條件下測定黃酒中氨基甲酸乙酯含量。本發明方法操作簡單，檢測成本低，與傳統的固相萃取-GC/MS分析方法相比需要的儀器設備簡單，樣品前處理不復雜，所需要的檢測條件簡便，花費的檢測時間較短。圖1為空白對照的高效液相色譜圖。圖2為氨基甲酸乙酯標準品的高效液相色譜圖。圖3為實施例1的高效液相色譜圖。圖4為實施例2的高效液相色譜圖。圖5為實施例3的高效液相色譜圖。圖6為實施例4的高效液相色譜圖。圖7為實施例5的高效液相色譜圖。圖8為實施例6的高效液相色譜圖。圖9為實施例7的高效液相色譜圖。圖10為實施例8的高效液相色譜圖。圖11為實施例9的高效液相色譜圖。圖12為實施例10的高效液相色譜圖。具體實施例方式采用的高效液相色譜儀及熒光檢測器Waters2695高效液相色譜儀，Waters2475熒光檢測器(美國Waters公司)色譜條件C18反相柱(250x4.6mm，4(im)，檢測溫度35。C，進樣量20pL，激發波長Xex=233nm，發射波長Xem=600nm，流動相為甲醇和水，梯度洗脫程序如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>采用的相關試劑如下氨基甲酸乙酯標準品(EC,購于Sigma公司)，9-羥基噸(9-xanthydrol,購于Sigma公司)，甲醇(色譜純)，雙蒸水，鹽酸(分析純)，正丙醇(分析純)。準確稱取3.6mg氨基甲酸乙酯標準品，用30%的甲醇定容至200mL，制成18昭/mL的標準儲備液，分別準確吸取2.5mL，1.0mL，0.5mL，0.1mL標準儲備液用30%甲醇定容至10mL，得到濃度為4.5pg/mL，1.8jig/mL，0.9(ig/mL，0.18呢/mL的氨基甲酸乙酯標準供試液。在離心管中加入1mL標樣(氨基甲酸乙酯標準供試液)，0.1mL鹽酸溶液和0.2mL9-羥基噸溶液，并將離心管置于振蕩器上震蕩數秒使其混合均勻，放置30min左右。所述的鹽酸的濃度為1.5mol/L;所述的9-羥基噸溶液為9-羥基噸的正丙醇溶液，9-羥基噸溶液中9-羥基噸的濃度為濃度為0.02mol/L。衍生化反應后的溶液用微過濾膜濾過后，向高效液相色譜儀進樣，對不同濃度的氨基甲酸乙酯標準供試液進樣檢測，記錄對應的峰面積值Area(A)，數據如表1:表1方法線性關系考察編號C(嗎/mL)A"1^79993.121.83135030.91598340.184625以濃度C(氨基甲酸乙酯標準供試液中氨基甲酸乙酯的濃度)對面積A作線性回歸，得到氨基甲酸乙酯的線性回歸方程為A=17624C+377.3(f=0.999)。由線性相關系數可以看出，氨基甲酸乙酯濃度與峰面積之間線性關系良好。對一標準品按連續進行6次重復測定，對保留時間和峰面積精密度進行考察，數據如表2:表2方法精密度考察次數保留時間/min峰面積"136.83313016.874236.73312509,999336.78312371.153437扁12597,199536.76712237.346636.83612223,7138平均值36.82512492.714RSD0.26%2.37%從上表中可以看出無論是保留時間還是峰面積，相對標準偏差RSD均小于5%，精密度高，可以精確測定黃酒中的氨基甲酸乙酯。向黃酒樣品中添加1.18pg/mL和2.36ng/mL的氨基甲酸乙酯標準物質，測定被加入氨基甲酸乙酯的回收量，計算回收率，結果見表3。結果顯示，方法的回收率在98%-101%之間，可以用于氨基甲酸乙酯的準確測定。表3方法加標回收率考察EC添加量回收EC量回收率jlg/lTLL2.362,39101.3%2.3623398,7%1,181,1698.3%實施例110黃酒中氨基甲酸乙酯含量的測定分別取市售10種不同牌號的黃酒，分別經過減壓蒸餾對黃酒進行預處理，將經過預處理的黃酒與鹽酸及9-羥基噸溶液混合進行衍生化反應，得到衍生化后的黃酒，衍生化反應時間為30min，在室溫條件下反應。按體積比，黃酒鹽酸9-羥基噸溶液=10:1:2;鹽酸的濃度為1.5mol/L;9-羥基噸溶液為9-羥基噸的正丙醇溶液，9-羥基噸溶液中9-羥基噸的濃度為濃度為0.02mol/L。利用高效液相色譜儀對衍生化后的黃酒進行組分分離，利用得到的工作區下采用外標法計算氮基甲酸乙酯含量；高效液相色譜儀采用C18反相柱(250X4.6mm,4um)，檢測溫度35°C，進樣量20uL，氨基甲酸乙酯出峰時間為35-38min;采用甲醇和水作為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫時間/min流速/mL'min"甲醇％水％00,86139400.8613942110005011000各實施例黃酒中氨基甲酸乙酯含量檢測結果見表4。表4黃酒中氨基甲酸乙酯含量實施例序號濃縮體積比氨基甲酸乙酯含量^g/L11/1014,9423/2063.9133/20111,9147/5073.21510/8724.4963/2067.3571/8未檢出816/9761.694/25125.23107/50242.24各實施例對應的液譜譜圖可參見圖3圖12，均顯示有較好的分離效權利要求1、一種檢測黃酒中氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于(1)利用減壓蒸餾，對黃酒進行預處理，使得黃酒體積減少為初始體積的1/5～1/10；(2)將經過預處理的黃酒與鹽酸及9-羥基噸溶液混合進行衍生化反應，得到衍生化后的黃酒；(3)利用高效液相色譜儀對衍生化后的黃酒進行組分分離，采用外標法計算氨基甲酸乙酯含量；所述的高效液相色譜儀采用C18反相柱，規格為250×4.6mm，4μm，檢測溫度35℃，進樣量20μL，采用甲醇和水作為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫時流動相隨時間變化為<tablesid="tabl0001"num="0001"><table><tgroupcols="4"><colspeccolname="c001"colwidth="25%"/><colspeccolname="c002"colwidth="25%"/><colspeccolname="c003"colwidth="25%"/><colspeccolname="c004"colwidth="25%"/><thead></column></row><row><column><entrymorerows="1">時間/min</entry><entrymorerows="1">流速/mL·min-1</entry><entrymorerows="1">甲醇％</entry><entrymorerows="1">水％</entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrymorerows="1">0</entry><entrymorerows="1">0.8</entry><entrymorerows="1">61</entry><entrymorerows="1">39</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">40</entry><entrymorerows="1">0.8</entry><entrymorerows="1">61</entry><entrymorerows="1">39</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">42</entry><entrymorerows="1">1</entry><entrymorerows="1">100</entry><entrymorerows="1">0</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">50</entry><entrymorerows="1">1</entry><entrymorerows="1">100</entry><entrymorerows="1">0</entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></tables>氨基甲酸乙酯出峰時間為35-38min。2、如權利要求l所述的方法，其特征在于步驟(1)中，黃酒減壓蒸餾預處理的溫度為3040°C。3、如權利要求l所述的方法，其特征在于步驟(2)中衍生化反應時間為30min，在室溫下反應。4、如權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中黃酒、鹽酸、9-羥基噸溶液的體積比為黃酒鹽酸9-羥基噸溶液=710:1:2。5、如權利要求4所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的鹽酸的濃度為12.0mol/L。6、如權利要求5所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的9-羥基噸溶液為9-羥基噸的正丙醇溶液，9-羥基噸的濃度為0.01-0.03mol/L'全文摘要本發明公開了一種檢測黃酒中氨基甲酸乙酯的方法，包括(1)利用減壓蒸餾，對黃酒進行預處理，使得黃酒體積減少為初始體積的1/5～1/10；(2)將經過預處理的黃酒與鹽酸及9-羥基噸溶液混合進行衍生化反應，得到衍生化后的黃酒；(3)利用高效液相色譜儀對衍生化后的黃酒進行組分分離，采用外標法計算氨基甲酸乙酯含量。本發明方法操作簡單，檢測成本低，與固相萃取-氣相色譜/質譜聯用(SPE-GC/MS)分析方法相比需要的儀器設備簡單，樣品前處理不復雜，所需要的檢測條件簡便，花費的檢測時間較短。文檔編號G01N30/00GK101620206SQ20091009955公開日2010年1月6日申請日期2009年6月18日優先權日2009年6月18日發明者何國慶,傅明亮,章海鋒,翁育輝,陳啟和申請人:浙江大學