專利名稱：人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚a和己烯雌酚的共檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，特別是涉及一種人體尿液中沙丁胺醇、雌 二醇、雙酚A和己烯雌酚的共檢測方法。
技術背景
雌二醇屬于甾體同化激素，對體內糖、脂肪、蛋白質、鹽等物質的代謝有不 同程度的影響，雌二醇常被用于畜牧業養殖中，用來提高動物體重和喂養效率。 雌二醇屬于內源性(天然)激素，而雙酚A和己烯雌酚是雌激素類似物。環境雌 激素屬于環境內分泌干擾物，它的分子結構與雌激素相似，進入體內后無法分 辨，于是在體內就具有雌激素效應。外源性雌激素及其類似物進入動物或人體 后，能對機體內正常內分泌物質的合成、釋放、運轉、代謝以及結合等產生干擾， 從而破壞內分泌系統的調控作用。外源性雌激素及其類似物會增加癌癥的患病 幾率，特別是男性的睪丸癌、前列腺癌以及女性的乳腺癌、子宮頸癌。濫用激 素對人和動物健康、生態環境都會造成直接或潛在的危害。20世紀80年代以來， 歐盟等許多國家和組織通過立法限制或禁止在食用性動物飼養中使用激素。
沙丁胺醇為e -受體激動劑，臨床上用于治療支氣管哮喘或喘息型支氣管炎 伴有的支氣管痙攣等病癥。該藥物除具有上述藥理作用外，若大劑量使用還會 興奮中樞神經系統，并會產生蛋白同化作用，所以被運動員用作刺激劑和蛋白 同化制劑[l]。沙丁胺醇作為P-腎上腺素受體興奮劑，用于動物飼養可起促生 長作用，所以還常用于飼料添加劑中。
鑒于環境污染的形勢非常嚴峻，建立環境污染對人體危害的預警體系非常 有必要。學術界對污染物質檢測的研究非常多，但多集中在環境外暴露測量。 上個世紀末，學者研究通常是對環境樣本(空氣、土壤和水)中單個或多個污 染物質進行檢測，是環境監理實施監督管理的耳目和手段，著重檢測環境樣品 中污染物質的含量以此間接評價其對人體健康的影響。這在環境衛生學中屬于 環境外暴露劑量研究。近十年，對人體內某些污染物質的檢測逐漸增多，涉及 的物質越來越廣泛，包括芳香族化合物、農藥、獸藥、食品添加劑和環境激素
4等。這在環境衛生學中屬于環境內暴露劑量研究。對于環境外暴露的檢測，由 于每個人接觸到的環境污染物質種類、污染水平和污染程度是不同的，另外人 體對這些污染物質的敏感程度也不一樣，環境污染對人體傷害的潛伏期又較長， 很難從直覺來感知其污染的程度，所以往往出現"身在毒中不知毒"的情況。 而環境內暴露檢測通常是對大量人群體內某種或某一類污染物質的分布進行測 定，能夠避免個體差異的影響，真實客觀地反映人體污染物質的暴露水平。作 為內暴露的檢,樣本主要有血樣，組織樣本和尿樣。而尿樣作為內暴露的檢測 樣本，對人體無損傷，取樣方便，易獲得。可用于臨床上大規模的體檢排查。
目前環境雌激素的測定方法文獻辨道多為氣相色譜/質譜法(GC/MS)和液 相色譜/質譜法(LC/MS)。沙丁胺醇常用的檢測方法主要是以酶聯免疫法(ELISA) 為主，也有用高效液相色譜法測定的報道，但主要用于飼料樣品的檢測。GC/ MS法是國際公認的確證方法，同時檢測靈敏度高，能定性定量，為檢測低濃度 代謝物提供條件，并且其自動化檢測更容易進行大批量的測定。方法方便，快
發明內容
本發明針-對現有技術的不足，提供一種方法簡便、快捷、結果可靠、自動 化程度高、便于產業化應用的人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌 酚的共檢測方法。
本發明方法是通過以下技術方案實現的，其特征在于包括以下步驟-
第一步，將收集的尿液離心后保存；
第二步，取第一步得到的尿液，加入內標萘羥心胺，再加入甲醇和鹽酸進 行酸解；
第三步，取第二步中的剩余液，加入氫氧化鈉溶液和乙酸鈉緩沖液，然后 過cleanert PCX固相萃取柱，收集洗脫液為A液，剩余液待用；
第四步，紋第三步中的樣品剩余液，過cleanert PEP固相萃取柱，收集洗 脫液為B液；
第五步，吹干A液，用乙腈復溶后、J生化；
第六步吹干B液，加碳酸鉀溶液后用石油醚萃取兩次，合并有機相，經
無水硫酸鈉脫水吹干，最后用正己垸復溶；第七步取第五步和第六步中的反應液用于氣相色譜質譜聯用測定。 本發明具有以下優點-
1. 本發明采用尿樣作為檢測樣本，.對人體無損傷，方便且易獲得。
2. 在面對同樣的環境污染條件下，個人受損傷程度并不一致。本發明致力 于對人環境污染物質內暴露(尿樣)水平的測定，能真實反映暴露水平和個人 損傷程度。不僅反映了多種途徑暴露的總水平，而且能避免由環境外暴露劑量 估計暴露水平時吸收率的個體差異性的影響。
3. 用氣質聯用檢測樣本，檢測靈敏度高，能定性定量，為檢測低濃度代謝 物提供條件，并且其自動化檢測更容易進行大批量的測定。方法方便，快捷，
4. 本發明以盡可能少的步驟同時檢測沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌 酚，檢測成本低，能系統化全面評價人體的污染物接觸程度，有利于產業化推 廣到普通人群。
5. 本發明通過同時檢測沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌酚內暴露對人 的健康危害，建立這兩類污染物內暴露對健康危害程度評價的參考標準。通過 這個檢測方法的建立，人們能對自身健康進行評價，知道這些環境污染物對自 己的危害程度，為診斷或預測其患有某種疾病的可能性和發展趨勢提供科學依 據。 —
6. 在同時檢測沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌酚內暴露健康危害的同 時，還進行跟蹤和干預。對有安全隱寧的個體進行飲食、作息、生活習慣等等 各種因素的調整，把威脅隱患降到最低。
圖1是本發明實施例1所得通過固相萃取衍生1號人體尿液所得氣相質譜 選擇離子流圖。
圖2是本發明實施例1所得通過固相萃取衍生2號人體尿液所得氣相質譜 選擇離子流圖。
具體實施方式
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本發明方法的各個步驟如下
第一步，收集人體尿液10—20ml，'將收集的尿液離心后保存，保存溫度為-20 °C;
第一步，將收集的尿液離心后保存，保存溫度為-20 °C; 第二步，取第一步得到的尿液，加入內標萘羥心胺，再加入甲醇和鹽酸進行 酸解； -
所述取尿液的體積為5ml，萘羥心胺加入的量為200ul，濃度為10ng/ml， 甲醇加入的量為lml，鹽酸加入的量為300 Pl，濃度為6M;
第三步，取第二步中的剩余液，加入氫氧化鈉溶液和乙酸鈉緩沖液，然后 過cleanert PCX固相萃取柱，收集洗脫液為A液，剩余液待用；
所述氫氧化鈉溶液加入的量為180ul，濃度為5M;所述乙酸鈉緩沖液加入 的量為600u 1， PH為5. 0。所述固相萃取條件為用2ml甲醇和2ml 0. 1M的 HC1活化預處理；以8ml/min的流速過樣品；用2ml 0. 1M的HC1和2ml甲醇洗 柱；用2ml ^^/異丙醇/32%氨水[80:2:2 v:v:v]洗脫；
第四步，取第三步中的樣品剩余液，過cleanert PEP固相萃取柱，收集洗 脫液為B液； .
所述固相萃取條件為用3ml MTBE、 3ml甲醇和3ml純水活化預處理；用 3ml甲醇水(1:1 v:v)洗滌；用6ml甲醇:MTBE (1:9 v:v)洗脫；
第五步，吹干A液，用乙腈復溶后衍生化；
所述乙腈的用量為50yl;所述衍生化試劑為硅垸化試劑，加入的量為50 U 1，衍生化溫度為60°C，衍生化時間為30min;
第六步吹干B液，加碳酸鉀溶液后用石油醚萃取兩次，合并有機相，經 無水硫酸鈉脫氷吹干，最后用正己烷復溶；
所述加入碳酸鉀溶液的量為3mL，質量分數為1%;加入石油醚的量為2ml; 加入正己垸復溶的量為100ul; '
第七步取第五步和第六步中的反應液分別用于氣相色譜質譜聯用測定；
所取反應液的進樣體積為1 5ul，優選2ul;
所述用于氣相色譜質譜聯用測定的條件為色譜柱選擇中等極性或非極性 色譜柱中的一種，采用E1源電離和SIM掃描模式，電離電壓為70eV ，離子源 溫度在220 250。C ，進樣口溫度在260 °C 290 °C 。
實施例1取-20 'C保存的2份尿樣，分別標記為l、 2號，自然解凍后離心，分別同 時進行以下實驗操作步驟取上清尿樣5ml，加200ul 10昭/ml的內標萘羥心胺， lml甲醇，0. 3ml 6M濃鹽酸，80。C放10min，然后加180ul 5M的氫氧化鈉，600ul 乙酸鈉緩沖液(PH 5.0)，然后過柱。
先過柱1 cleanert PCX:用2ml甲醇和2ml 0. 1M的HC1活化預處理；以 8ml/min的流速過樣品，同時接廢液用來過柱2;用2ml 0. 1M的HC1和2ml甲 醇洗柱；用2ml氯仿/異丙醇/32%氨水[80:2:2 v:v:v]洗脫，流速6ml/min， 得洗脫液A;吹干后加50ul乙腈復溶，再加50ulMSTFA， 60°C，衍生化30min ; 反應液用GC/MS分析。
將收集的廢液過柱2 cleanert PEP:用3ml MTBE、 3ml甲醇和3ml純水活 化預處理；過樣品后用3ml甲醇水(l:l v:v)洗滌；用6ml甲醇:MTBE(1:9 v:v) 洗脫，得洗脫液B;吹干B液，加50ulPFPA室溫衍生化30min，加2 mL石油醚 和3mL 1 %(質量分數)碳酸鉀溶液；在渦流振蕩器上振搖l min;靜置分層后， 將石油醚層流經無水硫酸鈉脫水，流出液收集于離心管中；再用2 mL石油醚萃 取，重復兩次，脫水后，合并石油醚層，緩緩吹干；最后用100 uL正己烷復溶， 用GC/MS分析。
GC/MS條件為采用DB-5ms柱，EI離子源，電壓為70eV，離子源溫度為 230°C，進樣口溫度為280 °C。采用SIM方式采集實驗結果。結果如附圖1、 2 所示。圖1為1號尿樣SIM色譜圖，從中分析出了沙丁胺醇。圖2為2號尿樣 SIM色譜圖，從中分析出了雌二醇、雙酚A和己烯雌酚。
本發明所述的人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌酚的共檢測 方法，可用于人體尿液中沙丁胺醇的檢測，也可以用于人體尿液中雌二醇、雙 酚A和己烯雌酚的檢測，還可以用于同時檢測人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、 雙酚A和己烯雌酚。通過對人體樣本的檢測，反映個體的沙丁胺醇、雌二醇、 雙酚A和己烯雌酚的內暴露情況，可以預防沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯 雌酚這些環境污染物對人造成的危害和疾病，從而說明個體的環境污染物接觸 情況，提示個體改善生活習慣方式，減少污染物的接觸，提高健康水平。同時 本方法還可以作為環境監測的指標，來對人們的居住環境進行評價。
權利要求
1、一種人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌酚的共檢測方法，其特征在于包括以下步驟第一步，收集人體尿液10—20ml，將收集的尿液離心后保存；第二步，取第一步得到的尿液，加入內標萘羥心胺，再加入甲醇和鹽酸進行酸解；第三步，取第二步中的剩余液，加入氫氧化鈉溶液和乙酸鈉緩沖液，然后過cleanert PCX固相萃取柱，收集洗脫液為A液，剩余液待用；第四步，取第三步中的樣品剩余液，過cleanert PEP固相萃取柱，收集洗脫液為B液；第五步，吹干A液，用乙腈復溶后衍生化；第六步吹干B液，加碳酸鉀溶液后用石油醚萃取兩次，合并有機相，經無水硫酸鈉脫水吹干，最后用正己烷復溶；第七步取第五步和第六步中的反應液用于氣相色譜質譜聯用測定。
2、 如權利要求l所述的人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌 酚的共檢測方法，其特征是所述第一步中尿液離心后保存的溫度為-20 °C 。
3、 如權利要求1所述的人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌 酚的共檢測方法，其特征是所述第二步中尿液的體積為5ml，萘羥心胺加入的 量為20(Hi1，濃度為10pg/ml，甲醇加入的量為lml，鹽酸加入的量為300^1，濃 度為6M。
4、 如權利要求1所述的人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌 酚的共檢測方^1，其特征是所述第三步中氫氧化鈉溶液加入的量為180ul，濃 度為5M;所述乙酸鈉緩沖液加入的量為600^1， ra為5.0。
5、 如權利要求1所述的人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌 酚的共檢測方法，其特征是所述第三步中固相萃取條件為用2ml甲醇和2ml O.lM的HCl活化預處理；以8ml/min的流速過樣品；用2ml 0.1M的HC1和2ml甲醇洗柱；用2ml氯仿/異丙醇/32%氨水[80:2:2 v:v:v]洗脫。
6、 如權利要求l所述的人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌 酚的共檢測方法，其特征是所述第四步中固相萃取條件為用3mlMTBE、 3ml 甲醇和3ml純水活化預處理；用3ml甲醇:水(l:l v:v)洗滌；用6ml甲醇:MTBE(1:9 v:v)洗脫。
7、 如權利要求1所述的人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌 酚的共檢測方法，其特征是所述第五步中乙腈的用量為50li 1;所述衍生化試 劑為硅烷化試劑，加入的量為50 n 1，衍生化溫度為60°C，衍生化時間為30min。
8、 如權利要求l所述的人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌 酚的共檢測方法，其特征是所述第六步中加入碳酸鉀溶液的量為3mL，質量分 數為1%;加入石油醚的量為2ml;加入正己垸的量為100ul。
9、 如權利要求1所述的基于衍生方法的同時檢測人體尿液中沙丁胺醇、 雌二醇、雙酚A和己稀雌酚的方法，其特征是所述第七步中所取的反應液進樣 體積為1 5P 1。
10、 如權利要求l所述的人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌 酚的共檢測方法，其特征是所述第七步中用于氣相色譜質譜聯用測定的條件為 色譜柱選擇中等極性或非極性色譜柱中的一種，采用El源電離和SIM掃描模 式，電離電壓為70eV ，離子源溫度在220 250°C ,進樣口溫度在260 °C 290 °C 。
全文摘要
本發明涉及生物工程技術領域，特別是涉及一種人體尿液中沙丁胺醇、雌二醇、雙酚A和己烯雌酚的共檢測方法。其特征在于包括以下步驟收集人體尿液，將尿液離心后保存；向尿液中加入內標萘羥心胺，再加入甲醇和鹽酸進行酸解；向剩余尿液中加入氫氧化鈉溶液和乙酸鈉緩沖液，然后過cleanert PCX固相萃取柱，收集洗脫液為A液，剩余液待用；取剩余尿液，過cleanert PEP固相萃取柱，收集洗脫液為B液；吹干A液，用乙腈復溶后衍生化；吹干B液，加碳酸鉀溶液后用石油醚萃取兩次，合并有機相，經無水硫酸鈉脫水吹干，最后用正己烷復溶；取吹干A液和吹干B液用于氣相色譜質譜聯用測定；本發明具有簡便、快捷、結果可靠、自動化程度高、便于產業化應用的特點。
文檔編號G01N30/00GK101498695SQ200910096518
公開日2009年8月5日 申請日期2009年3月5日 優先權日2009年3月5日
發明者吳鴛鴦, 陳樞青 申請人:陳樞青;施衛星;柳志明