專利名稱：環境雌激素的衍生化方法
技術領域：
本發明屬環境分析化學領域，涉及一種環境雌激素(雌酮、17 |3 _雌二醇、雌三醇、 17a-乙炔基雌二醇)的衍生化方法，是氣相色譜-質譜聯用儀用于分析此類物質的樣品前 處理方法和核心技術。
背景技術：
環境激素(Environmental Hormones)是指環境中存在的能干擾人類或野生動物 內分泌系統諸環節并對生殖、神經和免疫系統等功能產生影響的外源性化學物質。環境 激素具有很強的毒性和生物蓄積性，可通過飲用水和食物鏈富集來干擾動物和人類的內 分泌系統，在極低濃度下(ng/L水平)即對生物體產生嚴重危害，不僅影響人類健康和持 續繁衍，也威脅到生物種族的存亡。環境激素所導致的一系列環境問題已經引起了全世 界的高度重視。環境激素主要包括天然激素(雌激素和雄激素)、人工合成的激素化合物 和具有內分泌活性或抗內分泌活性的化合物，其中以環境雌激素危害最大，也是目前國內 外研究的熱點和前沿。本發明以環境中普遍存在且危害較大的四種典型環境雌激素為研 究對象，包括動物和人體內天然存在的雌酮(Estrone, El)、17P-雌二醇(強力求偶素) (17P-Estradiol，E2)、雌三醇(Estriol， E3)，人工合成的用于口服避孕藥物的17 a -乙炔 基雌二醇(17 a -ethynylestradoil， EE2)。環境雌激素El、 E2、 EE2、 E3及其衍生化產物的
化學結構如下
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雌酮(El)
np-雌二醇(E2)
17a-乙炔基雌二醇(EE2)
雌三醇(E3)
TMS-E1 (C21H30O2Si: MW 342.20)
di-TMS-E2 (C24H4o02Si2: MW 416.26)
di-TMS-EE2 (CMH40O2Si2: MW 440.26)
tri-TMS-E3 (C27H4803Si3: MW 504.29) 這類物質具有類固醇環，化學性質穩定，一旦進入環境和生物體內蓄積，就難以分 解，相對其他環境激素，有更強的內分泌干擾作用，對生態環境及人類健康的影響尤其顯 著，即使環境濃度在0. lng/L以下也會對生物體造成危害。 由于上述此類環境雌激素在環境中的濃度極低，通常為ng/L甚至pg/L級，以及 樣品中復雜基質的干擾，使得其監測難度較大，目前就世界范圍來說還處于起步階段，沒有 現成的標準分析方法。因此，開發和研究具有極高靈敏度和選擇性的低濃度環境雌激素的 分析檢測技術具有重要意義。環境樣品中環境雌激素的檢測一般包括提取、凈化、濃縮、衍 生化等前處理步驟和儀器分析，通過固相萃取或固相微萃取，樣品的提取、凈化、濃縮可一 步完成。目前最常用的儀器分析方法為氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)和液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)，然而LC-MS儀器價格較為昂貴，限制了其廣泛使用，GC-MS以其很好的檢 測靈敏度和相對較低的運行成本一直受到環境中痕量有機污染物分析的青睞。但是環境雌 激素基本上都含有羥基官能團，極性較大，直接用GC-MS分析，在氣相色譜柱內容易產生吸 附，從而使檢出值比實際值偏低，靈敏度下降，不適合痕量分析，需通過衍生化轉化成極性 較低、更易揮發且熱穩定性好的衍生物，從而提高檢測靈敏度和改善色譜峰形。因此環境雌 激素衍生化技術的發展，成為GC-MS應用于此類物質分析檢測的核心技術。
目前，關于環境雌激素的衍生化在國內尚無專利。在國外論文報道的各 種衍生化試劑中，以N， 0-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(N， 0-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide， BSTFA)最為常用。A. Shareef等(A. Shareef ， M. J. Angove， J. D.Wells. Journal of Chromatography A， 2006， 1108 :121-128)以BSTFA為衍生化試 劑，以叔丁基二甲基氯硅烷(Tert-butyldimethylsilyl-chlorosilane， TMCS)為催化劑， 在45-105t:范圍內研究了衍生化溫度對于El和EE2衍生化的影響，指出最佳衍生化溫度 為75-80°C。 A. Hibberd等(A. Hibberd， K.Maskaoui, Z. Zhang ， et al. Talanta， 2009， 77 : 1315-1321)在檢測環境水樣品和沉積物樣品中環境雌激素時，通過加入50iiLBSTFA(含 催化劑1 % TMCS)和50 ii L吡啶，在60-70。C加熱30min的條件下對El、 E2、 EE2進行了衍 生化，并用GC-MS檢測了其含量。M. Esperanza等(M. Esperanza， M. T. Suidan， R. M. Vega， et al. Chemosphere，2007，66 :1535-1544)在檢測城市污水處理廠水樣品和固體樣品中環 境雌激素時，通過加入BSTFA(含催化劑10% TMCS)和吡啶，在7(TC加熱15h的條件下對 El、 E2、 EE2、 E3進行了衍生化，然后用GC-MS檢測了其含量。以上研究表明，目前以BSTFA 為衍生化試劑的E1、E2、EE2、E3的衍生化，基本上都是在加熱的條件下進行，并且需要加入 催化劑，實驗操作較為繁瑣和費時。Y. G. Zuo等(Y. G. Zuo， K. Zhang， Y. J. Lin. Journal of Chromatography A，2007，1148 :211-218)探討了微波輔助加熱條件下環境雌激素El、 E2、 EE2、E3的衍生化，雖然可以把衍生化反應時間縮短到lmin之內，但是由于引入了微波輔助 加熱技術，進一步增加了實驗步驟，使衍生化過程變得更加復雜。 總之，當前環境雌激素的衍生化方法存在的不足是衍生化反應需要在加熱的條 件下進行，加熱溫度為60-8(TC，加熱時間為30min-15h，并且需要加入催化劑，這使得衍生 化實驗能耗和成本上升，操作步驟繁瑣，實驗時間較長，在實際環境樣品檢測中，加大了樣 品流失，降低了檢測準確度。
發明內容
本發明的目的在于針對目前環境雌激素衍生化方法中存在的不足，提出一種衍生 化新方法。該方法具有實驗操作簡便、省時、衍生化效果好的優點。 為實現上述目的，本發明在較低的溫度下(20-50°C ，常溫條件下亦可)，以N， 0-雙 三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)為衍生化試劑，對四種環境雌激素雌酮(El)、17P-雌二醇 (E2)、雌三醇(E3)、17a-乙炔基雌二醇(EE2)進行了衍生化，而且無需加入催化劑，衍生化 時間縮短為3min-8min，大大簡化了衍生化實驗步驟，縮短了反應時間，降低了能耗和成本， 減少了樣品流失。采用本發明的方法進行衍生化后環境雌激素樣品，經氣相色譜-質譜聯 用儀(GC-MS)檢測，可以將四種環境雌激素E1、 E2、 EE2、 E3同時衍生化，無副產物生成，各 衍生化產物的線性相關性良好，儀器檢出限可達0. 5pg/ ii L。
環境雌激素標準品El、 E2、 EE2、 E3準確稱量后溶于甲醇中，配成一定濃度的標準 混合溶液。由于分析樣品的量通常為痕量(pg級)，分析天平的精度難以達到要求，所以必 須溶于甲醇后稀釋一定倍數以利于準確定量。實際使用時，為了避免甲醇溶劑的干擾，使 衍生化反應更加快速、完全，本發明將含有一定濃度E1、E2、EE2、E3的標準混合溶液使用高 純氮氣緩慢吹干，另外，由于高純氮氣的保護，可以減少物質的損失。然后在一定的反應溫 度和時間下，往吹干的標準品中加入一定的BSTFA和妣啶進行衍生化，BSTFA的加入量要 合適，使用太少，會使衍生化反應不完全，得不到良好的衍生化效果，而太多會對色譜柱帶 來傷害，縮短其使用壽命。在與BSTFA的衍生化過程中加入一定量的吡啶，不僅可以阻止 EE2衍生化副產物TMS-E1和mono-TMS-EE2的生成，還可以起到溶劑的作用，有利于待測物 與BSTFA的充分反應，消除色譜圖中出現的小雜峰。為了準確定量，并且能減少衍生化試劑 對色譜柱的傷害，衍生化反應完成后須吹干加入一定量高純有機溶劑，然后取樣注入GC-MS 檢測。 上述環境雌激素標準品E1 、E2、EE2、E3為固體，純度為97 %以上，溶于甲醇中配成 標準混合溶液，密封后置于-2(TC以下保存，甲醇為色譜純。
上述高純氮氣純度為99. 99%以上。 上述BSTFA級別為衍生化級，純度大于98% ，吡啶為色譜純。 上述進樣溶劑為色譜純級高純有機溶劑，可以是甲醇、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯 或正己烷。 上述GC-MS所用色譜柱為Supelco SPB _5或者J&W Scientific DB-5MS毛細管 柱。 本發明具體包括如下步驟 1、第一步，首先取100iiL含有一定濃度(lpg/iiL-100ng/iiL)El、 E2、 EE2、 E3的 標準混合溶液于1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮吹儀，通入高純氮氣緩慢吹干。
使用高純氮氣將標準混合溶液在氮吹儀中吹干時無需加熱，常溫條件下即可。
2、第二步，加入一定量的BSTFA和吡啶，振蕩混合后，置于常溫環境中或放入恒溫 加熱箱，在室溫(20°C )-5(TC下反應3min-8min，得到衍生化產物。 反應溫度比較低且較為寬泛，為室溫(20°C )-50°C ;反應時間比較短，為 3min-8min ;加熱方式是恒溫干燥加熱。振蕩混合時間為20s-60s。 BSTFA用量為15ii L-50ii L ;妣啶用量為30 y L-60 y L ;BSTFA和妣啶的用量比例 沒有嚴格的規定。 3、第三步，取出冷卻至室溫，放入氮吹儀中，通入高純氮氣緩慢吹干，加入90 ii L 進樣溶劑和10 y L濃度為lng/ y L的內標(雄烷)，振蕩混合后，取1 y L注入GC-MS分析。
在氮吹儀中吹干時無需加熱，常溫條件下即可。振蕩混合時間為20s-60s。
El 、 E2、 EE2、 E3的衍生化產物分別為TMS-E1 (雌酮單羥基衍生化產物)、 di-TMS-E2 (17 P -雌二醇雙羥基衍生化產物)、di-TMS-EE2 (17 a -乙炔基雌二醇雙羥基衍 生化產物)、tri-TMS-E3 (雌三醇三羥基衍生化產物)。 GC以氦氣為載氣，流速為lmL/min ;不分流方式進樣，進樣口溫度為28(TC，進樣體
積1PL;升溫程序如下
612°C/min J L'min
50'C(2min) 260。C(8min) 280'C(5min) MS接口溫度為280°C ，傳輸線溫度為300°C ，離子源溫度為250°C ，電離方式為電子 轟擊電離，即EI，電子轟擊能量為70eV，溶劑延遲時間為12min。 GC-MS以全掃描模式定性 (掃描范圍m/z 50 600)、選擇離子掃描模式(即SIM模式)定量；在SIM模式下，TMS-E1、 di-TMS-E2、di-TMS-EE2、tri-TMS-E3分別選取m/z342、327、285， m/z416、401、285， m/z440、 425、285， m/z504、489、285作為特征碎片離子，掃描時間為0. 5s_0. 7s。
本發明具有以下優點 (1)衍生化反應溫度比較低且較為寬泛，常溫條件下(20°C )亦可，由于可省去加 熱步驟，使衍生化實驗變得簡便省事，降低了能耗和成本； (2)衍生化反應時間較短，為3min-8min，整個衍生化實驗操作可在10min內完成， 減少了樣品流失，提高了檢測效率和準確度； (3)無需加入催化劑，進一步簡化了衍生化反應體系，降低了實驗成本；
(4)在上述條件下，本發明可以將四種環境雌激素El、 E2、 EE2、 E3同時衍生化，衍 生化產物分別為TMS-El、di-TMS-E2、di-TMS-EE2、tri-TMS-E3，無副產物生成。各衍生化產 物的線性相關性良好，為0. 99462-0. 99942，線性范圍為lpg/P L-100ng/y L，儀器檢出限 可達0. 5pg/u L。 本發明可以應用于水體、底泥、生物等樣品中環境雌激素El、 E2、 EE2、 E3的GC-MS 檢測。
圖1是環境雌激素E1、E2、EE2、E3未衍生化時GC-MS檢測的全掃描色譜圖(濃度 為10ng/ ii L)。 圖2是環境雌激素El 、 E2、 EE2、 E3 (濃度為10ng/ y L)衍生化產物TMS-E1 、 di-TMS-E2、 di-TMS-EE2、 tri_TMS_E3經GC-MS檢測的全掃描色譜圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例進一步說明本發明的實質內容，但本發明的內容并不限于此。
實施例1 : 1、首先取100iiL含有一定濃度(10pg/iiL)El、 E2、 EE2、 E3的標準混合溶液于 1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮吹儀，通入高純氮氣緩慢吹干。 2、加入15iiLBSTFA和30iiL吡啶，振蕩混合后，置于常溫環境中(20°C )反應 3min。 3、取出冷卻至室溫，放入氮吹儀中，通入高純氮氣緩慢吹干，加入90ii L進樣溶劑 和10 ii L濃度為lng/ y L的內標(雄烷)，振蕩混合后，取1 y L注入GC-MS分析(SIM模 式)。 經檢測，El、 E2、 EE2、 E3已被全部衍生化，衍生化產物分別為TMS-E1、 di-TMS-E2、 di-TMS-EE2、tri-TMS-E3，無副產物生成，RRF(相對響應因子RelativeResponse Factor,待測物峰面積與內標峰面積的比值)分別為1. 22、 1. 09、0. 09、0. 12。
實施例2 : 1、首先取100iiL含有一定濃度(10ng/iiL)El、 E2、 EE2、 E3的標準混合溶液于 1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮吹儀，通入高純氮氣緩慢吹干。 2、加入30iiLBSTFA和50iiL吡啶，振蕩混合后，置于常溫環境中(20°C )反應 5min。 3、取出冷卻至室溫，放入氮吹儀中，通入高純氮氣緩慢吹干，加入90ii L進樣溶劑 和10 ii L濃度為lng/ y L的內標(雄烷)，振蕩混合后，取1 y L注入GC-MS分析(SIM模 式)。 經檢測，El、 E2、 EE2、 E3已被全部衍生化，衍生化產物分別為TMS-E1、 di-TMS_E2、 di-TMS-EE2、 tri_TMS_E3，無副產物生成，RRF分別為1157. 76、 1074. 82、 146. 65、 187. 13。
實施例3 : 1、首先取100 ii L含有一定濃度(8pg/ ii L)E1、E2、EE2、E3的標準混合溶液于1. 5mL 色譜瓶中，將色譜瓶放入氮吹儀，通入高純氮氣緩慢吹干。 2、加入15iiLBSTFA和20 ii L吡啶，振蕩混合后，放入恒溫加熱箱，在30°C反應 3min。 3、取出冷卻至室溫，放入氮吹儀中，通入高純氮氣緩慢吹干，加入90ii L進樣溶劑 和10 ii L濃度為lng/ y L的內標(雄烷)，振蕩混合后，取1 y L注入GC-MS分析(SIM模 式)。 經檢測，El、 E2、 EE2、 E3已被全部衍生化，衍生化產物分別為TMS-E1、 di-TMS-E2、 di-TMS-EE2、 tri-TMS-E3，無副產物生成，RRF分別為0. 99、0. 88、0. 06、0. 08。
實施例4 : 1、首先取100iiL含有一定濃度(83pg/iiL)El、 E2、 EE2、 E3的標準混合溶液于 1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮吹儀，通入高純氮氣緩慢吹干。 2、加入30 ii LBSTFA禾P 50 ii L吡啶，振蕩混合后，放入恒溫加熱箱，在30°C反應 5min。 3、取出冷卻至室溫，放入氮吹儀中，通入高純氮氣緩慢吹干，加入90ii L進樣溶劑 和10 ii L濃度為lng/ y L的內標(雄烷)，振蕩混合后，取1 y L注入GC-MS分析(SIM模 式)。 經檢測，El、 E2、 EE2、 E3已被全部衍生化，衍生化產物分別為TMS-E1、 di-TMS-E2、 di-TMS-EE2、 tri-TMS-E3，無副產物生成，RRF分別為9. 67、8. 94、 1. 16、 1. 49。
實施例5 : 1、首先取100ii L含有一定濃度(365pg/ii L)E1、 E2、 EE2、 E3的標準混合溶液于 1. 5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮吹儀，通入高純氮氣緩慢吹干。 2、加入50 ii LBSTFA禾P 60 ii L吡啶，振蕩混合后，放入恒溫加熱箱，在50°C反應 8min。 3、取出冷卻至室溫，放入氮吹儀中，通入高純氮氣緩慢吹干，加入90ii L進樣溶劑 和10 ii L濃度為lng/ y L的內標(雄烷)，振蕩混合后，取1 y L注入GC-MS分析(SIM模 式)。
8
經檢測，El、 E2、 EE2、 E3已被全部衍生化，衍生化產物分別為TMS-E1、 di-TMS-E2、 di-TMS-EE2、 tri-TMS-E3，無副產物生成，RRF分別為42. 32、39. 25、5. 30、6. 77。
權利要求
環境雌激素的衍生化方法，其特征在于包括如下步驟(1)首先取100μL含有雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔基雌二醇的標準混合溶液于1.5mL色譜瓶中，將色譜瓶放入氮吹儀，通入高純氮氣緩慢吹干；(2)加入N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺和吡啶，振蕩混合后，置于常溫環境中或放入恒溫加熱箱，在20℃～50℃下反應3min～8min，得到衍生化產物；(3)取出冷卻至室溫，放入氮吹儀中，通入高純氮氣緩慢吹干，加入90μL進樣溶劑和10μL濃度為1ng/μL的內標即雄烷，振蕩混合后，取1μL注入氣相色譜-質譜聯用儀分析。
2. 如權利要求l所述的環境雌激素的衍生化方法，其特征在于所述步驟(1)中，環境 雌激素雌酮、17 3-雌二醇、雌三醇、17 0-乙炔基雌二醇分別用El、 E2、 E3、 EE2表示，El、 E2、 E3、 EE2為固體，純度為97 %以上，溶于甲醇中配成標準混合溶液，密封后置于_20°C 以下保存，甲醇為色譜純，含有雌酮、17|3-雌二醇、雌三醇、17 0-乙炔基雌二醇為lpg/11 H00ng/ ii L。
3. 如權利要求1所述的環境雌激素的衍生化方法，其特征在于所述步驟(1)和(3) 中，高純氮氣純度為99. 99%以上；在氮吹儀中吹干時無需加熱，常溫條件下即可。
4. 如權利要求1所述的環境雌激素的衍生化方法，其特征在于所述步驟(2)中，N， 0_雙三甲基硅基三氟乙酰胺級別為衍生化級，純度大于98%，用量為15iiL-50iiL;吡啶為 色譜純，用量為30ii L-60ii L。
5. 如權利要求l所述的環境雌激素的衍生化方法，其特征在于所述步驟(2)中，反應 溫度為20°C 50°C ;反應時間比較短，為3min 8min ;加熱方式是恒溫干燥加熱，振蕩混 合時間為20s 60s。
6. 如權利要求1所述的環境雌激素的衍生化方法，其特征在于所述步驟(3)中，進樣 溶劑為色譜純級高純有機溶劑，可以是甲醇、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯或正己烷；振蕩混合 時間為20s 60s。
7. 如權利要求2所述的環境雌激素的衍生化方法，其特征在于所述步驟(3)中，El、 E2、 EE2、 E3的衍生化產物分別為TMS-E1 (雌酮單羥基衍生化產物)、di-TMS-E2 (17 P -雌 二醇雙羥基衍生化產物)、di-TMS-EE2 (17 a -乙炔基雌二醇雙羥基衍生化產物)、 tri-TMS-E3 (雌三醇三羥基衍生化產物)。
8. 如權利要求1所述的環境雌激素的衍生化方法，其特征在于所述步驟(3)中，氣相 色譜_質譜聯用儀所用色譜柱為Supelco SPB -5或者J&WScientif ic DB-5MS毛細管柱； 氣相色譜儀以氦氣為載氣，流速為lmL/min ;不分流方式進樣，進樣口溫度為28(TC，進樣體 積1PL;升溫程序如下<formula>formula see original document page 2</formula>
9. 如權利要求1所述的環境雌激素的衍生化方法，其特征在于所述步驟(3)中，質譜儀接口溫度為28(TC，傳輸線溫度為30(TC，離子源溫度為250°C，電離方式為電子轟擊電 離，即EI，電子轟擊能量為70eV，溶劑延遲時間為12min。
10. 如權利要求l所述的環境雌激素的衍生化方法，其特征在于所述步驟(3)中，氣 相色譜-質譜聯用儀以全掃描模式定性，掃描范圍m/z 50 600，定量采用選擇離子掃描模式，即SIM模式；在SIM模式下，TMS-El、 di-TMS-E2、 di-TMS_EE2、 tri_TMS_E3分別選取m/ z342、327、285， m/z416、401、285， m/z440、425、285， m/z504、489、285作為特征碎片離子，掃 描時間為0. 5s-0. 7s。
全文摘要
本發明公開了環境雌激素(雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔基雌二醇)的衍生化方法，是氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)用于分析此類物質的樣品前處理方法和核心技術。其步驟是首先取含有環境雌激素的標準混合溶液于常溫下通入高純氮氣吹干，加入衍生化試劑N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)和吡啶，在室溫(20℃)-50℃下反應，得到衍生化產物，吹干后加入進樣溶劑和內標，取樣分析。該方法具有實驗操作簡便、省時、能耗和成本低的優點，可以將以上四種環境雌激素同時衍生化，無副產物生成，各衍生化產物的線性相關性良好，儀器檢出限可達0.5pg/μL。本發明可應用于水體、底泥、生物等樣品中環境雌激素的GC-MS檢測。
文檔編號G01N30/00GK101696962SQ20091009509
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月26日 優先權日2009年10月26日
發明者劉晶靚, 方鍇, 潘學軍, 王宇, 高建培, 黃斌 申請人:昆明理工大學;