專利名稱：藍舌病病毒快速檢測試紙條及制備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其是一種用于檢測藍舌病病毒抗原的快速檢測試紙條，以 及這種快速檢測試紙條的制備方法。
技術背景藍舌病(Bluetongue disease, BLU)是由呼腸孤病毒科(reoviridae)環狀病毒屬(Obiviras genus)的藍舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的一種烈性動物傳染病，由庫蠓傳播， 主要危害綿羊、山羊、牛等家畜，并在世界范圍內廣泛流行，世界動物衛生組織(World organisation for animal health, OIE)將BLU列為重要動物傳染病。在很多國家動物貿易協定 中，BLU是必須進行檢疫的傳染病之一。近年來，隨著氣候變暖，BLU在歐洲許多國家的發 病率增加，嚴重影響著國際動物貿易。BTV共有24個血清型，BTV基因組含有10個雙鏈RNA片段(dsRNA)，由19218bp組 成，編碼7種結構蛋白(VP1-VP7)和4種非結構蛋白(NS1、 NS2、 NS3和NS3A)， 7種 結構蛋白的4種形成雙層蛋白衣殼，外殼主要由VP2和VP5構成，而內殼主要由VP3和VP7 構成。VP2是病毒型特異性抗原和血凝蛋白，誘導產生中和抗體，還與病毒的毒力和細胞吸 附作用有關。VP5也與中和抗體的產生和病毒毒力有關。VP7是核芯衣殼表面殼粒的主要成 分，約占病毒總蛋白的1/ 3 ，是病毒可溶性群特異性抗原。在BLU檢測方法中，瓊脂擴散 試驗(Agar Gel Imm皿o Diffiision， AGID)因其操作簡便、成本低而在世界范圍內被廣泛推廣 應用，也是迄今OIE推薦使用的方法之一，但該方法使用的抗原與相關病毒如鹿流行性出血 病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus of deer， EHDV)存在一定的交叉反應性，所以AGID 檢測的特異性較差。中國專利申請號200810231379.1公開了一種"藍舌病病毒檢測試紙條"，包括支撐層、 附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層是由樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層 及吸水層依次拼接而成，所述纖維素膜層上標記有用藍舌病病毒抗體溶液印制的隱形檢測印 跡，纖維素膜層上還標記有用羊抗小鼠、兔抗小鼠、羊抗牛或兔抗牛IgG溶液印制的隱形對 照印跡，所述金標抗體纖維層上附著有與隱形檢測印跡對應的以膠體金標記的抗藍舌病病毒的多克隆抗體或單克隆抗體。中國專利申請號200810226505.4公開了一種"藍舌病病毒抗原 的ELISA檢測方法及試劑盒"，是用抗藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體作為包被及酶標抗 體的雙抗夾心ELISA檢測方法。該試劑盒包括作為包被及酶標抗體的抗藍舌病病毒VP7蛋白 的單克隆抗體。中國專利申請號200810223912.X公開了一種"藍舌病病毒的生物條形碼檢測 方法"，是以藍舌病病毒的VP7蛋白作為檢測對象進行的生物條形碼檢測方法。所述MMP 探針包被有抗VP7蛋白的單克隆抗體，NP探針包被有抗VP7蛋白的多克隆抗體。所述對藍 舌病病毒進行生物條形碼檢測的條形碼DNA鏈具有序列表中SEQ ID No: 1的核苷酸序列， 互補探針NP鏈具有序列表中SEQ ID No: 2的核苷酸序列。競爭酶聯免疫吸附試驗(c-ELISA)可將藍舌病與相關病毒病區別，而雙抗體夾心法 ELISA可直接進行病毒抗原的檢測。目前，研制快速、便捷、適合于口岸檢疫和現場診斷的檢測試紙條，在藍舌病的快速診 斷、檢疫和流行病學調査中具有更重要的應用價值。 發明內容本發明的目的是提供一種直接檢測藍舌病病毒抗原的藍舌病病毒快速檢測試紙條。 本發明的另一目的是提供這種檢測試紙條的制備方法。本發明所述的藍舌病病毒快速檢測試紙條由樣品吸收墊、硝酸纖維膜、吸水墊和底板構 成，樣品吸收墊、硝酸纖維膜、吸水墊依次排列固定在底板上，樣品吸收墊為呈線性排列的 固定于不透水材料上的多孔纖維，其上載有膠體金墊，膠體金墊為藍舌病病毒VP7蛋白的單 克隆抗體和膠體金的結合物，檢測線位于所述的硝酸纖維膜上，其上包被或噴上藍舌病病毒 多克隆抗體，對照線位于所述的硝酸纖維膜上，其上包被或噴上protein A。上述的不透水材料為PVC,所述的多孔纖維為玻璃纖維。本發明的檢測藍舌病病毒抗原快速診斷試紙條僅與BTV病毒抗原發生特異性免疫反應， 呈現明顯的檢測線和對照線，而與其它相關病毒(如EHDV、 AKV、 VSV、 PPRV等)沒有 任何免疫反應，不出現檢測線，只出現對照線。本發明所述的藍舌病病毒快速檢測試紙條的制備方法由以下步驟組成一、藍舌病病毒VP7蛋白單克隆抗體的制備用純化的藍舌病病毒免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，用間接ELISA方法檢測分泌抗BTVVP7 蛋白的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，用BALB/c小鼠制備單抗腹水；二、 膠體金的燒制和待標記單抗的準備用檸檬酸鈉還原法燒制直徑20nm 50nm膠體 金顆粒，取-2(TC保存的純化好的藍舌病病毒的VP7蛋白的單克隆抗體，將其濃度調整為 lmg/mL， 4'C保存備用；三、 膠體金標記抗體最適穩定量的測定將準備好的待標記單克隆抗體做系列稀釋為 5pg/mL 90ixg/mL，分別取lmL，加入每管lmL分裝好金膠溶液中，以測定最適標記量；四、 抗體的膠體金標記將2mg藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體溶于lOOmL膠體金 溶液，在電磁攪拌器攪拌下，緩慢將單克隆抗體溶液加入膠體金溶液中進行標記；五、 膠體金標記抗體的純化標記好單克隆抗體的膠體金溶液純化后，于含1%牛血清 白蛋白和含0.02%NaN3的0.02mol/L pH8.2 Tris-HCl緩沖液中重懸為原體積的1 / 10， 4。C保 存備用；六、 膠體金標記抗體吸附玻璃纖維用0.02 mol/LpH8.6 TBS稀釋金標單克隆抗體，吸附 于玻璃纖維濾紙上，制成了吸附有膠體金標記抗體的玻璃纖維；七、 檢測線和控制線的印跡在硝酸纖維膜上設定出檢測線和對照線位置，用噴膜機分 別在其所在位置噴上2.5mg/L的藍舌病多克隆抗體和protein A形成檢測線和對照線。八、 膠體金標記試紙條的組裝在PVC底板上按順序組合樣品吸收墊、吸附有膠體金標 記單克隆抗體的玻璃纖維、包被有檢測線和對照線的硝酸纖維膜和吸水墊制備成檢測試紙條， 裝入塑料外殼的檢測卡內。上述的步驟一中，藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體制備過程為藍舌病病毒的純化，用BTV病毒接種BHK-21細胞長成單層，收獲的細胞培養病毒液反復凍融3次，以8000r/min離心30min，取上清液，超速離心和不連續蔗糖密度梯度離心，收獲提純的病毒條帶，用核酸蛋白分析儀測定蛋白含量為3.268g/L， -20°〇保存備用；用提純的藍舌病抗原加等體積弗氏完全佐劑乳化，和弗氏不完全佐劑乳化，免疫BALB/c小鼠三次；取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50%聚乙二醇(MW4000)融合劑下融合，HAT篩選培養基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA方法檢測分泌抗BTV VP7蛋白的陽性孔；用有限稀釋法進行細胞克隆，經間接ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩定傳代并分泌抗BTV VP7蛋白的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞；將獲得的分泌抗BTV VP7蛋白的特異性單克隆抗體雜交瘤細胞注射入BALB/c小鼠腹腔制備單抗腹水；采集單克隆抗體腹水，測定抗體效價、蛋白含量和親和力，腹水ELISA效價高達為l: 512000，用核酸蛋白分析儀測定純化腹水IgG的含量為1.97 g/L。親和力分 常數高達5.41xl07mol/L。用間接ELISA方法鑒定制備的單克隆抗體僅與藍舌病病毒及其 VP7蛋白有特異性免疫反應，而與其它相關病毒(如EHDV、 AKV、 VSV、 PPRV等)沒有 任何免疫反應。上述的步驟四中，制備藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體和制備膠體金標記抗體溶液的 過程為將2mg藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體溶于100mL膠體金溶液中，再在其中加 入5%的牛血清白蛋白使其終濃度為1%， 4。C靜置2 4h，棄沉淀物，將膠體金溶液離心處理， 棄去上清，將沉淀用含0.01 0.06%疊氮鈉，0.02mol/LpH8.2Tris-HCl緩沖液稀釋為原體積的 10%;將膠體金溶液浸入玻璃纖維至液體開始滲出為止而形成金標抗體層，然后將玻璃纖維 在室溫溫度干燥。七即制成了吸附有膠體金標記抗體的玻璃纖維。上述的步驟七中，在硝酸纖維膜上設定出檢測線和對照線位置，用噴膜機分別在其所在 位置噴上2.5mg/L的藍舌病多克隆抗體和protein A形成檢測線和對照線，按2 u L/lcm設置 噴膜量，噴膜37。C干燥，2h，再用0.01mol/L 『.2含3%牛血清白蛋白的？83，在37'G下 封閉45min， 0.01mol/L pH7.0的PBS漂洗，再將硝酸纖維膜室溫下干燥，將硝酸纖維膜貼于 不透水材料上，再將浸潤有金標混合溶液的多孔纖維材料和另一個多孔纖維材料分別貼于不 透水材料上并使兩者位于硝酸纖維膜的兩端，在浸潤有金標混合溶液的多孔纖維材料上且不 與硝酸纖維膜相連的一端設置另一塊多孔吸水材料，以制成手柄和吸水墊。藍舌病病毒抗原快速診斷試紙條制備過程:在制備好藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體、 藍舌病病毒多克隆抗體、proteinA和膠體金后即可進行試紙條的制備，其過程如下將2mg 藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體溶于lOOmL膠體金溶液中，再在其中加入5%的牛血清白 蛋白使其終濃度為1%， 4"靜置2 4h，棄沉淀物，將膠體金溶液離心處理，棄去上清，將 沉淀用含0.01 0.06%疊氮鈉，0.02mol/LpH8.2Tris-HCl緩沖液稀釋為原體積的10%;將膠體 金溶液浸入玻璃纖維至液體開始滲出為止而形成金標抗體層，然后將玻璃纖維在室溫溫度干 燥。即制成了吸附有膠體金標記抗體的玻璃纖維。基于硝酸纖維膜上的檢測線和控制線的印 跡在硝酸纖維膜上設定出檢測線和對照線位置，用噴膜機分別在其所在位置噴上2.5mg/L 的藍舌病多克隆抗體和protein A形成檢測線和對照線，按2 u L/lcm設置噴膜量，噴膜37°C 干燥，2h，再用0.01mol/LpH7.2含3%牛血清白蛋白的PBS，在37。C下封閉45min， 0.01mol/L pH7.0的PBS漂洗，再將硝酸纖維膜室溫下干燥，將硝酸纖維膜貼于不透水材料上，再將浸潤有金標混合溶液的多孔纖維材料和另一個多孔纖維材料分別貼于不透水材料上并使兩者位 于硝酸纖維膜的兩端，在浸潤有金標混合溶液的多孔纖維材料上且不與硝酸纖維膜相連的一 端設置另一塊多孔吸水材料，以制成手柄和吸水墊。本發明的優點在于本發明提供的檢測藍舌病病毒抗原快速診斷試紙條特異性強，敏感 性高，檢測快速，可于10分鐘內觀察結果，特別適用于口岸檢疫、野外和現場檢疫。本發明 能夠直接、快速對藍舌病病毒抗原做出檢測，而且不需要特殊的設備，也無需專門的技術人 員。
圖1為本發明示意圖。圖中l一樣品吸收墊，2—膠體金墊，3—硝酸纖維膜，4一檢測線(T線)，5—對照線 (C線)，6—吸水墊，7—底板。
具體實施方式
1、藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體制備過程(1) BHK-21細胞長成單層后接種BTV， 37t反應lh。加入無血清的基礎培養基繼續 培養，2 3d后細胞病變(CPE)達75%以上時，收獲病毒。將收獲的病毒液反復凍融3次， 以8000r/min離心30 min，取上清液。以28000r/min4。C超速離心3h。沉淀用1/100原體積的 PBS溶解，然后采用20%、 60% (w/v)不連續蔗糖密度梯度20000r/min4。C超速離心3h，收 獲提純的病毒條帶作為免疫抗原，用DU800核酸蛋白分析儀測定蛋白含量，-20'C保存備用。(2) 用提純的藍舌病病毒首次免疫BALB/c鼠后，每隔2周免疫1次，共免疫3次， 注射劑量分別100嗎、100嗎和200嗎。首免時加等體積弗氏完全佐劑乳化，二免和三免時加 等體積弗氏不完全佐劑乳化。三免后第15d，斷尾采血分離血清，用間接ELISA檢測抗BTV 血清抗體效價。于融合前3d，通過尾靜脈注射BTV強化免疫一次，劑量為100ng。(3)用間接ELISA篩選陽性克隆，分別用BHK細胞增殖的BTV病毒、VP7基因工程 表達抗原和BHK細胞建立間接ELISA。首先用DU 800核酸蛋白分析儀測定各種抗原的蛋白 濃度。再用方陣滴定法確定最佳包被抗原濃度，并對包被時間及溫度進行優化。3種ELISA 方法分別命名為BTV-ELISA、 BTV VP7-ELISA和BHK-ELISA，這3種ELISA方法用于對 雜交瘤細胞培養上清進行篩選，以獲得抗BTV VP7的單克隆抗體陽性克隆。/c鼠腹腔制備大量單抗腹水取12周齡左右BALB /C 小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7d后腹腔注入5 10xl()S個雜交瘤細胞，注射后7 10d可見 小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000r/min離心5min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水， 測定抗體效價，分裝后-8(TC凍存備用。(5)采集單克隆抗體腹水，測定抗體的特異性、效價、蛋白含量和親和力，腹水ELISA 效價高達為l: 512000，用核酸蛋白分析儀測定純化腹水IgG的含量為1.97 g/L，親和力分 常數高達5.41xl()7mol/L。用BTV-ELISA、 VP7-ELISA和BHK-ELISA同時進行特異性檢領!l ， 制備的單克隆抗體僅與BTV病毒和BTVVP7蛋白抗原有特異性免疫反應，而與其它相關病 毒(如EHDV、 AKV、 VSV、 PPRV等)沒有任何免疫反應。(6)采用硫酸銨沉淀法和柱層析法進行藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體純化。2、藍舌病病毒抗原快速檢測試紙條制備(1) 用去離子雙蒸水配制1%的氯化金水溶液，取1X的氯化金水溶液lmL,加雙蒸水 99mL配置成0.01^的氯化金水溶液100mL。加熱至沸騰，迅速加入濃度為1%檸檬酸三鈉水 溶液lmL，繼續煮沸，同時觀察液體顏色變化情況，當煮沸約5 8min液體出現透明的酒紅 色時終止反應。用電鏡測定制備的膠體金顆粒的大小及其形狀，大約為20nm 50nm。待冷 卻后用0.1mol/LK2CO2或0.1N HC1調整膠體金的pH值至8.2 8.6， 4。C避光保存。(2) 膠體金顆粒平均直徑的測定用支持膜的鎳網(銅網也可)蘸取金標蛋白試劑，自 然干燥后直接在透射電鏡下觀察，或用醋酸鈾復染后觀察。計算100個金顆粒的平均直徑。 平均直徑達到20nm 50nm。(3) 待標記藍舌病病毒VP7蛋白單克隆抗體的準備取-2(TC保存的純化好的藍舌病病 毒的VP7蛋白的單克隆抗體，將其預先對0.005mol/L pH7.0NaCl溶液中4'C透析過夜，以除 去多余的鹽離子，于15000r/min離心20min，取上清，去除聚合物，測定蛋白質濃度，并將 抗體濃度調整為lmg/mL， 4'C保存備用。(4) 膠體金與標記單克隆抗體最適用量之比的測定將用0.1mol/L K2CO2或0.1N HC1調整好pH值(8.2 8.6)的膠體金，分裝10管，每管lmL;將準備好的待標記單克隆抗體做系列稀釋為5tig/mL 90ng/mL)，分別取lmL，加入以上分裝好金膠溶液的Eppendorf管中，混勻；對照管不加單克隆抗體，只加lmL稀釋液。5min后，在上述各管中加入O.lmL 10%(w/v)的NaCl溶液，充分混勻后靜置2h，觀察結果。對照管(未加單克隆抗體)和加入單克隆抗體的量不足以穩定膠體金的各管，均呈現出由紅變藍的聚沉現象，而加入單克隆抗體量達到或超過最低穩定量的各管仍保持紅色不變；以穩定lmL膠體金溶液紅色不變的最低單克隆抗 體用量，即為該標記單克隆抗體的最佳用量。取加入單克隆抗體濃度最低而染色沒有發生變 化的管為最適標記量，在此基礎上再補加10%(V/V)濃度為lmg/mL的單克隆抗體溶液，即 為穩定膠體金所需抗體實際用量。(5) 膠體金與藍舌病病毒VP7單克隆抗體的結合與標記將2mg藍舌病病毒VP7蛋白 的單克隆抗體溶于100mL膠體金溶液中。在電磁攪拌器攪拌下，緩慢將單克隆抗體溶液加入 膠體金溶液中，2mg的抗體大約用10min加完，加完后繼續攪動30min,繼續加入過濾除菌 的5%牛血清白蛋白溶液，使其終濃度達到1%，再緩慢攪動20min后，4'C靜置2 4h，棄沉 淀物，用0.45 y M濾膜過濾膠體金標記的單抗溶液。(6) 膠體金標記單克隆抗體的純化以1500r/min將標記好單克隆抗體的膠體金溶液進 行離心15min,棄去凝聚的沉淀留上清。上清移入新的離心管后15000r/min于4""C離心30min， 棄上清留沉淀。沉淀物溶于含1 %牛血清白蛋白和含0.02%NaN3的0.02mol/LpH8.2 Tris-HCl 緩沖液中，將沉淀重懸為原體積的1 / 10， 4"C保存備用。(7) 膠體金標記抗體吸附玻璃纖維用0.02 mol/LpH8.6 TBS稀釋金標單克隆抗體，充 分混勻后，將lcmx5cm大小玻璃纖維濾紙浸入金標單抗溶液中，至液體開始從玻璃纖維中 滲出為止而形成金標抗體層，取出后陰干，即制成了吸附有膠體金標記抗體的玻璃纖維，裁 成5mmx5cm的長條備用。(8) 基于硝酸纖維膜上的檢測線和控制線的印跡在硝酸纖維膜上設定出檢測線和對照 線位置，用噴膜機分別在其所在位置噴上2.5mg/L的藍舌病多克隆抗體和protein A形成檢測 線和對照線，按2uL/lcm設置噴膜量，噴膜37。C干燥，2h，再用0.01mol/L pH7.2含3%牛 血清白蛋白的PBS，在37。C下封閉45min， 0.01mol/LpH7.0的PBS漂洗，再將硝酸纖維膜室 溫下干燥，將硝酸纖維膜貼于不透水材料上，再將浸潤有金標混合溶液的多孔纖維材料和另 一個多孔纖維材料分別貼于不透水材料上并使兩者位于硝酸纖維膜的兩端，在浸潤有金標混 合溶液的多孔纖維材料上且不與硝酸纖維膜相連的一端設置另一塊多孔吸水材料，以制成手 柄和吸水墊。(9) 藍舌病病毒抗原快速檢測試紙條的組裝揭開PVC底板上的不干膠后，貼上噴涂 有藍舌病多克隆抗體(檢測線，T線)和proteinA (對照線，C線)的硝酸纖維膜，將制備好 的吸附有膠體金標記單克隆抗體的玻璃纖維與硝酸纖維膜的檢測線一端連接并壓在硝酸纖維膜上后，粘貼在PVC底板上，在膠體金墊上覆蓋未吸附有膠體金的玻璃纖維作為樣品吸收墊，然后用厚的吸水墊作手柄并壓在硝酸纖維膜靠對照線線的一端，最后用切割機將試紙條切成 5mmx5cm即可(參見附圖)。檢測試紙條裝入塑料外殼的檢測卡內，檢測卡上貼上試紙條名 稱標簽，裝入鋁箔袋，放入干燥劑，抽氣密封，在鋁箔袋上貼上產品說明書。(10) 試劑組成和使用方法該藍舌病病毒快速檢測試紙條包括檢測卡(l塊)、緩沖液 (l瓶)、干燥劑(lg)、說明書(l份)、外包裝鋁箔袋(l個)。使用方法撕開外包裝，取出檢測板。取50^iL 100tiL樣品加入孔中，再滴加入緩沖液3滴，10min觀察結果。陽性結 果檢測線和對照線均出現有紫紅色條帶，說明血清中有BTV病毒抗原；陰性結果檢測線 無條帶出現，而且對照線出現有紫紅色條帶，說明血清中無BTV病毒抗原；無效結果如果 對照線無色帶，則檢測結果無效，標本應重新檢測。(11) 該藍舌病病毒快速檢測試紙條對出入境檢驗檢疫相關實驗室提供的200份樣品進 行檢測，結果顯示，陰陽性成立，陽性兩條帶，陰性一條帶，結果與其它經典方法檢測結果 基本一致。上述具體實施例的實驗數據表明，本發明的藍舌病病毒抗原快速檢測試紙條，不僅特異 性強，敏感性高，穩定，操作簡便，而且制備方法簡單。使用快捷迅速，可在10min之內得 出結果，安全簡便，不需任何儀器和設備，成本低廉，所需試劑和樣本量少。特別適合用于 出入境口岸和基層檢疫部門藍舌病的現場快速診斷、檢測、檢疫和流行病學調査。
權利要求
1、一種藍舌病病毒快速檢測試紙條，七特征在于由樣品吸收墊(1)、硝酸纖維膜(3)、吸水墊(6)和底板(7)構成，樣品吸收墊(1)、硝酸纖維膜(3)、吸水墊(6)依次排列固定在底板(7)上，樣品吸收墊(1)為呈線性排列的固定于不透水材料上的多孔纖維，其上載有膠體金墊(2)，膠體金墊(2)為藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體和膠體金的結合物，檢測線(4)位于所述的硝酸纖維膜上(3)，其上包被或噴上藍舌病病毒多克隆抗體，對照線(5)位于所述的硝酸纖維膜(3)上，其上包被或噴上proteinA。
2、 根據權利要求1所述的藍舌病病毒快速檢測試紙條，其特征在于所述的不透水材料為 PVC。
3、 根據權利要求l所述的藍舌病病毒快速檢測試紙條，其特征在于所述的多孔纖維為玻 璃纖維。
4、 根據權利要求1所述的藍舌病病毒快速檢測試紙條的制備方法，其特征在于包括以下 步驟-一、 藍舌病病毒VP7蛋白單克隆抗體的制備用純化的藍舌病病毒免疫BALB/c小鼠三 次；取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，用間接ELISA方法檢測分泌抗BTV VP7 蛋白的特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，用BALB/c小鼠制備單抗腹水；二、 膠體金的燒制和待標記單抗的準備用檸檬酸鈉還原法燒制直徑20nm 50nm膠體 金顆粒，取-2(TC保存的純化好的藍舌病病毒的VP7蛋白的單克隆抗體，將其濃度調整為 lmg/mL， 4'C保存備用；三、 膠體金標記抗體最適穩定量的測定將準備好的待標記單克隆抗體做系列稀釋為 5lag/mL 90pg/mL，分別取lmL，加入每管lmL分裝好金膠溶液中，以測定最適標記量；四、 抗體的膠體金標記將2mg藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體溶于100mL膠體金 溶液，在電磁攪拌器攪拌下，緩慢將單克隆抗體溶液加入膠體金溶液中進行標記；五、 膠體金標記抗體的純化標記好單克隆抗體的膠體金溶液純化后，于含1%牛血清 白蛋白和含0.02%NaN3的0.02mol/L pH8.2 Tris-HCl緩沖液中重懸為原體積的1 / 10， 4。C保 存備用；六、 膠體金標記抗體吸附玻璃纖維用0.02 mol/LpH8.6 TBS稀釋金標單克隆抗體，吸附 于玻璃纖維濾紙上，制成了吸附有膠體金標記抗體的玻璃纖維；七、 檢測線和控制線的印跡在硝酸纖維膜上設定出檢測線和對照線位置，用噴膜機分 別在其所在位置噴上2.5mg/L的藍舌病多克隆抗體和protein A形成檢測線和對照線。八、 膠體金標記試紙條的組裝在PVC底板上按順序組合樣品吸收墊、吸附有膠體金標 記單克隆抗體的玻璃纖維、包被有檢測線和對照線的硝酸纖維膜和吸水墊制備成檢測試紙條, 裝入塑料外殼的檢測卡內。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域。本發明所述的藍舌病病毒快速檢測試紙條由樣品吸收墊1、硝酸纖維膜3、吸水墊6和底板7構成，樣品吸收墊、硝酸纖維膜、吸水墊依次排列固定在底板上，樣品吸收墊為呈線性排列的固定于不透水材料上的多孔纖維，其上載有膠體金墊，膠體金墊為藍舌病病毒VP7蛋白的單克隆抗體和膠體金的結合物，檢測線4位于所述的硝酸纖維膜上，其上包被或噴上藍舌病病毒多克隆抗體，對照線5位于所述的硝酸纖維膜上，其上包被或噴上proteinA。本發明所述的試紙條特異性強，敏感性高，檢測快速，可于10分鐘內觀察結果，特別適用于口岸檢疫、野外和現場檢疫。本發明能夠直接、快速對藍舌病病毒抗原做出檢測，而且不需要特殊的設備，也無需專門的技術人員。
文檔編號G01N33/577GK101598729SQ20091009475
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月23日 優先權日2009年7月23日
發明者盧體康, 呂建強, 曹琛福, 曾少靈, 楊俊興, 楊建明, 林慶燕, 秦智鋒, 花群義, 阮周曦, 兵 陳, 虹 陶 申請人:花群義