專利名稱：：勻相溶膠顆粒型胱抑素c測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒及其制備方法，更具體地，涉及用于測定血清或血漿中胱抑素c的勻相溶膠顆粒型胱抑素c免疫測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：胱抑素C(CystatinC)是一種低分子量蛋白質，可由機體所有有核細胞產生，產生率恒定。循環中的胱抑素C僅經腎小球濾過而被清除，是一種反映腎小球濾過率變化的理想的內源性標志物，而腎小球的濾過率(glomerularfiltrationrate,GFR)是監測腎功能的一個重要指標，尤其對于腎移植的病人，快速準確的掌握腎小球濾過率的變化是十分重要的。此外由于胱抑素C分子量大于肌酐，且帶正電荷，所以它更容易反映腎小球濾過膜通透性的早期變化，可以在腎小球濾過率輕微降低時升高，較肌酐更敏感，作為腎功能試驗優于血清肌酐，具有重要的臨床應用價值。胱抑素C，是一種由120個氨基酸殘基組成的分子量僅13KD的低分子量分泌性蛋白質，是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成員之一。胱抑素C基因5'側翼序列與"看家基因"的啟動子區具有相同的特性，也屬于"看家基因"即此基因在所有組織恒定持續地轉錄及表達，無組織學特異性，廣泛地存在于各種體液中，如腦脊液、血液、唾液、精液等，機體胱抑素C產生率相當恒定。而胱抑素C是一種低分子量蛋白質，可經腎小球自由濾過，腎臟是清除循環中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C濃度主要由GFR決定，由此可見胱抑素C是一種理想的反映GFR變化的內源性標志物。臨床研究低分子量蛋白質(P2-微球蛋白、視黃醇結合蛋白、胱抑素C)濃度與GFR(51Cr-EDTA清除率或其金標準99mTc_DTPA清除率)的相關性，血清胱抑素C、肌酐濃度診斷異常GFR的敏感性分別為78.1%及57.1%，各自濃度倒數與GFR(51Cr_EDTA清除率)的相關系數分別為0.81和0.50(參見非專利文獻1)。表明胱抑素C是低分子量蛋白質中與GFR最相關的內源性標志物，甚至優于血清肌酐。血清P2-微球蛋白濃度由于在炎癥、腫瘤及免疫疾病時也可升高，故不是理想的GFR內源性標志物。而胱抑素C即使在炎癥狀態下，其產生率也不會改變，血清濃度受年齡、性別、疾病的病情變化的影響較小。說明胱抑素C的診斷準確性明顯優于血清肌酐。胱抑素C的檢測方法學經歷了大概4個階段的發展過程，從最初的單向免疫擴散到酶免疫測定，再到后來的膠乳增強法及勻相溶膠顆粒法等，幾種方法都屬于免疫檢測法。免疫濁度測定的基本原理是抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復合物，使反應液出現濁度。當反應液中保持抗體過量時，形成的復合物隨抗原量增加而增加，反應液的濁度亦隨之增加，與一系列的標準品對照，即可計算出待檢測物的含量。但含量低分子量小的抗原抗體復合物極難形成濁度，除非放置較長時間；如形成較大的復合物，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化的要求。于是發展了免疫膠乳濁度測定法，是在膠乳凝集定性試驗基礎上發展建立的一種非放射性均相免疫濁度測定法，其基本原理是將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當遇到相應抗原時，則使膠乳顆粒發生凝集。單個膠乳顆粒在入射光波之內不阻礙光線透過，兩個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過光減少，這種減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，當然也與待測抗原量呈正比，由此可測出標本中待測物的含量。這種方法會產生免疫沉淀。后來又出現了勻相溶膠顆粒免疫測定法，其基本原理是將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠體金顆粒上，當遇到相應抗原時，由于抗原抗體的相互作用使吸附抗體的膠體金顆粒發生凝聚。金顆粒凝聚后顏色由紅變藍，在波長540nm處吸光度會逐漸降低。而這種降低的程度與膠體金顆粒凝聚的程度呈正比，當然也與待測抗原量呈正比，由此可測出標本中待測物的含量。但是，目前的勻相溶膠顆粒免疫測定法，其分析靈敏度還不令人滿意，期待著進一步提高該方法的檢測靈敏度。由于血清中胱抑素C濃度較低，故其測定方法需較高的分析靈敏度及特異性。最早采用單向免疫擴散法(RID)及酶免疫測定法(EIA)對胱抑素C含量進行測定，而這兩種方法不僅費時，靈敏度也較差。較簡單且更靈敏的放射、熒光及各種酶免疫測定(RIA、FIA及EIA)的方法能改善胱抑素C測定的可靠性，但測定時間仍較長，無法常規應用，更無法用于急診測定。以上各種測定方法均屬非均相測定方法，很難自動化，因此限制了胱抑素C的廣泛臨床應用。采用上述的膠乳增強免疫均相測定方法，即在膠乳顆粒上包被抗體，與抗原結合時顆粒發生凝集，此方法很容易自動化。Kabanda等于1994年報道的測定胱抑素C的膠乳顆粒凝集法是一種顆粒計數免疫測定法(參見非專利文獻2)。KyhseAndersen等于同年報道了——禾中顆粒增強透射免疫比獨法(particle—enhancedturbidimetricimmimoassay，PETIA)，使胱抑素C測定的時間縮短至5分鐘左右，且可在自動生化分析儀上進行，使胱抑素C測定的常規應用成為可能(參見非專利文獻3)。Finney等在1997年報道了顆粒增強散射免疫比濁(particle-enhancedn印helometricimmunoassay,PENIA)，其原理是將抗人胱抑素C單克隆抗體標記在聚苯乙烯膠乳顆粒上，采用膠乳顆粒增強的免疫散射比濁度法來測定(參見非專利文獻4)。勻相溶膠顆粒免疫測定法(solparticleimmunoassays,SPIAs)最早是由Leuvering等提出的(參見非專利文獻5)，2004年Tanaka等對該方法作了改進，檢測范圍0.158mg/L(參見非專利文獻6)。該法反應時間短，可用于自動生化儀。就檢測靈敏度而言，RID法最差，而EIA、RIA及FIA法均優于PETIA、PENIA及SPIAs法。由于RTA法存在放射性污染，FIA法需昂貴的儀器，以及RIA、FIA、EIA法測定時間長，且不能全自動化，無法用于臨床大批量標本的測定。PETIA、PENIA及SPIAs法雖然檢測靈敏度差些，但仍可達0.15mg/L左右，遠遠低于健康人血清胱抑素C濃度(小于1.0mg/L)的下限值，可滿足臨床需要；這三種測定方法基本上不受血紅蛋白、膽紅素、類風濕因子、甘油三酯的影響，回收率可達95%109%，批內及批間變異系數均較小(<4.5%);但由于PETIA和PENIA兩種方法反應后會產生沉淀，不利于生化儀的清洗。而SPIAs法則不會產生沉淀。故在血清胱抑素C測定的常規臨床應用中可首選SPIAs法。Tanaka對SPIAs法進行了研究(非專利文獻6)，但其提出的方法的靈敏度仍有待提高。非專禾lj文獻1:NewmanDJ.SerumcysCmeasuredbyautomatedimmunoassay:amoresensitivemarkerofchangesinGFRthanserumcreatinine.KidneyInt.1995，47:312-318.非專利文獻2:KabamdaA.Determinantsoftheserumcon—centrationsoflowmolecularweightproteinsinpatientsonmaintenancehemodialysis.Kidneylnt.1994,45(6):16891696非專利文獻3:Kyhse，AndersenJ.SerumCystatinC，determinedbyarapid，automatedpartied—enhancedtirbidimetricmethod,isbettermakerthanserumcreatinineforglome皿larfiltrationtaer.ClinChem.1994,40(10):19211926非專利文獻4:Fi皿eyH.InitialevaluationofCystatinCmeasurementbyparticleenhancedimmunonephelometryontheBehringn印helometer2systems(BNA，BNII).ClinChem.1997,43(6):10161022非專禾U文獻5:LeuveringJHW.Solparticleimmunoassay(SPIA).^Immunoassay.1980，1:77_91.非專利文獻6:TanakaM.AsolparticlehomogeneousimmunoassayformeasuringserumcystatinC，ClinicalBiochemistry.2004，37:27_3
發明內容本發明要解決的問題是進一步提高測定胱抑素C含量時的分析靈敏度，提供一種特異性的高靈敏度的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，可以用于測定0.06mg/L8mg/L的胱抑素C含量。本發明的目的還在于提供上述試劑盒的制備方法。另外，本發明的目的還在于提供使用本發明勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒測定胱抑素C含量的方法。為了解決上述問題，本發明采用勻相溶膠顆粒免疫測定法(SPIAs)檢測血清或血漿中胱抑素C含量。采用標記于膠體金的抗胱抑素C的抗體，與待測標本中的胱抑素C發生凝聚反應使膠體金顏色發生變化，用540nm檢測這種變化，以胱抑素C標準品的標準曲線得出樣本中目標檢測物胱抑素C的濃度。本發明提供以下的技術方案。1.—種勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其用于測定胱抑素C的含量，該試劑盒包含試劑Rl和試劑R2，以體積比計，試劑Rl和試劑R2的含量比例為4:1，該試劑盒中任選地含有胱抑素C標準品，所述試劑R1為含有多聚物的緩沖溶液，所述試劑R2為結合有抗人胱抑素C抗體的膠體金的緩沖溶液，其中膠體金顆粒直徑為6585nm。2.根據權利要求1記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其中，所述膠體金顆粒直徑為7080nm。3.根據權利要求1或2記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其中，所述膠體金的緩沖溶液中，金含量為0.11.0mg/mL。4.根據權利要求13中任一項記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其中，試劑Rl中的所述多聚物的含量，以重量體積比g/ml計，為0.15.0%。5.根據權利要求14中任一項記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其中，所述多聚物包含PEG2萬或Brij-35中的至少任一種。6.根據權利要求15中任一項記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其中，試劑R1的pH值為6.58.5。7.權利要求16中任一項記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟5將多聚物溶解于緩沖液中，制成含有多聚物的緩沖溶液，即試劑Rl;使用氯金酸為原料制備膠體金溶液，溶液中的膠體金顆粒的粒徑為6585nm;將抗人胱抑素C抗體用緩沖液稀釋后，向其中加入上述膠體金溶液，使膠體金和抗人胱抑素C抗體結合，制成結合有抗人胱抑素C抗體的膠體金的緩沖溶液，根據需要進行純化，得到試劑R2。8.根據權利要求7記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒的制備方法，其中，使膠體金和抗人胱抑素C抗體結合的步驟中所用的緩沖液濃度為O.0040.02mol/L，緩沖液pH為7.58.5。9.根據權利要求8記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒的制備方法，其中，所述緩沖液為硼酸鹽緩沖液或HEPES緩沖液。10.—種胱抑素C含量測定方法，其特征在于，使用權利要求16中任一項記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒。使用本發明的方法靈敏度高保證能夠檢測極低水平(0.06mg/L)的胱抑素C，具有很高的臨床實用價值。另外，本發明的試劑盒為液體雙試劑，因此具有特異性好，靈敏度高，準確性好及抗干擾能力強等優點，可用于檢測血清或血漿中胱抑素C的濃度，適用于臨床全自動生化分析儀。圖1顯示6種不同含量的胱抑素C參考標準的標準曲線，每個點代表不同含量的胱抑素C參考標準，其中，x軸表示胱抑素C的含量，Y軸表示吸光度。圖2為分別采用本發明制備例1的試劑和對照試劑(市售的胱抑素C勻相溶膠顆粒免疫測定試劑，購自日本Alfresa公司)，采用奧林巴斯公司制造的AU400全自動生化分析儀對50份人血清進行測定，對測定值進行相關分析。其中X軸表示的是本發明制備例1的試劑測定的病人血清結果；Y軸表示的是胱抑素C試劑比較品測定的病人血清結果，相關系數R2=0.9922，回歸方程為y=0.9109x+0.05。具體實施例方式本發明的目的在于特異性地高靈敏度地測定胱抑素C含量，本發明中，在制備勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑時，通過選擇具有合適粒徑的膠體金顆粒，在用抗體標記膠體金時選擇合適的標記條件，實現了上述目的。具體來說，本發明提供一種特異的高靈敏度的能夠測定0.06mg/L8mg/L的胱抑素C含量的勻相溶膠顆粒免疫測定試劑盒，所述的試劑盒包含試劑Rl和試劑R2，以體積比計，試劑R1和試劑R2的含量比例為4:1。所述的試劑Rl為含有多聚物的緩沖液；所述的試劑R2為結合有抗人胱抑素C抗體的膠體金緩沖溶液。試劑Rl和試劑R2的pH值可以為6.58.5。在不影響本發明效果的范圍內，本發明的試劑R1中也可以含有適當的防腐劑，例如化&等，本發明的試劑R2中也可以含有適當的穩定劑，常用的穩定劑例如有胎牛血清(BSA)和PEG2萬，加入量分別可以是胎牛血清(BSA)終濃度0.52%和PEG2萬終濃度0.11%。所述膠體金顆粒直徑為優選為6585nm，進一步優選為7080nm，更進一步優選為7278nm，特別優選為7377nm。膠體金顆粒直徑如果小于65nm，會影響靈敏度，如果大于85nm，會使膠體金易形成沉淀，影響測定結果。本發明中，通過波譜掃描法，使用分光光度計，在37t:掃描膠體金溶液的最大吸收峰，根據該最大吸收峰來得到膠體金顆粒的粒徑。膠體金與IgG分子結合(即標記抗體)時所用的緩沖液的種類、濃度和pH值對標記結果影響較大，此時，通過選用合適的緩沖液，可以更好地實現本發明的技術效果。本發明中，標記抗體時所用的緩沖液的濃度優選為0.0040.02mol/L，更優選為0.0050.01mol/L，特別優選0.0050.008mol/L，pH值優選在7.09.0，更優選7.58.5，該緩沖液優選為硼酸鹽緩沖液或HEPES緩沖液，特別優選使用硼酸鹽緩沖液。本發明中，用0.005mol/L且pH值為8.0的硼酸鹽緩沖液效果最好。在本發明所述的勻相溶膠顆粒胱抑素C測定試劑盒試劑R1中，所述的多聚物包括分子量為2萬的聚乙二醇(以下簡記為"PEG2萬")、聚氧乙烯月桂醚(以下簡記為"Brij-35")等；在試劑R2中，結合有抗人胱抑素C抗體的膠體金溶液中，金含量為0.11.Omg/mL，優選為0.30.7mg/mL，更優選為0.40.6mg/mL，最優選為0.5mg/mL。試劑Rl中，所述的多聚物包括PEG2萬、Brij-35等，其含量為0.15.0%(g/ml);試劑2中抗人胱抑素C抗體與膠體金的標記采用物理吸附法來進行。在本發明所述的勻相溶膠顆粒胱抑素C測定試劑盒，其中還包括胱抑素C標準品。胱抑素C含量為0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.Omg/L的六個梯度標準品，所述標準品是添加有重組人胱抑素C純品的人血清或其它類似血清基質的液體，所述重組人胱抑素C純品可以通過公知的方法制備得到或者購買市售產品。所述標準品可以根據需要采用適當的梯度和常規方法來制備在本發明中，胱抑素C測定試劑盒中，除了上述用于標記時特別選用的緩沖液以外，作為可以用于試劑Rl和試劑R2的緩沖液，還可以使用但不限于TRIS緩沖液以及其它具有相似性質的緩沖液。緩沖液的pH值為6.59.0，更優選pH值為7.08.5。本發明中采用的勻相溶膠顆粒免疫測定法即SPIAs法的原理為吸附有胱抑素C抗體的大小適中、均勻一致的膠體金溶膠顆粒，當遇到相應抗原(胱抑素C)時，由于抗原抗體的相互作用使吸附抗體的膠體金顆粒發生凝聚。金顆粒凝聚后顏色由紅變藍，在波長540nm處吸光度會逐漸降低。而這種降低的程度與膠體金顆粒凝聚的程度呈正比，也與待測抗原量呈正比，測定特定波長下反應體系的顏色變化，通過標準曲線(該曲線為標準物濃度與色度關系曲線)即可測出目的檢測物的濃度。本發明中，采用自制的膠體金和胱抑素C抗體，標記后與待測標本(血清或血漿)中的胱抑素C發生結合反應，形成免疫復合物并使標記膠體金發生聚集顏色由紅變藍，用光透射強度檢測這種變化，以胱抑素C標準品的標準曲線得出樣本中目標檢測物胱抑素C的濃度。實施例實施例中的"重量體積比"，除特殊說明外均為"g/ml"。以下，制備本發明的檢測試劑及胱抑素C標準品。〈制備本發明檢測試劑及標準品所使用的主要原料>1.鼠抗人胱抑素C單克隆抗體(單抗)按照常規方法制造得到，該抗體僅與人胱抑素C反應，與其他抗原無免疫交叉反應，效價能夠滿足本試劑要求。2.氯金酸購自sigma公司，用于制備本發明中使用的膠體金。3.重組人胱抑素C蛋白按照常規方法制造得到，用于制備標準品。4.人胱抑素C標準液購自Dako公司，產品名X0974，濃度7.5mg/L，用于給標準品賦值。〈本發明胱抑素C標準品的制備>用重組人胱抑素C蛋白溶于類似人血清基質的溶液(0.9%NaCl，0.1%BSA，0.1%NaN3，50mmol/L的Tris-Hcl緩沖液pH8.0)，制備不同濃度的標準品。以Dako人胱抑素C標準液為原始標準，采用膠體金凝集反應法，分別對制備的標準品進行測定，分別檢測20次，求出均值達到標準品所要求的濃度，即0.0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0mg/L。〈本發明檢測試劑的制備>制備例11.本發明試劑Rl的配制向0.lmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)80ml中加入PEG2萬2g、Brij-350.5g和NaN30.lg，充分溶解后用蒸餾水將體積補充至100ml,用0.22ym的濾膜過濾，制成試劑Rl。該試劑Rl中，PEG2萬的含量為2%(重量體積比)，Brij-35的含量為0.5%(重量體積比)，NaN3的含量為0.1%(重量體積比)。由此制得本發明的試劑Rl。雖然，本制備例中的多聚物是PEG2萬和Brij-35兩者，但本發明試劑Rl中的多聚物也可以是PEG2萬或Brij-35中的任一種。2.本發明試劑R2的配制I.膠體金溶液的制備(1)配制0.01%的氯金酸(HAuCl4)水溶液，將1L該溶液加熱至沸。(2)攪動下準確加入lmllmol/L的NaOH溶液，2分鐘后準確加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5072H20)水溶液7ml。(3)繼續加熱煮沸15分鐘，觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變成灰色，繼而變成黑色，隨后逐漸變成深紅色并穩定。(4)冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至原體積即1L。(5)制成膠體金溶液，其中膠體金顆粒的粒徑約為75nm。II.單抗標記膠體金(1)膠體金與標記蛋白(單抗)用量之比的確定1)用0.2mol/LK2C03調節膠體金溶液的pH至8.0，分裝12管，每管lml。2)將標記單抗分別用0.005mol/L(pH8.0)硼酸鹽緩沖液稀釋至濃度為5iig/ml、10iig/ml、15iig/ml、20iig/ml、25ug/ml、30ug/ml、35ug/ml、40ug/ml、45ug/ml、50iig/ml、55iig/ml、60iig/ml，分別取0.lml，加入上述膠體金溶液中，混勻。對照管只加0.lml硼酸鹽緩沖液。3)5分鐘后，在上述各管中加入0.lml10%NaCl溶液，混勻后靜置2小時。4)結果觀察對照管(未加單抗)和加入單抗的量不足以穩定膠體金的各管，均會呈現出由紅變藍的聚沉現象；而加入蛋白量達到或超過最低穩定量的各管會仍保持紅色不變。以穩定lml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質用量作為該標記單抗的最低用量，根據情況，該用量可以適當增加10%20%。(2)膠體金與單抗(IgG)的結合(標記)1)用0.005mol/L(pH8.0)硼酸鹽緩沖液將單抗稀釋至40ug/ml。2)將100ml膠體金溶液和上述10ml單抗溶液分別以0.lmol/LK2C03調pH至8.0后，一邊電磁攪拌IgG溶液，一邊向其中加入膠體金溶液，完全加入后繼續攪拌10分鐘。3)加入適量穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀。本制備例中使用的穩定劑是胎牛血清(BSA)和PEG2萬。加入的量BSA終濃度為1%;PEG2萬終濃度為0.2%。III.標記IgG后膠體金溶液的純化標記膠體金溶液用15000g離心30分鐘，棄去上清，沉淀物用含1%BSA和0.2%PEG2萬的Tris緩沖液(10mmol/L，pH7.5)重懸，恢復原體積后再離心。如此洗滌3次。以徹底除去未結合的蛋白質。棄去上清液，沉淀物用上述緩沖液重懸為原體積的1/10，制成本發明試劑R2，該試劑顏色為紫紅色。制備例21.本發明試劑R1的配制按照與制備例1相同的方法制備本發明試劑Rl。2.本發明試劑R2的配制I.膠體金溶液的制備(1)配制0.01%的氯金酸(HAuCl4)水溶液，將1L該溶液加熱至沸。(2)攪動下準確加入1mllmol/LK2C03溶液，1分鐘后準確加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5072H20)水溶液8ml。(3)繼續加熱煮沸15分鐘，觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變成灰色，繼而變成黑色，隨后逐漸變成深紅色并穩定。(4)冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至原體積即1L。(5)制成膠體金溶液，其中膠體金顆粒的粒徑約為70nm。II.單抗標記膠體金(1)膠體金與標記蛋白(單抗)用量之比的確定除了使用0.004mol/L(pH7.5)硼酸鹽緩沖液稀釋標記單抗以外，按照與制備例1中相同的方式來確定膠體金與標記蛋白的用量比。[OOSO](2)膠體金與單抗(IgG)的結合(標記)1)用0.004mol/L(pH7.5)硼酸鹽緩沖液將單抗稀釋至40ug/ml。2)將100ml膠體金溶液和上述10ml單抗溶液分別以0.lmol/LK2C03調pH至7.5后，一邊電磁攪拌IgG溶液，一邊向其中加入膠體金溶液，完全加入后繼續攪拌10分鐘。3)加入適量穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀。本制備例中使用的穩定劑是胎牛血清(BSA)和PEG2萬。加入的量BSA終濃度為O.5%;PEG2萬終濃度為1%。III.標記IgG后膠體金溶液的純化按照與制備例1相同的方法對標記IgG后膠體金溶液進行純化，制成本發明試劑R2，該試劑顏色為紫紅色。制備例31.本發明試劑R1的配制按照與制備例1相同的方法制備本發明試劑Rl。2.本發明試劑R2的配制I.膠體金溶液的制備(1)配制0.01%的氯金酸(HAuCl4)水溶液，將1L該溶液加熱至沸。(2)攪動下準確加入0.5mllmol/LNaOH溶液，3分鐘后準確加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5072H20)水溶液6ml。(3)繼續加熱煮沸15分鐘，觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變成灰色，繼而變成黑色，隨后逐漸變成深紅色并穩定。(4)冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至原體積即1L。(5)制成膠體金溶液，其中膠體金顆粒的粒徑約為80nm。II.單抗標記膠體金(1)膠體金與標記蛋白(單抗)用量之比的確定除了使用0.02mol/L(pH8.5)HEPES緩沖液稀釋標記單抗以外，按照與制備例1中相同的方式來確定膠體金與標記蛋白的用量比。(2)膠體金與單抗(IgG)的結合(標記)1)用0.02mol/L(pH8.5)HEPES緩沖液將單抗稀釋至40ug/ml。2)將100ml膠體金溶液和上述10ml單抗溶液分別以0.lmol/LK2C03調pH至8.5后，一邊電磁攪拌IgG溶液，一邊向其中加入膠體金溶液，完全加入后繼續攪拌10分鐘。3)加入適量穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀。本制備例中使用的穩定劑是胎牛血清(BSA)和PEG2萬。加入的量BSA終濃度為2X;PEG2萬終濃度為0.1%。III.標記IgG后膠體金溶液的純化按照與制備例1相同的方法對標記IgG后膠體金溶液進行純化，制成本發明試劑R2，該試劑顏色為紫紅色。制備例41.本發明試劑R1的配制按照與制備例1相同的方法制備本發明試劑Rl。2.本發明試劑R2的配制I.膠體金溶液的制備(1)配制0.01%的氯金酸(HAuCl4)水溶液，將1L該溶液加熱至沸。(2)攪動下準確加入1.5mllmol/LNaOH溶液，4分鐘后準確加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5072H20)水溶液9ml。(3)繼續加熱煮沸15分鐘，觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變成灰色，繼而變成黑色，隨后逐漸變成深紅色并穩定。(4)冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至原體積即1L。(5)制成膠體金溶液，其中膠體金顆粒的粒徑約為65nm。II.單抗標記膠體金(1)膠體金與標記蛋白(單抗)用量之比的確定除了使用0.01mol/L(pH8.3)HEPES緩沖液稀釋標記單抗以外，按照與制備例1中相同的方式來確定膠體金與標記蛋白的用量比。(2)膠體金與單抗(IgG)的結合(標記)1)用0.01mol/L(pH8.3)HEPES緩沖液將單抗稀釋至40ug/ml。2)將100ml膠體金溶液和上述10ml單抗溶液分別以0.lmol/LK2C03調pH至8.2后，一邊電磁攪拌IgG溶液，一邊向其中加入膠體金溶液，完全加入后繼續攪拌10分鐘。3)加入適量穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀。本制備例中使用的穩定劑是胎牛血清(BSA)和PEG2萬。加入的量BSA終濃度為1.4%;PEG2萬終濃度為0.1%。III.標記IgG后膠體金溶液的純化按照與制備例1相同的方法對標記IgG后膠體金溶液進行純化，制成本發明試劑R2，該試劑顏色為紫紅色。制備例51.本發明試劑R1的配制按照與制備例1相同的方法制備本發明試劑Rl。2.本發明試劑R2的配制I.膠體金溶液的制備(1)配制0.01%的氯金酸(HAuCl4)水溶液，將1L該溶液加熱至沸。(2)攪動下準確加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5072H20)水溶液5ml。(3)繼續加熱煮沸15分鐘，觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變成灰色，繼而變成黑色，隨后逐漸變成深紅色并穩定。(4)冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至原體積即1L。(5)制成膠體金溶液，其中膠體金顆粒的粒徑約為85nm。II.單抗標記膠體金(1)膠體金與標記蛋白(單抗)用量之比的確定除了使用0.008mol/L(pH7.8)硼酸鹽緩沖液稀釋標記單抗以外，按照與制備例1中相同的方式來確定膠體金與標記蛋白的用量比。(2)膠體金與單抗(IgG)的結合(標記)1)用0.008mol/L(pH7.8)硼酸鹽緩沖液將單抗稀釋至40ug/ml。2)將100ml膠體金溶液和上述10ml單抗溶液分別以0.lmol/LK2C03調pH至7.8后，一邊電磁攪拌IgG溶液，一邊向其中加入膠體金溶液，完全加入后繼續攪拌10分鐘。3)加入適量穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀。本制備例中使用的穩定劑是胎牛血清(BSA)和PEG2萬。加入的量BSA終濃度為1%;PEG2萬終濃度為0.6%。III.標記IgG后膠體金溶液的純化按照與制備例1相同的方法對標記IgG后膠體金溶液進行純化，制成本發明試劑R2，該試劑顏色為紫紅色。以下，通過試驗例來檢測本發明試劑的性能。〈胱抑素C測定方法及實驗參數>分析方法兩點終點法；本發明試劑的用量本發明試劑Rl和本發明試劑R2，用量分別為200ul和50ii1;樣本的用量2iU;檢測波長分別為主波長540nm和副波長700nm。測定步驟:200ii1試劑Rl加入2ii1樣本，于37°C5分鐘后加入50y1試劑R2，即開始讀點，反應5分鐘后讀取另一點，得到吸光度的差值。試驗例1:制作本發明胱抑素C標準品的標準曲線采用本發明的標準品(前述制備的6種不同含量0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.Omg/L的胱抑素C標準品)，采用自動奧林巴斯公司制造的AU400生化分析儀，按照上述測定步驟測得本發明胱抑素C標準品的標準曲線(如圖1所示)。圖1中曲線上的每個點代表一個含量的標準品。其中X軸表示胱抑素C的含量(mg/L);Y軸表示的是吸光度。試驗例2相關性試驗使用本發明制備例1的試劑(本試驗例中，簡稱"本發明試劑")和對照試劑(市售的胱抑素C勻相溶膠顆粒免疫測定試劑，購自日本Alfresa公司)，采用奧林巴斯公司制造的AU400全自動生化分析儀對50份人血清進行測定，對測定值進行相關分析。按照與上述"胱抑素C測定方法"中相同的參數進行測定，測定結果見圖2，圖中的X、Y軸均為測定值(胱抑素C的含量mg/L)。由圖2的結果可知，本發明試劑和對照試劑的相關系數為R2=0.9922，回歸方程為y=0.9109x+0.05。該結果表明本試劑與對照試劑測定病人血清中胱抑素C含量的效果相關性良好，具有很好的特異性和準確性。此外，以上的試驗是采用奧林巴斯公司制造的AU400全自動生化分析儀進行的，但本發明的試劑不限于上述儀器，還適用于其他全自動或半自動生化分析儀，并且本領域技術人員可以根據情況對測定參數做適當調整。試驗例3靈敏度試驗按照如下的操作方法檢測試劑的靈敏度1.確定一個試劑可以檢測準確的較低濃度值來與水空白比較，本試驗選用0.5mg/L的樣本。2.檢測20次水，記錄吸光度數值，計算平均值(X7)0和標準偏差(SD)。3.檢測20次濃度0.5mg/L的樣本，記錄吸光度數值，計算平均值(X。.5)和標準偏差(SD)。4.水的吸光度平均值加上3SD作為最低檢測限對應的吸光度值，由于吸光度與濃度的關系基本為線性關系，可以通過和0.5mg/L樣本的吸光度平均值比較計算出最低檢測限的濃度即靈敏度。公式為0.5X(X水+3SD)/Xo.s制備例1中制造的本發明試劑(本試驗例中，簡稱"本發明試劑")和對照試劑(市售的胱抑素C勻相溶膠顆粒免疫測定試劑，購自日本Alfresa公司，粒徑約為50nm)的靈敏度試驗的數據結果如表l所示。下表中，AA表示吸光度的差值。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本發明試劑的靈敏度=0.5X(30.4+3X7)/429=0.06mg/L對照試劑的靈敏度=0.5X27.1+(3X21.8)/339.9=0.14mg/L結果顯示本發明試劑的靈敏度可達0.06mg/L，優于對照試劑。由上述表1的結果可知，本發明試劑的靈敏度高于對照試劑的靈敏度，可見本發明試劑實現了靈敏度提高的效果。試驗例47靈敏度試驗按照與上述試驗例6相同的方法，檢測制備例25中制備的本發明試劑的靈敏度，結果如下述表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權利要求一種勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其用于測定胱抑素C的含量，該試劑盒包含試劑R1和試劑R2，以體積比計，試劑R1和試劑R2的含量比例為4∶1，該試劑盒中任選地含有胱抑素C標準品，所述試劑R1為含有多聚物的緩沖溶液，所述試劑R2為結合有抗人胱抑素C抗體的膠體金的緩沖溶液，其中膠體金顆粒直徑為65～85nm。2.根據權利要求1記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其中，所述膠體金顆粒直徑為7080nm。3.根據權利要求1或2記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其中，所述膠體金的緩沖溶液中，金含量為0.11.0mg/mL。4.根據權利要求13中任一項記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其中，試劑Rl中的所述多聚物的含量，以重量體積比g/ml計，為0.15.0%。5.根據權利要求14中任一項記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其中，所述多聚物包含PEG2萬或Brij-35中的至少任一種。6.根據權利要求15中任一項記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒，其中，試劑Rl的pH值為6.58.5。7.權利要求16中任一項記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟將多聚物溶解于緩沖液中，制成含有多聚物的緩沖溶液，即試劑Rl;使用氯金酸為原料制備膠體金溶液，溶液中的膠體金顆粒的粒徑為6585nm;將抗人胱抑素C抗體用緩沖液稀釋后，向其中加入上述膠體金溶液，使膠體金和抗人胱抑素C抗體結合，制成結合有抗人胱抑素C抗體的膠體金的緩沖溶液，根據需要進行純化，得到試劑R2。8.根據權利要求7記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒的制備方法，其中，使膠體金和抗人胱抑素C抗體結合的步驟中所用的緩沖液濃度為0.0040.02mol/L，緩沖液pH為7.58.5。9.根據權利要求8記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒的制備方法，其中，所述緩沖液為硼酸鹽緩沖液或HEPES緩沖液。10.—種胱抑素C含量測定方法，其特征在于，使用權利要求16中任一項記載的勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒。全文摘要本發明提供一種勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒及其制造方法。所述勻相溶膠顆粒型免疫測定試劑盒包含試劑R1和試劑R2，所述試劑R1為含有多聚物的緩沖溶液；所述試劑R2為標記有抗人胱抑素C抗體的膠體金的緩沖溶液，其中膠體金顆粒直徑為65～85nm。本發明的試劑盒能夠特異性地高靈敏度地測定血清或血漿中胱抑素C的含量。文檔編號G01N33/542GK101699287SQ200910090689公開日2010年4月28日申請日期2009年9月8日優先權日2009年9月8日發明者不公告發明人申請人:北京利德曼生化股份有限公司