專利名稱：：以釀酒酵母作為生物識別元件快速測定bod的方法
技術領域：
：本發明屬于環境污染監測領域，涉及到水體有機污染的快速監測，具體是利用固定化釀酒酵母carew/ae)作為BOD快速測定儀的生物識別元件，拓寬對廢水中有機污染物的測量范圍，提高測定結果的穩定性和重現性，并延長生物識別元件的使用壽命的一種以釀酒酵母作為生物識別元件快速測定BOD的方法。
背景技術：
：水中的有機污染物種類繁多，難以分別測定各種組分的定量數值，因此在水質評價過程中，生化需氧量(biochemicaloxygendemand,BOD)是一個重要的參數，它是指一定體積水體中的有機物在微生物作用下氧化所消耗的溶解氧的量，單位是mg/L。從以上定義可以看出，BOD代表水體中有機污染物的污染程度。由于BOD可間接表示微生物氧化有機物的含量，所以BOD成為水污染控制領域最廣泛采用的監測指標之一。目前國內外均采用5天20"c培養法測定水樣中的BOD值，它包括水樣采集、水樣充氧、培養、測定等步驟。簡單地說，就是將水樣密封于試驗瓶中，在20±1。C下培養5天，然后分別測定樣品培養前后的溶解氧，這兩者之差即為5d的生化需氧量B0D5。這種方法存在許多不足之處，如測定周期長、操作復雜、重現性差、不宜現場監測等。因此，迫切需要一種操作簡單、準確、快速、自動化程度高、適用范圍廣的新方法來測定BOD。BOD生物傳感器快速測定儀就是利用生物傳感器的原理，以微生物作為識別材料，當樣品進入測量室時，水樣中的有機物與微生物接觸并被微生物分解。微生物在分解有機物的過程中會消耗水中的溶解氧，導致溶解氧濃度降低，利用相應的換能器可以檢測到溶解氧濃度的變化，產生相應的信號。這一信號變化的大小與樣品中BOD濃度存在一定的線形關系，通過對信號進行處理，可以得到水樣的B0D值。由于測定過程在較高溫度(一般為20-30。c)下進行，同時對水樣進行曝氣，因此微生物反應速度加快，大幅度縮短了BOD的測定時間。這就是生物傳感器BOD快速測定儀的基本原理。1977年，日本學者Kariibe等利用微生物傳感器原理研制出BOD測定儀。該儀器由固定化土壤菌群與氧電極構成，可在15min內測得廢水的BOD值。但由于微生物酶對固定化微生物膜的破壞，10d后，傳感器便失去活性。此后，Clark等改用多孔醋酸纖維素膜固定微生物制成BOD傳感器,主要用于測定高濃度廢水，可連續使用17d。基于生物傳感器原理的BOD測定方法和測定儀器具有快速、測試簡單方便、便于攜帶等特點，因此，自1977年以來，BOD快速測定儀獲得了廣泛的研究，并取得了很大進展。BOD生物傳感器的基本組成主要包括生物識別元件和換能器。生物識別元件是BOD生物傳感器的核心部件，其中包含了生化反應所需要的微生物。因此，生物識別元件在很大程度上決定了BOD傳感器的性能和測定的準確性。國內外在BOD傳感器識別元件的選擇方面做了大量的研究。目前，用作BOD生物傳感器識別原件的微生物主要有丁酸梭菌("as^^必i/范6^7ri'w/2)、假單孢菌(/^e〃ob/ff朋assp.)、異常漢遜氏酵母菌(Zfe/7se刀"7aa/70/aaJa)、皮狀絲孢酵母菌(Wc力。砂o/W2c由"i咖)等o生物傳感器可以縮短水體BOD測定周期，節省人力、物力和財力，更重要的是能及時反映地表水、工業廢水和生活污水的污染程度，為管理和決策部門掌握水體污染現狀(尤其是事故發生時)提供科學的決策依據，同時也為工業企業的廢水治理，污水處理廠的工藝設計、控制、改進處理效率等及時提供參數。因此，開發具有自主知識產權的、適合我國國情的、性能優越且價格合理的生物傳感器B0D快速測定儀是一項非常必要和迫切的任務，為我國水體有機污染的快速監測及廢水處理廠的運行控制提供技術保障，并產生較大的經濟效益、環境效益和社會效益。我們經過多年研究，發明了一種BOD快速測定方式(發明專利生化需氧量生物傳感器，專利號ZL00132125.0)以及利用固定化技術制備微生物顆粒的方法(發明專利一種聚乙烯醇固定化酶/微生物的方法，專利號ZL00132126.9;發明專利一種抑制聚乙烯醇固定化微生物顆粒水溶膨脹性的方法，專利號ZL200610011608.X)，并研制出B0D快速測定儀。本發明提出了一種利用釀酒酵母作為測定B0D的生物識別元件,力求拓寬對于多種廢水的測定范圍，滿足更多行業的使用需要。此外，利用PVA固定化釀酒酵母制備活性高、選擇性強的生物識別元件，以提高生物響應的穩定性，并保證識別元件的一致性，從而提高B0D傳感器的商品化程度。
發明內容本發明的目的是提出了以釀酒酵母作為生物識別元件快速測定B0D的方法，其特征在于，該方法包括選擇釀酒酵母作為生物識別元件、利用PVA固定化釀酒酵母制備生物識別元件工藝和利用PVA固定化釀酒酵母生物識別元件對BOD的快速測定；所述選擇釀酒酵母作為生物識別元件是選擇釀酒酵母作為快速測定B0D生物識別材料的主要原因如下1)釀酒酵母是一種高活性的好氧微生物，同化碳水化合物的能力很強，目前已廣泛應用于高濃度有機工業廢水的綜合治理；2)釀酒酵母自身無毒害作用，不會對環境產生二次污染；3)釀酒酵母的培養條件要求不高，并生長迅速，因此宜于獲得；4)釀酒酵母可以長期干燥保存，并能長久保持酶的活力；5)釀酒酵母細胞具有耐滲透壓的特點，可適用于海洋污染的監測；所述利用PVA固定化釀酒酵母制備生物識別元件工藝將釀酒酵母細胞懸浮于去離子水中，其濃度為10—20g/100mL(w/v)，然后與溶解好的PVA溶液混合，得到均勻的混合液，PVA的最終濃度為8—10%(w/v)，將該混合液滴入飽和硼酸溶液500mL中，充分交聯反應10—12小時后取出，用去離子水沖洗3遍，得到作為生物識別元件的固定化釀酒酵母顆粒，放置冰箱中冷藏備用；所述利用PVA固定化釀酒酵母生物識別元件對BOD的快速測定測量時，固定化微生物顆粒與待測樣品在測量室中混合，用微量曝氣管進行攪拌和曝氣，使其中溶解氧飽和，固定化微生物顆粒在分解有機污染物的過程中分解水體中可生物降解的有機污染物，并且消耗水體中的溶解氧，使溶解氧濃度不斷降低，導致溶解氧逐級降低至一個新的穩定狀態；根據兩個穩態之間的溶解氧差值，通過標準曲線即可計算出所測水樣的BOD值。其中兩個穩態是指第一個穩定狀態設定為水樣達到預定的測量溫度時，第二個穩定狀態設定為連續3次電流值讀數的變化范圍小于0.001)LiA。所述固定化微生物顆粒為固定化釀酒酵母顆粒。本發明的有益效果是與目前使用的BOD快速測定儀的生物識別元件相比，本發明提出的釀酒酵母彌補了其諸多不足(1)釀酒酵母的代謝活性高，分解有機污染物的能力強，拓寬了對多種廢水的測量范圍；(2)根據水樣的污染程度不同，改變固定化微生物顆粒的量可以調整有效測量范圍；(3)固定化微生物顆粒的使用壽命更長，微生物的活化和保存也更簡單、方便；(4)固定化釀酒酵母細胞具有耐滲透壓的特點，因此，以釀酒酵母作為生物識別元件適用于對海洋水體有機污染的快速監測。圖1是B0Ds為5-50mg/L范圍的海水的標準曲線。具體實施例方式下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明-實施例1用本發明提出的釀酒酵母作為B0D快速測定的生物識別元件，進行了標準B0D樣品的測定。分別配置B0D濃度為5，20,25，40，50，75，100，125，150，175，200mg/L的標準GGA溶液，測定條件為溫度控制在30±1*€，曝氣量為200-500mL/min。利用固定化釀酒酵母顆粒為生物識別材料，利用溶解氧電極測定上述BOD標準溶液的濃度。測定結果表明，DO值的變化與樣品的BOD值之間具有良好的線性關系，線形相關系數大于0.99，滿足BOD快速測量要求。實施例2用本發明提出的釀酒酵母作為BOD快速測定的生物識別元件，配置BOD濃度為50mg/L的標準GGA溶液，測定條件為溫度控制在30士廠C，去離子水稀釋，曝氣量為200mL/inin。測定結果的重現性如表1所示。表1固定化釀酒酵母對BODs為50mg/L的GGA溶液響應的重現性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通過對表中的數據進行分析可以看出，重現性試驗的測量次數為8次，溶解氧降低值的平均值為0.34mg/L，最大相對偏差為10.7%，滿足BOD快速測量要求。實施例3用本發明提出的釀酒酵母作為BOD快速測定的生物識別材料，進行了海水BOD標準樣品的測定。海水BOD標準樣品的配置步驟完全與GGA溶液的配置步驟相同(實施例l)，僅將配置所用去離子水換為標準海水。此標準海水取自遠海海平面下50m處，然后進行沙濾，最后進行紫外線消毒。測定條件為溫度控制在30±1t:,去離子水稀釋，曝氣量為200-500mL/min。測定結果如圖l所示。可以看出，DO值的變化與樣品的BOD值之間具有良好的線性關系，線形相關系數大于0.99，滿足BOD快速測量要求。實施例4用本發明提出的釀酒酵母作為BOD快速測定的生物識別材料，進行了實際生活污水樣品的BOD測定。實驗所用生活污水取自清華大學學生區的生活污水。采用GGA標準溶液標定過的測試系統對所取的生活污水進行測量，測得該生活污水的BOD值分別為48.5mg/L，采用五日標準稀釋法的測定結果為42.4mg/L。可以看出，利用本發明的釀酒酵母作為BOD快速測定的生物識別材料，BOD快速測定值與五日BOD標準稀釋測定值在生活污水的測定中結果是近似的。權利要求1.一種以釀酒酵母作為生物識別元件快速測定BOD的方法，其特征在于，該方法包括選擇釀酒酵母作為生物識別元件、利用PVA固定化釀酒酵母制備生物識別元件工藝和利用PVA固定化釀酒酵母生物識別元件對BOD的快速測定；所述選擇釀酒酵母作為生物識別元件是選擇釀酒酵母作為快速測定BOD生物識別元件的主要原因如下1)釀酒酵母是一種高活性的好氧微生物，同化碳水化合物的能力很強，目前已廣泛應用于高濃度有機工業廢水的綜合治理；2)釀酒酵母自身無毒害作用，不會對環境產生二次污染；3)釀酒酵母的培養條件要求不高，并生長迅速，因此宜于獲得；4)釀酒酵母可以長期干燥保存，并能長久保持酶的活力；5)釀酒酵母細胞具有耐滲透壓的特點，可適用于海洋污染的監測；所述利用PVA固定化釀酒酵母制備生物識別元件的工藝將釀酒酵母細胞懸浮于一定量的去離子水中(濃度范圍10-20g/100mL(w/v)為)，然后與溶解好的PVA溶液混合，得到均勻的混合液，PVA的最終濃度為8-10％(w/v)，將該混合液滴入飽和硼酸溶液500mL中，充分交聯反應10-12小時后取出，用去離子水沖洗3遍，得到作為生物識別元件的固定化釀酒酵母顆粒，放置冰箱中冷藏備用；所述利用PVA固定化釀酒酵母生物識別元件對BOD的快速測定測量時，固定化微生物顆粒與待測樣品在測量室中混合，用微量曝氣管進行攪拌和曝氣，使其中溶解氧飽和，加熱控制溫度條件，使固定化微生物顆粒在分解有機污染物的過程中分解水體中可生物降解的有機污染物，并且消耗水體中的溶解氧，使溶解氧濃度不斷降低，導致溶解氧逐級降低至一個新的穩定狀態；根據兩個穩態之間的溶解氧差值，通過標準曲線-線性回歸方程即可計算出所測水樣的BOD值。2.權利要求1所述以釀酒酵母作為生物識別元件快速測定B0D的方法，其特征在于，所述固定化微生物顆粒為固定化釀酒酵母顆粒。3.權利要求1或2所述以釀酒酵母作為生物識別元件快速測定B0D的方法，其特征在于，所述固定化釀酒酵母顆粒可用于天然水體、工業廢水、生物污水以及海水中B0D值的快速測定，水樣不經稀釋直接測量的范圍為B0D值為5—200mg/L。全文摘要本發明公開了屬于環境污染監測
技術領域：
的以釀酒酵母作為生物識別元件快速測定BOD的方法。該方法包括選擇釀酒酵母作為生物識別元件、利用PVA固定化釀酒酵母制備生物識別元件工藝和利用PVA固定化釀酒酵母生物識別元件對BOD的快速測定；本發明選擇釀酒酵母作為測定BOD的識別元件，可以拓寬對多種廢水的測定范圍、BOD的快速測定結果穩定性和重現性好；利用PVA固定化釀酒酵母制備活性高、選擇性強的生物識別元件，可以提高生物響應的穩定性，并保證識別元件的一致性、機械強度和使用壽命，生物識別元件的使用壽命達到3-6個月。本發明可應用于天然水體、工業廢水、生物污水以及海水中BOD值的快速測定。文檔編號G01N33/18GK101644702SQ20091009064公開日2010年2月10日申請日期2009年9月2日優先權日2009年9月2日發明者王建龍,俊胡申請人:清華大學