專利名稱：一種用于質粒分析的整體床的合成方法
技術領域：
本發明涉及一種用于質粒分析的整體床的合成方法，屬于生物分子分析和色譜分析技術 領域。
技術背景基因治療和DNA疫苗在癌癥、單基因遺傳病、艾滋病、心血管疾病、關節炎等重大疾病 的診斷和治療方面的應用研究正日益引起越來越廣泛的關注。目前質粒逐漸成為基因治療的 最重要的基因傳遞系統，因此應用于基因治療的藥用質粒的大規模制備成為其基礎。而藥用 質粒的大規模制備過程的關鍵之一在于如何監測質粒純度、監測質粒制備過程的性能，評價 最終產品質量以及產品的規格等，這對于過程開發、認證、產品批準非常重要。質粒分析方法主要包括紫外吸收光譜法、熒光光譜法、電泳法、色譜法等。近年來，色 譜法除了作為藥用質粒大規模制備過程中重要的分離純化技術之外，也逐漸成為制備過程中 不可缺少的高效分析方法。在質粒分析過程中存在反相色譜、疏水相互作用色譜、體積排阻 和離子交換色譜等多種模式。離子交換色譜既可以用于質粒和雜質的定量，也可用于質粒不 同拓撲形態的分析，在藥用質粒分析中應用最為廣泛。目前專門針對質粒分離分析開發的商業化離子交換色譜介質產品非常有限，而應用于質 粒分析過程的陰離子交換型色譜介質均為商業化產品，其中大多數是為蛋白質分離分析而開 發。目前藥用質粒分離過程中過程流分析中所采用的離子交換色譜介質主要有多孔微球、灌 注色譜填料、非多孔色譜填料和薄殼色譜填料等，為提高傳質性能而開發的各種新型色譜介 質是其中的主體。多孔微球包括瓊脂糖基質的QSepharoseHP、聚(苯乙烯一二乙烯基苯)基 質的PL—SAX和MonoQ;灌注色譜填料包括聚(苯乙烯一二乙烯基苯)基質的Poros 20 PI和 Poros20QE;非多孔微球包括聚(苯乙烯一二乙烯基苯)基質的MiniQ和聚甲基丙烯酸酯基質 的TSKDNA—NPR;薄殼型介質為DNAPac PA—100。應用于質粒分析的市售色譜柱骨架結構包括聚(苯乙烯一二乙烯基苯)、聚(甲基丙烯酸 縮水甘油酯一雙甲基丙烯酸乙二醇酯)和瓊脂糖。聚(苯乙烯一二乙烯基苯)為基質的微球 是目前應用于質粒分析的主要骨架材料，但是該類基質在質粒分析中存在易污染的問題，文 獻"Kepka C, Rhodin J, Lemmens R， et al. Extraction of plasmid DNA from Escherichia coli cell lysate in a thermoseparating aqueous two-phase system. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A. 2004, 1024(1-2): 95-104."中指出即使是無孔的MiniQ也存在色譜柱污染后無法分析樣品的問 題。文獻"Prazeres D M, Schluep T, Cooney C. Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion-exchange chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A. 1998,806(1): 31-45"指出與聚(苯乙烯一二乙烯基苯)骨架基質相比，瓊脂糖親水性提高，由疏水 相互作用引起的非特異性吸附會明顯降低。因此，從骨架結構的角度來看，骨架為親水性瓊 脂糖或聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一雙甲基丙烯酸乙二醇酯)的色譜介質更適合質粒的分析。應用于質粒分析的市售色譜柱按基質孔結構可以分為多孔和非多孔兩類。目前采用的多 孔色譜分析材料均是針對蛋白質分離分析開發，因通常所需分離的蛋白的分子量為8千到20 萬，而且通常為球形， 一般尺寸為幾納米到十幾納米。而因質粒的分子量高達數百到數千萬， 而且通常為超螺旋結構，長度可達幾百納米，窄的部分可達十幾納米。文獻"PrazeresDM, Schluep T, Cooney C. Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion陽exchange chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A. 1998， 806(1): 31-45"指出其與多孔材 料鍵合時主要發生在微球的外表面。因為僅是采用色譜材料的外表面，MiniQ和TSK雖然無孔， 但因粒徑小，所以有效的外比表面積最高，而且它們屬于非多孔材料，傳質速度非常快，因 此，目前采用的多孔色譜分析材料非多孔材料MiniQ和TSKDNA—NPR從微觀結構的角度看 具有比較突出的優勢。考慮到色譜介質的骨架結構，MiniQ為聚(苯乙烯一二乙烯基苯)，而 TSKDNA—NPR為聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一雙甲基丙烯酸乙二醇酯)，因此，TSKDNA 一NPR色譜柱無論從骨架結構還是孔結構均比較適合于質粒分析。但該介質由于是無孔微球， 色譜柱的制備和裝填要求均非常高，而且色譜柱在使用過程中背壓也非常高。因此開發針對 質粒分析的多孔介質或結構性介質，充分提高介質比表面積的利用率，是提高色譜介質對質 粒分析性能的關鍵。發明人在"Zhang M L, Sun Y. Poly(glycidyl methacrylate ~divinylbenzene -triallylisocyanurate) continuous-bed protein chromatography. JOURNAL OF CHROMATOGRAPHYA. 2001, 912(1): 31-38"和"張敏蓮，白姝，孫彥.聚(GMA-DVB-TAIC) 型連續床的制備及其對蛋白質的色譜分離性能.離子交換與吸附，2003， 16(3) : 199 206" 中曾針對蛋白質分離分析開發了聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯一二乙烯基苯一三聚異氰尿酸三 烯丙酯)型整體床，該類型的色譜介質具有良好的親水性能。但由于該類色譜介質針對蛋白 分離分析開發，整體床中的孔徑為l 2pm，雖然在蛋白分離中可以具有良好的傳質性能，但 因質粒的長度可達幾百納米，窄的部分可達十幾納米，因此類型整體床在質粒分析中傳質性 能差，易出現色譜柱堵塞，而無法應用于質粒的分析。 發明內容本發明針對目前質粒分析中存在的問題，本發明的目的是提供一種不易被污染、具有大 量質粒可以進入的孔道、傳質速度快，背壓低的用于質粒分析的整體床的合成方法。本發明的目的是通過如下技術方案實現的一種用于質粒分析的整體床的合成方法，其特征在于該方法按如下步驟進行1)將含有環氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯劑、致孔劑和引發劑混合，得到反應混合物，其中a. 所述交聯劑與單體的物質的量的比為0.05 0.2;b. 所述致孔劑用量占反應混合物體積含量的40 80%;c. 所述引發劑與單體的物質的量的比為0.005 0.03;2) 將上述反應混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合 溫度控制在50 6(TC之間，反應時間為12 72小時；3) 聚合反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床；4) 利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為 25 75%，修飾溫度控制在70 80。C之間，反應時間為12 24小時；5) 修飾反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床。 所述交聯劑采用含有兩個雙鍵的化合物和三個雙鍵的化合物的混合物，兩類交聯劑的物質的量的比為0.25 4;所述的致孔劑采用飽和垸烴和芳烴中的至少一種；所述的引發劑采 用偶氮類物質；所述的有機溶劑為醇類和環醚類中的任一種。所述含有兩個雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和雙甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一種；所述含有三個雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲 基丙烯酸丙三醇酯中的任一種。所述偶氮類物質采用偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的任一 種。所述飽和烴采用正庚烷、正辛烷和正壬垸中的任一種；所述芳烴采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一種。所述醇類采用乙醇或甲醇；所述環醚類采用四氫呋喃或二噁烷。所述胺類修 飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。本發明與現有技術中質粒色譜分析方法相比，具有以下優點及突出性效果采用本方法所合成的整體床在質粒分析中具有良好的耐污染能力，可以對于含有大量雜質的酶解的裂解 液進行多個批次的分析而分析柱性能無明顯改變；整體床中具有的孔道直徑可達十微米以上， 可以確保質粒的可接近性，傳質速度快，背壓低。該類整體床的質粒分析過程方便快捷，成 本低。
具體實施方式
本發明提供的一種用于質粒分析的整體床的合成方法，該方法按如下步驟進行1) 將含有環氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯劑、致 孔劑和引發劑混合，得到反應混合物，其中a. 所述交聯劑與單體的物質的量的比為0.05 0.2;b. 所述致孔劑用量占反應混合物體積含量的40 80%;c. 所述引發劑與單體的物質的量的比為0.005 0.03;2) 將上述反應混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合 溫度控制在50 6(TC之間，反應時間為12 72小時；3) 聚合反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床；4) 利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為 25 75%，修飾溫度控制在70 8(TC之間，反應時間為12 24小時；5) 修飾反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床。 所述交聯劑釆用含有兩個雙鍵的化合物和三個雙鍵的化合物的混合物，兩類交聯劑的物質的量的比為0.25 4;所述的致孔劑采用飽和烷烴和芳烴中的至少一種；所述的引發劑采 用偶氮類物質；所述的有機溶劑為醇類和環醚類中的任一種。所述含有兩個雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷和雙甲基丙烯酸乙二醇 酯中的任一種；所述含有三個雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯和三甲 基丙烯酸丙三醇酯中的任一種。所述偶氮類物質采用偶氮二異丁腈和偶氮二異庚腈中的任一 種。所述飽和烴采用正庚烷、正辛烷和正壬烷中的任一種；所述芳烴采用甲苯、乙苯和二甲 苯中的任一種。所述醇類采用乙醇或甲醇；所述環醚類采用四氫呋喃或二噁烷。所述胺類修 飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。利用合成的整體床進行質粒分析的過程如下采用水和緩沖液A (10mMTris-HCl， lmMEDTA， pH8.0)沖洗整體床。在質粒制備過程分析中，雜質含量最高的是裂解液，純度 最高的是最終的質粒純品，可以利用整體床對質粒純品和裂解液進行分析，如果色譜柱可以 對兩者有較好的分析性能，則其可以應用于質粒制備過程分析。分析質粒標樣和酶解裂解液 時，所采用的溶液為緩沖液A，緩沖液B(緩沖液A+2MNaCl)。鹽梯度為0-5min30-50%緩 沖液B;5-5.01min 50-30%緩沖液B; 5.01-15min 30%緩沖液B。裂解液采用RNase—DNase Free酶液處理，處理溫度為35。C 40。C，恒溫0.5~2h。將上述溶液加入到整體床中，在0.2 0.8 mol/L鹽濃度下將RNA和蛋白等雜質從整體床中洗脫下來，然后在0.9 1.5 mol/L鹽濃度 下將質粒組分洗脫下來，從而實現質粒的純度和含量分析。下面通過幾個具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例l:稱取單體甲基丙烯酸縮水甘油酯、交聯劑二乙烯基苯和三聚異腈尿酸三烯丙酯(1: 0.04:0.01 mol/mol/mol);致孔劑甲苯和正庚烷(致孔劑/反應混合物80 vol%，甲苯/正庚烷3: 2vol/vol);引發劑偶氮二異丁腈(引發齊U/單體0.005:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封 的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一端密封，于5(TC反應72小時。將整體床連接到泵上，乙醇 沖洗。然后利用二乙胺為修飾劑，溶劑采用乙醇，二乙胺的體積含量為25%，修飾反應控制 在8(TC，反應時間為12小時。反應結束后，采用乙醇沖洗整體床。本發明所合成的整體床 中75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床的修飾密度約為2.0mmol/g整體床。實施例2:稱取單體甲基丙烯酸環氧乙酯、交聯劑雙甲基丙烯酸乙二醇酯和三乙烯基苯(1: 0.03:0.06 mol/mol/mol);致孔劑乙苯和正辛烷(致孔齊U/反應混合物75 vol%，乙苯/正辛烷1: 1 vol/vol); 引發劑偶氮二異丁腈(引發劑/單體0.01:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50><4.6mm 不銹鋼管中，將另一端密封，于55'C反應36小時。將整體床連接到泵上，四氫呋喃沖洗。 然后利用二甲胺為修飾劑，溶劑采用四氫呋喃，二甲胺的體積含量為75%，修飾反應控制在 7(TC，反應時間為24小時。反應結束后，采用四氫呋喃沖洗整體床。本發明所合成的整體床 中75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床的修飾密度約為2.3mmol/g整體床。實施例3:稱取單體丙烯酸縮水甘油酯、交聯劑二乙烯基苯和三聚異腈尿酸三烯丙酯(1: 0.06:0.03 mol/mol/mol);致孔劑二甲苯(致孔劑/反應混合物60 vol%);引發劑偶氮二異庚腈(引發劑/ 單體0.02:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一端密封， 于6(TC反應12小時。將整體床連接到泵上，甲醇沖洗。然后利用乙胺為修飾劑，溶劑采用 甲醇，乙胺的體積含量為30%，修飾反應控制在75C反應時間為18小時。反應結束后， 采用甲醇沖洗整體床。本發明所合成的整體床中75%以上的孔其孔徑在十微米以上，整體床 的修飾密度約為2.1mmol/g整體床。實施例4:稱取單體丙烯酸環氧乙酯、交聯劑二乙烯基苯基甲烷和三甲基丙烯酸丙三醇酯(1: 0.04:0.16 mol/mol/mol);致孔劑正壬烷(致孔劑/反應混合物40 vol%);引發劑偶氮二異庚腈 (引發劑/單體0.03:1 mol/mo1)，混合均勻，裝入一端密封的50x4.6mm不銹鋼管中，將另一 端密封，于6(TC反應12小時。將整體床連接到泵上，二噁烷沖洗。然后利用乙二胺為修飾 劑，溶劑采用二噁烷，乙二胺的體積含量為50%，修飾反應控制在75t:，反應時間為12小 時。反應結束后，采用二噁烷沖洗整體床。本發明所合成的整體床中75%以上的孔其孔徑在 十微米以上，整體床的修飾密度約為2.6mmol/g整體床。
權利要求
1.一種用于質粒分析的整體床的合成方法，其特征在于該方法按如下步驟進行1)將含有環氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯劑、致孔劑和引發劑混合，得到反應混合物，其中a.所述交聯劑與單體的物質的量的比為0.05～0.2；b.所述致孔劑用量占反應混合物體積含量的40～80％；c.所述引發劑與單體的物質的量的比為0.005～0.03；2)將上述反應混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床，聚合溫度控制在50～60℃之間，反應時間為12～72小時；3)聚合反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床；4)利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性，其中胺類修飾劑的體積含量為25～75％，修飾溫度控制在70～80℃之間，反應時間為12～24小時；5)修飾反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床。
2. 按照權利要求1所述的一種用于質粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述 交聯劑采用含有兩個雙鍵的化合物和三個雙鍵的化合物的混合物，兩類交聯劑的物質的量的比為0,25 4;所述的致孔劑采用飽和垸烴和芳烴中的至少一種；所述的引發劑采用偶氮類物質；所述的有機溶劑為醇類或環醚類。
3. 按照權利要求2所述的一種用于質粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述 含有兩個雙鍵的化合物采用二乙烯基苯、二乙烯基苯基甲烷或雙甲基丙烯酸乙二醇酯；所述 含有三個雙鍵的化合物采用三聚異腈尿酸三烯丙酯、三乙烯基苯或三甲基丙烯酸丙三醇酯。
4. 按照權利要求2所述的一種用于質粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述 偶氮類物質采用偶氮二異丁腈或偶氮二異庚腈。
5. 按照權利要求2所述的一種用于質粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述飽和烴采用正庚垸、正辛烷或正壬垸；所述芳烴采用甲苯、乙苯或二甲苯。
6. 按照權利要求2所述的一種用于質粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述 醇類采用乙醇或甲醇；所述環醚類采用四氫呋喃或二噁烷。
7. 按照權利要求2所述的一種用于質粒分析的整體床的合成方法，其特征在于所述 胺類修飾劑采用乙胺、二甲胺、二乙胺和乙二胺中的任一種。
全文摘要
一種用于質粒分析的整體床的合成方法，屬于生物分子分析和色譜分析技術領域。該方法將含有環氧端基的甲基丙烯酸酯類或含有環氧端基的丙烯酸酯類單體與交聯劑、致孔劑和引發劑混合，得到反應混合物；然后將上述反應混合物超聲混和均勻，加入到色譜柱管中，原位聚合形成整體床；聚合反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床；利用溶于有機溶劑的胺類修飾劑對整體床進行改性；修飾反應結束后，利用有機溶劑沖洗整體床。采用本方法所合成的整體床在質粒分析中具有良好的耐污染能力、傳質速度快、背壓低、分析過程方便快捷、成本低。
文檔編號G01N30/00GK101625347SQ20091009037
公開日2010年1月13日 申請日期2009年8月7日 優先權日2009年8月7日
發明者劉孟儒, 憲 孔, 張敏蓮 申請人:清華大學