專利名稱：：定量檢測金黃色葡萄球菌腸毒素b的膠體金免疫層析方法以及膠體金免疫檢測試紙條的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物檢測領域，具體涉及金黃色葡萄球菌毒素B的檢測快速定量檢測方法以及膠體金免疫檢測試紙條。
背景技術：
：金黃色葡萄球菌(金葡菌)是引起感染和中毒性疾病的主要病原菌，其致病性主要與其產生多種致病物質有關，葡萄球菌腸毒素B(staphylococcalen2terotoxinB，SEB)是其中一種重要的致病物質，其小鼠LD值為0.023-5網/kg。金黃色葡萄球菌能引起食物中毒，主要原因為其能產生腸毒素(Enterotoxin，簡稱SE)從臨床分離的金黃色葡萄球菌，約1/3產生腸毒素。金黃色葡萄球菌腸毒素主是由血漿凝固酶或耐熱酸酶陽性菌株所產生的一類結構相關、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白質，迄今從血清型上已被鑒定的SE有IO種，A、B、C、D、E、G、H、I、J、K,其中C型抗原又根據等電點的不同分為3個亞型(Cl、C2、C3)，各型腸毒素均能引起食物中毒，其中以A型和D型引起的食物中毒最多，B型和C型次之。腸毒素可引起急性胃腸炎，人吃了被產毒菌抹污染了的牛奶、肉類、魚蝦、蛋類等食品就會引起食物中毒。腸毒素是一種可溶性蛋白質，耐熱，經IO(TC煮沸30分鐘不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響，故誤食污染腸毒素的食物后，在腸道作用于內脂神經受體，傳入中樞，刺激嘔吐中樞，引起嘔吐，并產生急性胃腸炎癥狀。發病急，病程短，恢復快。一般潛伏期為l-6小時，出現頭暈、嘔吐、腹瀉，發病1~2日可自行恢復，預后良好。目前金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的檢測方法主務農靠傳統的分離養和生化鑒定，該方法費時費力(參見吳清平."單核細胞增生李斯特菌檢測技術研究逸艮"，J.中國衛生檢驗雜志，2005，15(7):888-890;RobinLTChurchill，HungLee，etal."DetectionofListeriamono24cytogenesandthetoxin1isteriolysin0infooflJ.JournalofMi2crobiologicalMethods,2006，64:141-170.)。膠體金快速診斷試紙條技術是20世紀90年代以來發展起來的一項新型體外診斷技術(參見GrabarKC，FreemanRG，HommerMB,Wa/."PreparationandcharacterizationofAucolloidmon&layers，，J.AnalChem，1995，67:735~743.)。近年來該方法發展迅速，在生物醫學領域特別是醫學檢驗中得到了廣泛應用，但用于食品衛生領域檢測的產品較少。本研究針對金黃色葡萄球菌腸毒素B研制出了食品污染金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫膠體金檢測試紙條。(李小兵，謝光洪，周昌芳，等."相思子毒素-a的純化及鑒定，，.《中國獸醫學報》，2008，28(3):310-313;李小兵，謝光洪，周昌芳等."相思子毒素-a單克隆抗體的制備與鑒定"。《中國獸醫學報》，2008，28(7):836-839.)
發明內容本發明涉及膠體金免疫層析技術快速定量檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的方法及其產品。本發明的方法利用膠體金標記和雙抗體夾心免疫層析技術提供了一種金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的快速檢測方法。發明人評價其特異性和敏感性，并擬合檢測曲線進行定量檢測；在奶粉、牛奶、火腿腸等食品樣品中添加金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)模擬污染樣品，評價該方法對固體、半固體、液體等食品、可疑生物恐怖樣品的檢測能力。本發明的方法可在15min內完成定性和半定量檢測，靈敏度為lng/ml，線性范圍lOng/ml-5000ng/ml、回收率94%一112%。該法特異性、穩定性良好，可對樣品直接進行檢測。本發明提供一種檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的膠體金免疫層析方法，能快速、靈敏、特異、準確地檢測樣品中的金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)，并可實現定量，適用于現場快速檢測。一種檢測金葡菌腸毒素B型的方法，其中包括將待測標本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入檢測試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結果；所述檢測試紙包;J舌(1)反應支持物；(2)吸水墊；5(3)硝酸纖維膜，該膜包被有金葡菌腸毒素B型抗體和質控抗體的檢測條帶和質控條帶；(4)金標抗體墊，其中含有膠體金標記的金葡菌腸毒素B型抗體；(5)樣品墊；其中所述抗SEB的抗體可以是多克隆抗體，也可是單克隆抗體；多抗可選自兔抗SEB、鼠抗SEB;質控抗體可選自羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠的IgG。本發明方法中所述的檢測試紙，其中吸水墊選用濾紙，反應支持物選用PVC板，金標抗體墊的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，樣品墊的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。本發明方法中所述的試紙，其中吸水墊、金標抗體墊、反應支持物、硝酸纖維膜和樣品墊按照附圖1所示方式構成；反應支持物5位于底層，硝酸纖維膜2位于反應支持物5上的中部，該膜的T處是兔抗SEB多克隆抗體包被的檢測條帶，并且C處是羊抗兔IgG包被的質控條帶；玻璃纖維膜3位于硝酸纖維膜上部的一側并與之部分重疊，該膜含有膠體金標記的兔抗SEB多克隆抗體；吸水墊1位于硝酸纖維膜2上部的相對于玻璃纖維膜3而言的另一側并與2部分重疊。樣品墊4位于2上與1相反的一側并與3部分重疊。本發明方法中所述的試紙，其中吸水墊一側為起始端，玻璃纖維膜一側為末端，檢測抗體的條帶位于接近末端，質控條帶接近于起始端。本發明所述的試紙，其中所述抗SEB的抗體可以是多抗，也可是單抗；多抗可是兔抗SEB、鼠抗SEB等；質控抗體根據金標抗體的免疫源可選擇羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠等的IgG。本發明方法中所述的試紙，其中所述抗SEB多克隆抗體的濃度為3-8mg/ml。本發明方法中所述的試紙，其中質控抗體濃度為0.1-5mg/ml。本發明方法中所述的試紙，其中所述抗SEB抗體標記lml膠體金的量為5-20ug。本發明提供一種制備上述的金葡菌腸毒素B型的檢測試紙的制備方法，該方法包4舌(1)用隔流噴金劃線機以一定噴膜速度噴涂抗SEB抗體和質控抗體兩個條帶的硝酸纖維膜；(2)制備一種含有膠體金標記的抗SEB抗體的玻璃纖維膜，將膠體金標記的抗SEB抗體均勻涂布在玻璃纖維膜上，并烘干或冷凍干燥。本發明方法中所述的試紙在檢測金葡菌腸毒素B型中的應用，其中包括將待測標本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結果。本發明所述的方法制備的檢測金葡菌腸毒素B型的試紙。本發明采用的抗原及抗體例如是金黃色葡萄J求菌腸毒素B及其抗體，如SEB重組抗原，兔多抗，可購自軍事醫科院微生物流行病研究所，羊抗兔IgG(可購自鼎國生物技術公司)。注此處的抗體，如羊抗兔IgG是同羊抗鼠IgG—樣，是普通的一種二抗；包被的抗原與抗體，只是針對本實驗的抗原抗體材料及來源，實際應用中，SEB的抗原除了重組的也可用野生的。本發明方法采用層析測試條耗材，其中例如是結合墊(玻璃纖維)、硝酸纖維素膜(NC膜，SHF1350225)、樣品墊及吸水墊、濾紙購自Minipore公司。根據才企測試紙，其中吸水墊選用濾紙，反應支持物選用PVC板，金標抗體保護膜的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，樣品墊的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。本發明方法采用的實驗儀器例如是金標免疫分析儀，可得自中國科學院上海光學精密機械研究所、中國檢驗檢疫科學研究院聯合研制。;圖1表示金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)膠體金免疫層析試紙條的檢測敏感性。圖2為特異性4全測圖示；其中，1:SEB2:SEA3:SEC4:SED5:SEE6:肉毒毒素7:蓖麻毒素8:相思子毒素9:BSA10:空白對照。圖3為金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)膠體金免疫層析試紙條檢測,系統擬合工作曲線，其中X:天然金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)濃度；Y:各濃度下金標分析儀讀值T/C比值。圖4為金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)膠體金免疫層析試紙條穩定性檢測；其中1:金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)，2:1%BSA，3:SEA,4:空白對照。具體實施例方式實施例1:膠體金免疫層析試紙條的制備1、抗原及抗體金黃色葡萄球菌腸毒素B及其抗體(SEB重組抗原，兔多抗，軍事醫科院孩i生物流-f亍病研究所)、羊抗兔IgG(購自鼎國生物4支術>^司)2、層析測試條耗材結合墊(玻璃纖維)、硝酸纖維素膜(NC膜，SHF1350225)、樣品墊及吸水墊、濾紙購自Minipore^^司03、實驗儀器金標免疫分析儀(中國科學院上海光學精密機械研究所、中國檢驗檢疫科學研究院聯合研制)。4、膠體金免疫層析試紙條的制備4.1膠體金結合墊將pH值8.0~8.5、濃度5ug/ml的兔抗SEB抗體標記于檸檬酸鈉法制備25nm的膠體金顆粒的膠體金顆粒，371:干燥〖5]。4.2硝酸纖維素膜才企測帶兔抗SEB多克隆抗體2mg/ml+l%BSA;質控帶羊抗兔lmg/ml，37。C干燥。4.3組裝將樣品墊、結合墊、吸水墊依次貼在帶有IS^劑的底襯卡，切成0.4cm的條，干燥，裝殼，室溫貯存備用。實施例2:樣品的定性和定量檢測1、樣品的處理用樣品處理液(5mMPBSpH7.4)將動物血清、牛奶等粘稠液體樣品進行l:20稀釋，火腿腸等固體食品按1/100(W/V)加入樣品處理液溶解，靜止取上清，靜止取上清。分別添加不同劑量的天然金黃色葡萄球8菌腸毒素B(SEB)作為模擬檢測樣品。2、定性檢測將處理后的樣品和樣品處理液(作為陰性樣品)100ul加到制備好的層析條樣品墊端，靜置15min,觀察結果。檢測帶和質控帶均出現紅色判為陽性，僅質控帶出現紅色為陰性，檢測帶和質控帶均不顯色，則為試紙條失效。3、定量檢測3.1、判定值的確定按1.6.1將陰性樣品檢測20次，用金標免疫分析儀掃描讀取信號T/C比值。20個樣品T/C比值的平均值(AVERAGE)與3倍標準差(STDEVA)之和為CUT-OFF值。3.2、定量檢測判定將顯色后的金標條》認金標免疫分析儀掃描，讀取信號T/C比值，大于判定值為陽性。實施例3:靈敏度試驗1、定量檢測的靈敏度檢測不同濃度天然金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)，經過計算判定值(CUT-0FF)為0.0243，濃度為lng/ml、5ng/ml的天然金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的平均T/C比值為的值均為0.00，低于0.043,為陰性；10ng/ml~10ug/ml的天然金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的平均T/C比值分別為的值均高于0.0243結果為陽性；當天然金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)濃度大于10ng/ml時，T/C比值平均值大于0.0243，故檢測靈敏度為10ng/ml。表1金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)膠體金免疫層析試紙條各濃度檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>10ng/ml0.006V0.678V0.04+50ng/ml0.019V0.476V0.14+100ng/ml0.161V0.543V0.29+500ng/ml0.111V0.593V0.37+lug/ml0.462V0.625V0.545ug/ml0.326V0.391V0.73lOug/ml0.485V0.436V1.112、直觀檢測靈敏度評價按確定的最佳反應條件制備膠體金免疫層析試紙條，檢測不同濃度的天然金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)。將天然金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)用樣品處理液稀釋成濃度依次為10ug/ml、lug/ml、100ng/ml、10ng/ml、lng/ml，同時進行檢測。結果如圖1所示，直接目測試紙條結果可以達到10ng/ml顯色更加清晰。實施例4:標準曲線擬合實驗以LOG10樣品濃度為f黃坐標(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)，以T/C值為縱坐標，擬合標準曲線(圖3)。檢測SEB各個濃度下，圖二判定值(CUTOFF)為0.0243的T/C讀值。可見小于10ng/ml為陰性，10ng/ml一5000ng/ml線性關系良好，擬合曲線見圖3。線性方程為y=0.2576x-0.2536;R2=0.9675實施例5:特異性試驗按確定的最佳反應條件制備膠體金免疫層析試紙條，以樣品稀釋液同樣分別處理金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157:H7、肉毒毒素、鼠疫菌等、至濃度均為0.2mg/mL，以制備好的膠體金免疫層析試紙條檢測，并與同樣菌數的金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)樣品對照，同時檢測空白對照。結果如圖2所示。實施例6:回收率試驗在線性檢測范圍內，檢測已知濃度的天然金黃色葡萄球菌腸毒素B10(SEB),根據金標分析儀讀值T/C比值和標準曲線計算出檢測濃度，檢測濃度與理論濃度的比值百分率為回收率。由表2可見，以LOG10樣品濃度(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)和T/C值才艮據擬合曲線方程(圖3)來計算回收率，可見10ng/ml—1000ng/ml之間回收率在94%一112°/之間。表2金葡菌腸毒素B型(SEB)膠體金免疫層析試紙條檢測系統回收率信號值T/CloglO濃度值檢測值C(V)回收率0.141.70ng/ml1.52ng/ml111.8%0.292ng/ml2.11ng/ml94.8%0.372.70ng/ml2.42ng/ml111.6%0.543ng/ml3.08ng/ml97.4%0.733.70ng/ml3.82ng/ml96.9%實施例7:穩定性試驗取在37。C放置的金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)膠體金檢測試紙條進行檢測，第7天的檢測結果可見金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)測試條的穩定性良好，在37。C放置7天后仍能特異性的檢出金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)，而且敏感性也未下降。和新制備的檢測試紙條相比，靈敏度沒有明顯下降，且特異性良好。結果參見附圖4，圖中1、10ng/mlSEB，2、1%BSA,3、SEA,4、空白對照;金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)膠體金檢測試紙條37。C放置7天，進行檢測，靈敏度可檢測到10ng/ml，并且與金黃色葡萄球菌腸毒素的其他分型也沒有交叉反應，穩定性良好。實施例8:檢測樣品的實驗火腿腸50mg、奶粉50mg、牛奶250ji1，分別加入到1ml含金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的樣品稀釋液中，混勻，靜置10min，再取l份培養后的菌液，用PBS10倍系列稀釋進行檢測。試紙條檢測模擬污染樣品試驗的結果表明，該試紙條檢測食品中模擬污染的金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)仍然能檢測到100ng/ml。結論即食食品很容易被金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)污染，其LD值為0.023-5ug/kg，這就要求及時對即食食品批量的快速定量檢測。本研制適用于現場快速檢測的雙抗體夾心膠體金免疫層析試紙條。該試紙條的標記物和被標記抗體通過靜電引力和疏水作用結合，因而不會影響抗體活性。膠體金本身具有肉眼可見的顏色，無需儀器即可判讀結果。無需洗滌，不形成免疫復合物的標記抗體通過層析作用自動分離，既筒化了操作步驟，又減少了影響實驗結果的干擾因素。該法通常能在5-10min完成檢測，樣品處理方法簡便、操作靈活、運輸方便、不需要其他輔助儀器，結果可直觀判斷，而且試紙條自帶質量控制線，實驗結果一目了然，為現場檢測提供最佳檢測法尤其是對被金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)污染的即食食品的檢測具有簡便、快速、特異、敏感、穩定等特點，有利于對金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)引起食物中毒的及時診斷。因此，該試紙條具有廣闊應用前景。本發明還將膠體金測試條與膠體金生物傳感器有機整合為膠體金定量檢測系統。運用膠體金免疫分析儀的優勢在于，判讀儀能夠在人眼無法正確識別可疑物檢測是否存在陽性的情況下，正確判讀該試紙條檢測結果。減少了因人為主觀判讀帶來的錯誤率，增加了客觀性、準確性；并且。并且經過整個檢測系統的優化克服了檢測血清、食品、飲料等樣品時出現假陽性的現象可實現定量檢測。此外，膠體金免疫分析儀攜帶方便、使用簡單、判定準確、結果客觀、易保留，為檢驗檢驗工作帶來了方便。1權利要求1.一種檢測金葡菌腸毒素B型的方法，其中包括將待測標本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入檢測試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結果；所述檢測試紙包括(1)反應支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有金葡菌腸毒素B型抗體和質控抗體的檢測條帶和質控條帶；(4)金標抗體墊，其中含有膠體金標記的金葡菌腸毒素B型抗體；(5)樣品墊；其中所述抗SEB的抗體可以是多克隆抗體，也可是單克隆抗體；多抗可選自兔抗SEB、鼠抗SEB；質控抗體可選自羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠的IgG。2.根據權利要求1或2所述的方法，其中，吸水墊選用濾紙，反應支持物選用PVC板，金標抗體墊的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，樣品墊的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。3、根據權利要求3所述的方法，其中，所述試紙中的反應支持物(5)位于底層，硝酸纖維膜(2)位于反應支持物(5)上的中部，該膜的T處是兔抗SEB多克隆抗體包被的檢測條帶，并且C處是羊抗兔IgG包被的質控條帶；金標抗體墊(3)位于硝酸纖維膜上部的一側并與之部分重疊，該墊含有膠體金標記的兔抗SEB多克隆抗體；吸水墊(1)位于硝酸纖維膜(2)上部的相對于金標抗體墊(3)而言的另一側并與硝酸纖維膜(2)部分重疊，樣品墊(4)位于硝酸纖維膜(2)上與吸水墊(1)相反的一側并與金標抗體墊(3)部分重疊。4、根據權利要求3所述的方法，其中，吸水墊一側為起始端，樣品墊一側為末端，；險測抗體的條帶位于接近末端，質控條帶接近于起始端。5、根據權利要求3所述的方法，其中，SEB重組抗原，兔多抗。6、根據權利要求5所述的方法，其中，所述兔抗SEB多克隆抗體的濃度為3-8mg/ml。7、根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中，質控抗體濃度為0.1-5mg/ml。8、根據4又利要求1-7任一項的方法，其中，所述抗SEB抗體標記lml膠體金的量為5-20ug。9、一種權利要求1-8任一項所述方法中的所述金葡菌腸毒素B型的檢測試紙的制備方法，該方法包4舌(1)用隔流噴金劃線機以一定噴膜速度噴涂抗SEB抗體和質控抗體兩個條帶的硝酸纖維膜；(2)制備一種含有膠體金標記的抗SEB抗體的玻璃纖維膜，將膠體金標記的抗SEB抗體均勻涂布在玻璃纖維膜上，并烘干或冷凍干燥。10、由權利要求9所述的方法制備的檢測金葡菌腸毒素B型的試紙。全文摘要本發明提供一種檢測金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)的膠體金免疫層析方法，能快速、靈敏、特異、準確地檢測樣品中的金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)，并可實現定量，適用于現場快速檢測。文檔編號G01N33/577GK101666802SQ20091009004公開日2010年3月10日申請日期2009年7月29日優先權日2009年7月29日發明者姚李四,姜永強,孫肖紅,張曉龍,宇楊,靜王,胡孔新申請人:中國檢驗檢疫科學研究院