專利名稱：一種新的快速定量檢測單增李斯特菌的膠體金免疫層析方法以及膠體金免疫檢測試紙條的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物檢測領域，具體涉及單增李斯特菌的檢測快速定性 和定量檢測方法以及膠體金免疫檢測試紙條。
背景技術：
單核細胞增生李斯特菌(Listeria mo跳ytogenes，單增李斯特菌)， 是李斯特菌屬(Listeria)中最重要的人類食源性病原菌，也是一種人畜 共患的致病菌，屬李斯特菌屬，它可引起人和動物患腦膜炎、腦炎、敗 血癥、心內膜炎、流產、死胎及膿腫等，發病者死亡率可達30%—40%。近 年來已有不少國家報道了由于污染單增李斯特菌發生的食物中毒事件。 因此，世界各國政府部門對單增李斯特菌引起的食物中毒越來越重一見， 紛紛制定了一些新的食品安全法規，并"fe單增李斯特菌納入法定強^r項 目。
目前單增李斯特菌的檢測方法主務農靠傳統的分離養(參見吳清 平等."單核細胞增生李斯特菌檢測技術研究進展"，J .中國衛生枱二-瞼 雜志，2005 ，15 (7) :888 - 890; Robin L T Churchill ， Hung Lee ，et al. " Detection of Listeria mono2 cytogenes and the toxin 1 isteriolysin 0 in food" J .Journal of Mi 2 crobiological Methods, 2006 ，64:141 - 170.)和生化鑒定，該方法費時費力。月交體 金快速診斷試紙條技術是20世紀90年代以來發展起來的一項新型體 外診斷技術(參見李永勤，楊瑞馥."以膜為固相載體的免疫膠體金快 速試驗"，J .微生物學免疫學進展，2003 ,31 (1) :74 - 78.)。近年 來該方法發展迅速，在生物醫學領域特別是醫學檢驗中得到了廣泛應 用，但用于食品衛生領域檢測的產品較少。本研究針對單增李斯特菌研 制出了食品污染單增李斯特菌的免疫膠體金檢測試紙條。本研究建立的 膠體金檢測方法靈敏、準確、特異性強，可進一步應用到檢驗檢疫部門對進出口食品中單增李斯特菌的檢測實際工作中。此方法建立后，可與 經典常規方法互補，預計將在檢驗檢疫、食品工業部門及衛生監控部門 具有較廣的應用前景，有一定的經濟和社會效益。同時，可為食品樣吏生 物檢驗國際方法的修訂或增補提供科學依據。
發明內容
單增李斯特菌在美國被列為7種主要的食源性致死病菌之一 ，WHO 食品安全工作計劃已將其列為重點檢測的食源性病菌之一 。即食食品4艮 容易被單增李斯特菌污染，這就要求及時對即食食品批量的快速檢測。
本發明涉及一種膠體金免疫層析技術快速定量檢測單增李斯特菌的 方法及其產品。本發明的方法利用膠體金標記和雙抗體夾心免疫層析4支 術，建立單增李斯特菌的快速檢測方法，評價其特異性和敏感性，并扣乂 合檢測曲線進行定量檢測；在奶粉、牛奶、火腿腸等食品樣品中添加單 增李斯特菌模擬污染樣品，評價該方法對固體、半固體、液體等食品、 可疑生物恐怖樣品的檢測能力。本發明的方法可在15min內完成定性和 半定量檢測，靈敏度為lng/ml，線性范圍105cfu/ml—108cfu/ml、回4欠 率98%—101%。該法特異性、穩定性良好，可對樣品直接進行檢測。本發 明建立的檢測單增李斯特菌的膠體金免疫層析方法，能快速、靈敏、特 異、準確地檢測樣品中的單增李斯特菌，并可實現定量，適用于現場'決 速檢測。
一種檢測單增李斯特菌的方法，其中包括將待測標本與樣品稀釋、液 混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用 上行，10-15分鐘判讀結杲；所述試紙包括
(U反應支持物；
(2 )吸水墊；
(3 )硝酸纖維膜，該膜包被有單增李斯特菌抗體和質控抗體的4企測 條帶和質控條帶；
(4 )金標抗體墊，其中含有膠體金標記的單增李斯特菌P60抗
體；
(5 )樣品墊；
其中單增李斯特菌抗體可以是多克隆抗體，也可是單克隆抗體；質
5控抗體可選自羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊
抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠的IgG。
本發明方法中所述的檢測試紙，其中吸水墊選用濾紙，反應支持物
選用PVC板，金標抗體墊的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，樣 品墊的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
本發明方法中所述的試紙，其中吸水墊、金標抗體墊、反應支持物、 硝酸纖維膜和樣品墊按照附圖1所示方式構成；反應支持物5位于底yg, 硝酸纖維膜2位于反應支持物5上的中部，該膜的T處是單增李斯特菌 P60多克隆抗體包被的檢測條帶，并且C處是羊抗兔IgG包被的質控條帶； 玻璃纖維膜3位于硝酸纖維膜上部的一側并與之部分重疊，該膜含有月交 體金標記的單增李斯特菌P60多克隆抗體；吸水墊1位于硝酸纖維膜2 上部的相對于玻璃纖維膜3而言的另一側并與2部分重疊。樣品墊4位 于2上與1相反的一側并與3部分重疊。
本發明方法中所述的試紙，其中吸水墊一側為起始端，玻璃纖維膜 一側為末端，檢測抗體的條帶位于接近末端，質控條帶接近于起始端。
本發明方法中所述的試紙，其中所述抗單增李斯特菌的抗體可以是 多抗，也可是單抗；質控抗體根據金標抗體的免疫源可選4奪羊抗兔、鼠 抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠等 的IgG。
本發明方法中所述的試紙，其中所述抗單增李斯特菌P60多克隆抗 體的濃度為0. 5-5mg/ml。質控抗體濃度為0.1-2 mg/ml。所述抗單增李 斯特菌P60抗體標記lml膠體金的量為5-20ug。
本發明所述的單增李斯特菌的檢測試紙的制備方法，該方法包括 (1)用隔流噴金劃線機以一定噴膜速度噴涂抗單增李斯特菌抗體和 ;質控抗體兩個條帶的硝酸纖維膜；
(2 )制備一種含有膠體金標記的抗單增李斯特菌抗體的玻璃纖維 膜，將膠體金標記的抗單增李斯特菌抗體均勻涂布在玻璃纖維膜上，并 供干或冷凍干燥。
本發明所述的試紙在檢測單增李斯特菌中的應用，其中包括將待測 > 標本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，樣品中的 液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結果。本發明還提供由所述的方法制備的檢測單增李斯特菌的試紙。
本發明所述方法中采用抗原及抗體，其中單增李斯特菌例如是
Listeria monocytogenes,菌號19111，可購自衛生部藥品生物制品檢定 所；單增李斯特菌P60多抗例如是Listeria monocytogenes, multiple cloning antibody of P60，可購自吉4木省枱r'瞼4企疫局；羊抗兔IgG可購 自鼎國生物技術公司。此處與抗原結合的可以是多抗，也可以是單抗， 只是本實驗所選用的是P60多抗，來自吉林局；而此處凈皮;險測物體是菌 液，而不是抗原，只是利用了抗原抗體特異性結合的原理，被檢測物體 可以是其他單增李斯特菌抹，本實驗采用的是我們檢科院其中一林單增 李斯特菌，菌號是19111。
本發明的產品和方法中使用層析測試條耗材，例如結合墊(玻璃纖 維)、硝酸纖維素膜(NC膜，SHF 1350225)、樣品墊及吸水墊、濾紙，購 自Minipore公司。
根據檢測試紙，其中吸水墊選用濾紙，反應支持物選用PVC板，金標 抗體保護膜的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，樣品墊的材料選 自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
本發明使用的實驗儀器例如是金標免疫分析儀，可購自中國科學院 上海光學精密機械研究所、中國檢驗檢疫科學研究院聯合研制。
圖1為單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條的^^測每文感性。
圖2為特異性;險測結果示意圖；其中，1:單增李斯特菌，2:金黃 色葡萄球菌，3:大腸桿菌0157: H7, 4:肉毒毒素，5:鼠疫菌，6:相 思子毒素7:空白對照。
圖3為單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條檢測系統擬合工作曲線； X :各濃度下金標免疫分析儀讀值T/C比值；Y:單增李斯特菌濃度。
圖4為單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條穩定性;險測；其中，1: 單增李斯特菌108CFU/mL， 2: 1°/。BSA， 3:金黃色葡萄球菌108CFU/mL， 4: 空白對照。
具體實施方式
實施例1:膠體金免疫層析試紙條的制備
1、 抗原及抗體
單增李斯特菌為Listeria monocytogenes，菌號19111,來源于衛 生部藥品生物制品檢定所，
單增李斯特菌 P60多抗為 Listeria monocytogenes, multiple cloning antibody of P60來源于吉林省抬r'瞼檢疫局)，
羊抗兔IgG可購自鼎閨生物技術公司。
2、 層析測試條耗材
結合墊(玻璃纖維)、硝酸纖維素膜(NC膜，SHF 1350225)、樣品墊及 吸水墊、濾紙購自Minipore公司。
3、 實驗儀器
金標免疫分析儀(中國科學院上海光學精密機械研究所、中國檢-瞼檢 疫科學研究院聯合研制)。 4 、 膠體金免疫層析試紙條的制備
4、 l膠體金結合墊
將pH值7. 5 ~ 8. 0、濃度0. 2mg/ml的單增李斯特菌P60多抗克隆體 標記于檸檬酸鈉法制備25nm的膠體金顆粒的膠體金顆粒，37'C干燥。 4. 2硝酸纖維素膜
檢測帶單增李斯特菌抗體P60多克隆抗體1. 5mg/ml +2%BSA;質控 帶羊抗兔IgG: lmg/ml， 37。C干燥[6-9]。 4. 3組裝
將樣品墊、結合墊、吸水墊依次貼在帶有貉合劑的底襯卡，切成0. 4cm 的條，干燥，裝殼，室溫貯存備用。
實施例2:樣品的定性和定量檢測
1、 樣品的處理
用樣品處理液(5mM PB pH7. 4)將火腿腸、奶4分、牛奶等粘稠液體 樣品進行梯度稀釋，火腿腸等固體食品按1/100 (W/V)加入樣品處理液 溶解，靜止取上清，靜止取上清。分別添加不同劑量的單增李斯特菌作 為才莫擬4企測樣品。
2、 定性檢測將處理后的樣品和樣品處理液(作為陰性樣品)lOOul加到制備好的 層析條樣品墊端，靜置15min，觀察結果。檢測帶和質控帶均出現紅色判 為陽性，僅質控帶出現紅色為陰性，檢測帶和質控帶均不顯色，則為試 紙條失效。 3、定量4企測 3.1、判定值的確定
按1. 6. 1將陰性樣品檢測20次，用金標免疫分析儀掃描讀取信號T/C 比值。20個樣品T/C比值的平均值(AVERAGE)與3倍標準差(STDEVA)之和 為CUT-OFF值。 3.2 、定量;f企測判定
將顯色后的金標條放入金標免疫分析儀掃描，讀取信號T/C比值， 大于判定值為陽性。
實施例3:靈敏度試驗 1、定量檢測的靈敏度
檢測不同濃度單增李斯特菌，經過計算判定值(CUT-OFF)為0. 017, 濃度為10、fu/ml、 102cfu/ml的單增李斯特菌的平均T/C比值為的值均 為0.00,低于0.017，為陰性；103cfu/ml~108cfu/ml的單增李斯特菌 的平均T/C比值分別為的值均高于0. 017結果為陽性；當單增李斯特菌 濃度大于103cfu/ml時，T/C比值平均值大于0. 017,故定量4企測靈壽文度 為103cfu/ml。
表1單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條各濃度4企測結果
序號檢測值T (V)質控值C (V)T/C結果判
T2Cic2T/C2T/C平讀
陰性O扁00.5570.553000—
101 cfti/ml0.000.000.6020.589000—
102 cfWml0.000.000.6110.654000—
103 cfu/ml0.0150.0130.5890.6360.020.020.02+
104 cfti/mlO細0.0850.7170.7960.120.110.115+
105 cfli/ml0.2160.03l細0.7530.250.040,145+<formula>formula see original document page 10</formula>
2、直觀檢測靈敏度
按確定的最佳反應條件制備膠體金免疫層析試紙條，檢測不同濃度 的單增李斯特菌。將單增李斯特菌用樣品處理液稀釋成濃度依次為
108cfu/ml; 107cfu/ml; 106cfu/ml; 105cfu/ml; 104cfu/ml; 103cfu/ml;
102 cfu/ml; 10'cfu/ml，同時進行;險測。結果如圖1所示，靈壽丈度為 104cfu/ml顯色更加清晰。
實施例4:標準曲線擬合實驗
以T/C為才黃坐標，以LOG10樣品濃度Y直(101 cfu/ml, 102 cfu/ml，
103 cfu/ml, 104cfu/ml， 105cfu/ml， 106cfu/ml， 107cfu/ml， 108 cfu/ml) 為縱坐標，擬合標準曲線(見圖3)。
檢測單增李斯特菌各個濃度下，判定值(CUTOFF)為0. 017的T/C讀 值。可見小于103 cfu/ml為陰性，105cfu/ml—108cfu/ml線性關系良好， 擬合曲線見圖3。線性方程為y=99. 701x-9. 502;R2 =0. 997。
實施例5:特異性試驗
按確定的最佳反應條件制備膠體金免疫層析試紙條，以樣品稀釋液 同樣分別處理金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157:H7、肉毒毒素、鼠疫菌等 球菌或桿菌、至1 xios CFU/ ml ，以制備好的膠體金免疫層析試紙條 檢測，并與同樣菌數的單增李斯特菌樣品對照，同時檢測空白對照。結 果如圖2所示。
實施例6:回收率試驗
在線性檢測范圍內，檢測已知濃度的單增李斯特菌，根據金標分析 儀讀值T/C比值和標準曲線計算出檢測濃度，檢測濃度與理論濃度的比 值百分率為回收率。由表2可見，以LOG10樣品濃度(10'cfu/ml —108cfu/ml)和T/C值根據擬合曲線方程來計算回收率，可見l()5cfu/ml108cfu/ml之間回收率在98%一101°/之間。
表2單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條檢測系統回收率
信號值 T/C濃度值檢測值C ( V )回收率
0. 145105cfu/mlIO495 cfu/ml101. 1%
0. 1565106cfu/ml1061。 cfu/ml98, 36%
0. 165107cfu/ml10695 cfu/ml100. 7%
0. 1755108cfu/ml10796 cfu/ml100. 5%
實施例7:穩定性試驗
取在37 。C放置的單增李斯特菌膠體金檢測試紙條進行檢測，第7 天的檢測結果可見單增李斯特菌測試條的穩定性良好，在37 。C放置7 天后仍能特異性的檢出單增李斯特菌，而且敏感性也未下降。和新制備 的檢測試紙條相比，靈敏度沒有明顯下降，且特異性良好。參見附圖4, 圖中1、單增李斯特菌108 CFU/mL， 2、 1°/。BSA， 3、金黃色葡萄J求菌 108CFU/mL, 4、空白對照；37° C放置7天后的單增李斯特菌"交體金4企測 試紙條仍可以檢測出單增李斯特菌108 CFU/mL,并且與其他食源菌沒有 交叉反應，穩定性良好。
實施例8:檢測樣品的實驗
火腿腸50 mg、奶粉50 mg、牛奶250 u 1，分別加入到1 ml含單增李 斯特菌的樣品稀釋液中，混勻，靜置10 min ，再取1份培養后的菌液，用 PB10倍系列稀釋進行檢測。試紙條檢測模擬污染樣品試驗的結果表明， 該試紙條檢測食品中模擬污染的單增李斯特菌仍然能檢測到105 CFU/ ml。
結論
本發明適用于現場快速^r測的雙抗體夾心膠體金免疫層析試紙條。 該試紙條的標記物和被標記抗體通過靜電引力和疏水作用結合，因而不 會影響抗體活性。膠體金本身具有肉眼可見的顏色，無需儀器即可判讀結果。無需洗滌，不形成免疫復合物的標記抗體通過層析作用自動分離 既簡化了操作步驟，又減少了影響實驗結果的干擾因素。
本發明的方法通常能在5~10 min完成才全測，樣品處理方法簡^更、 操作靈活、運輸方便、不需要其他輔助儀器，結果可直觀判斷，而且試 紙條自帶質量控制線，實驗結果一目了然，為現場檢測提供最佳檢測法 尤其是對被單增李斯特菌污染的即食食品的檢測具有簡便、快速、特異、 敏感、穩定等特點，有利于對單增李斯特菌引起食物中毒的及時診斷。 因此，該試紙條具有廣闊應用前景。
本研究還將膠體金測試條與膠體金生物傳感器有機整合為膠體金定 量檢測系統。運用膠體金免疫分析儀的優勢在于，判讀儀能夠在人眼無 法正確識別可^_物;險測是否存在陽性的情況下，正確判讀該試紙條4企測 結果。減少了因人為主觀判讀帶來的錯誤率，增加了客觀性、準確性； 并且。并且經過整個檢測系統的優化克服了檢測血清、食品、飲料等樣 品時出現假陽性的現象可實現定量檢測。此外，膠體金判讀儀攜帶方便、 使用簡單、判定準確、結果客觀、易保留，為檢驗檢驗工作帶來了方便。
權利要求
1、一種檢測單增李斯特菌的方法，其中包括將待測標本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10-15分鐘判讀結果；所述試紙包括(1)反應支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有單增李斯特菌抗體和質控抗體的檢測條帶和質控條帶；(4)金標抗體墊，其中含有膠體金標記的單增李斯特菌P60抗體；(5)樣品墊；其中，單增李斯特菌抗體可以是多克隆抗體，也可是單克隆抗體；質控抗體可選自羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠的IgG。
2、 根據權利要求1所述的方法，其中，吸水墊選用濾紙，反應支持物選 用PVC板，金標抗體墊的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，樣品 墊的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。
3、 根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述試紙中的反應支持物(5 ) 位于底層，硝酸纖維膜(2)位于反應支持物(5)上的中部，該膜的T 處是單增李斯特菌P60多克隆抗體包被的檢測條帶，并且C處是羊4元兔 IgG包被的質控條帶；金標抗體墊(3)位于硝酸纖維膜上部的一側并與 之部分重疊，該墊含有膠體金標記的單增李斯特菌P60多克隆抗體；吸 水墊(1)位于硝酸纖維膜(2 )上部的相對于金標抗體墊(3 )而言的另 一側并與硝酸纖維膜(2 )部分重疊，樣品墊(4 )位于硝酸纖維膜(2 ) 上與吸水墊(1)相反的一側并與金標抗體墊(3 )部分重疊。
4、 根據權利要求3所述的方法，其中，吸水墊一側為起始端，樣品墊一 側為末端，檢測抗體的條帶位于接近末端，質控條帶接近于起始端。
5、 根據權利要求3所述的方法，其中，所述單增李斯特菌的抗體是單增 李斯特菌P60多克隆抗體，其濃度為0. 5-5mg/ml。
6、 根據權利要求5所述的方法，其中，質控抗體濃度為0.1-2 mg/ml。
7、 根據權利要求6所述的方法，其中，所述抗單增李斯特菌P60抗體標 記lml膠體金的量為5-20ug。
8、 一種權利要求1-7任一項所述方法中的所述單增李斯特菌的檢測試 紙的制備方法，該方法包^^舌(1)用隔流噴金劃線^l以一定噴膜速度噴涂抗單增李斯特菌抗體和 質控抗體兩個條帶的硝酸纖維膜；(2 )制備一種含有膠體金標記的抗單增李斯特菌抗體的由玻璃纖維 膜構成的金標抗體墊，將膠體金標記的抗單增李斯特菌抗體均勻涂布在 玻璃纖維膜上，并烘干或冷凍干燥。
9、 由權利要求8所述的方法制備的檢測單增李斯特菌的試紙。
全文摘要
本發明建立的檢測單增李斯特菌的膠體金免疫層析方法，能快速、靈敏、特異、準確地檢測樣品中的單增李斯特菌，并可實現定量，適用于現場快速檢測。本發明屬于生物檢測領域，具體涉及單增李斯特菌的檢測快速定性和定量檢測方法以及膠體金免疫檢測試紙條。
文檔編號G01N33/558GK101609095SQ200910090040
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月29日 優先權日2009年7月29日
發明者姚李四, 孫肖紅, 張曉龍, 宇 楊, 靜 王, 王振國, 胡孔新, 謝士嘉 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院