專利名稱：一種定量檢測血液中腫瘤相關抗原125的磁性免疫層析試紙條及制備方法
技術領域：
本發明屬于醫學檢驗領域，特別是涉及一種定量檢測血液中腫瘤相關抗原125的 磁性免疫層析試紙條及制備方法。
背景技術：
腫瘤相關抗原125(CA125)，分子量可達220000 1000000之間，糖基含量僅占總 蛋白質量的24%。 CA125是由鼠抗人乳頭狀囊性卵巢上皮細胞系0C125制備而成。血清 CA125水平升高是腫瘤存在與復發的可靠指標。80 90%的卵巢上皮癌中CA125可明顯升 高，子宮內膜癌、透明細胞癌、輸卵管癌及未分化卵巢癌患者中CA125含量也可明顯升高； 粘液性卵巢癌患者的陽性率則較低，CA125在卵巢包塊良惡性的鑒別上特別有價值，敏感度 為78% 、特異性95% 、陽性預測價值82% 、陰性預測價值91 % 。 CA125和CEA聯合測定，計 算兩者比值，可提高卵巢癌檢出的敏感性和特異性。非卵巢癌類的惡性腫瘤，如胰腺、肝、 胃、腸、子宮和乳腺癌癥患者中CA-125的陽性率可分別高達73%、70%、53%、27%、22%和 20% 。然而CA-125血清濃度輕微上升還可見于1 %健康婦女，3 6%的良性卵巢疾患或非 腫瘤患者，包括孕期起始3個月、行經期、子宮內膜異位、子宮纖維變性、子宮肌瘤、良性卵 巢瘤、急性輸卵管炎、急性胰腺炎、肝病、胸腹膜和心包感染等，應注意排除。但需要指出的 是以血清CA125水平升高來診斷復發的敏感性低于特異性，即血清CA125升高在很大程度 上提示復發，但正常的CA125既不表明無腫瘤存在也不表明無腫瘤進展。
目前的血液中CA125的診斷技術主要包括放射免疫分析(RIA)，酶聯免疫分析 (ELISA)、化學發光免疫分析(CLIA)、時間分辨熒光免疫分析、膠體金免疫層析等方法，但這 些方法都有各自的特點及不足放射免疫是臨床比較常用的方法，優點是結果比較準確，線 性范圍較寬，缺點是操作繁瑣，耗時長，且放射性標記物會對操作者產生危害，并且會產生 環境污染，目前已經逐漸被其他方法所替代。ELISA和化學發光以及時間分辨熒光法原理類 似，只是因為最終的檢測系統有所區別而在靈敏度方面有差異，目前已經實現自動化、大批 量、定量檢測，但是存在方法間結果差異大，線性范圍較窄等缺點，同時，自動化檢測目前由 國外大廠商所壟斷，儀器設備昂貴，并且不適合單人份和較小批量檢測用，大大限制了它們 在基層醫院、診所的應用。近年來出現了膠體金免疫層析法來檢測CA125，快速，便捷，單人 份操作，但是缺點是只能實現半定量，只能指示一個大概范圍，無法實現精確定量，異常標 本需要使用其他方法復核檢測，增加了被測試者的就醫成本，在市場推廣方面有較大難度， 很難廣泛使用。 磁性免疫層析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年來出現的一 種單人份快速定量檢測技術。是以超順磁性顆粒(superPMPs)代替傳統的標記物(膠體金， 乳膠顆粒等)來進行免疫層析，通過檢測結合在超順磁性納米微粒上的生化物質來提供對 生物樣品的定量檢測數據。通過檢測測量磁場強度來表達標記在樣品區域的量，采用標記 的免疫復合物-磁場強度的標準曲線，從而達到定量的目的。該技術與傳統技術相比具有
4下述優勢1)分析靈敏度比各類目測快速診斷法靈敏10-100倍；2)分析速度可在15秒 內測量到多達6個分析位點的數據；3)線形范圍在4個數量級濃度范圍內呈線性；4)所用 磁性檢測儀器采用固相元件，微型化設計自成一體，獨立運行，體積小，操作簡便；5)超順 磁性納米微粒由聚合物包被，不會隨時間而衰變；獨立的快速診斷色譜卡(MAR Cassette) 可直接插入MAR檢測儀，為目前許多快速臨床診斷試劑的整合提供了廣泛的開發空間；而 且還避免了操作過程中人員或儀器可能發生的交叉污染，提高了分析和過程的安全性。該 技術繼承了傳統免疫層析法(膠體金，乳膠顆粒等)簡便快速，單人份操作的優點，又彌補 了傳統免疫層析技術靈敏度低，只能定性，不能定量的缺點，代表了當今即時檢驗(Point of Care Test，P0CT)技術發展的方向和潮流， 一經問世，發展迅速，目前已經成為替代傳統 免疫層析技術的首選。 將異硫氰酸熒光素(FITC)引入磁性免疫層析中，在極大地提高了檢測方法的靈 敏度的同時，又提供了一種極好的通用技術平臺，在規模化生產中減少了標記步驟，減少了 可變因素。
發明內容
本發明的目的即是將磁性免疫層析技術和異硫氰酸熒光素(FITC)系統聯合應用 在CA125定量檢測試紙條中，將抗熒光素抗體共價偶聯于超順磁顆粒上，將FITC-CA125抗 體與之混合之后作為檢測流動相，將另一株配對的CA125抗體包被于硝酸纖維素膜上作為 捕獲固相，按照常規免疫層析法的原理進行標本的檢測，結合簡便易行的磁性檢測儀進行 檢測，在實現高靈敏度檢測的同時既可以避免前述幾種檢測方法的種種弊端，又綜合了前 述幾種方法的優勢可以單人份檢測，也可以批量檢測，并且可以即時給出定量結果，測量 儀器簡單可靠，操作簡便，方便實用。 為達到上述的目的，本發明的技術方案如下一種定量檢測血液中CA125的磁性 免疫層析試紙條，該試紙條是在底板上依次相互交錯2mm地粘貼上包被膜、結合了 CA125抗 體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊、然后在上層覆蓋透明塑料密封膜組裝而成的試紙條，包被 膜上預包被有CA125抗體檢測線T和質控線C。 其中所述的樣品墊是經過樣品墊處理液預處理的纖維素膜，所述的樣品墊處理液 是含有1 % _5 %酪蛋白(Casein)和0. 1 % _1 %的聚乙烯醇(PVA)以及0. 01-0. 2 %吐溫 20 (Tween-20)的0. 02M pH7. 0-7. 6的磷酸鹽緩沖液(PBS)。 上述定量檢測血液中CA125的磁性免疫層析試紙條制備方法包括以下步驟
A、FITC-抗體的制備將CA125抗體對0. 02M pH7. 0_7. 6的PBS 4"透析過夜，調 整濃度為2mg/ml，將FITC使用二甲基甲酰胺溶解，終濃度為50mmol，以5 : 1的分子比例 向抗體溶液中加入所需量的FITC溶液，室溫反應1小時，對0. 02M， pH7. 0_7. 6的PBS 4°C 透析過夜，加入等體積甘油后_201:保存備用。 B、磁顆粒的制備選用直徑為100-300nm的超順磁顆粒，使用碳二亞胺(EDC)共價 偶聯的方式將抗熒光素抗體標記到磁顆粒上，將標記好的FITC-抗體以1 : 2-1 : 5的分 子比例(摩爾比)與偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒混合，確保偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒過 C、將制備好的磁顆粒使用定量噴液裝置以25 iU/cm-50 iU/cm的量噴涂于磁顆粒墊上； D、包被膜的制備使用包被緩沖液分別將抗CA125包被抗體以及FITC-BSA稀釋到 0. 5-2mg/ml濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0. 5_1. 0cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜 上，晾干后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35度烘干8小時，加入干燥劑封存備用；
E、樣品墊的處理將樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出 25-35t:烘干8小時； F、試紙條的組裝在透明塑料底板上依次相互交錯2mm地貼上包被膜、磁顆粒墊、樣 品墊、吸水墊，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜得到試紙板，根據要求寬度切割即得到試紙條。
進一步，上述的步驟B包括以下三步 1)偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒的制備使用含有O. 1XTween-20的50mM， pH7. 0-7. 6的PBS洗滌磁顆粒，加入EDC和抗熒光素抗體使抗熒光素抗體與磁顆粒的分子 比例為5 : 1(摩爾比)，室溫反應3小時，加入含有0. 5XBSA的0. 02M，pH7. 0-7. 6的PBS 室溫封閉30分鐘，用上述PBS洗滌磁顆粒，使用含有1% PVP，1% Casein, 0. 5% Tween-20， 5%蔗糖的50mM(pH8. 2_9. 0)硼酸保存緩沖液復溶磁顆粒，fC保存備用；
2)FITC-CA125抗體的制備將CA125抗體對0. 02M， pH7. 0-7. 6的PBS 4"透析過 夜，調整濃度為2mg/ml，將FITC使用二甲基甲酰胺(DMF)溶解，終濃度為50mM，以5 : 1的 分子比例向抗體溶液中加入所需量的FITC溶液，室溫反應1小時，對0. 02M， pH7. 0_7. 6的 PBS 4t:透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存備用； 3)FITC_抗體與偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒的混合，以0. 5 ii 1/mg磁顆粒的量向
偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒溶液中加入FITC-CA125抗體，充分混勻后使用保存緩沖液以
1:5-1: 20的比例(體積比)將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用。 進一步，上述的步驟C中，磁顆粒的噴涂方法是將制備好的磁顆粒使用定量噴膜
裝置以50iU/cm的量均勻噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥后加入干燥劑封存備用。 進一步，上述的步驟D中，包被膜的制備方法是用包被緩沖液(0. 02M pH 7. 2的
磷酸緩沖液)將CA125抗體稀釋為0. 5mg/ml，FITC-BSA稀釋為lmg/ml，使用定量噴膜裝置
以liU/cm的量將二者以0. 6cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉
液(含有0. 5% BSA的0. 02M PBS，pH7. 0_7. 6)中浸泡10分鐘后于25-35。C烘干8小時，加
入干燥劑封存備用。 與現有快速檢測試紙條相比較，本發明具有以下優點 1)通過對試紙條的改進，首次將磁性免疫層析技術引入CA125的檢測中，結合磁
性檢測儀，實現了 CA125的單人份寬范圍定量檢測，為臨床使用提供了極大便利。 2)通過引入異硫氰酸熒光素系統，使得試紙條的制備過程大大簡化，適合大規模生產。 本發明操作簡便，適合大規模生產，檢測所需的便攜式設備也已經上市，因此能廣 泛用于醫院、血站、防疫站、體檢等大批量使用單位以及一些采血現場、農村和基層診所等 小批量或單人份使用的單位使用。對于卵巢癌的定量診斷有著積極的意義。
圖1為本發明磁性免疫層析法定量檢測血液中CA125的試紙條結構示意圖
為進一步說明本發明磁性免疫層析法定量檢測血液中CA125的試紙條及制備方 法，特舉以下的實施例進行說明，該實施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發明。
具體實施例方式
本發明所述的定量檢測血液中CA125的磁性免疫層析試紙條如圖1所示，該試紙 條是在底板1)上依次相互交錯2mm地粘貼上包被膜2)、結合了 CA125抗體的磁顆粒墊3)、 樣品墊4)、吸水墊5)，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜6)組裝而成的試紙條，包被膜2)上 預包被有CA125抗體檢測線T和質控線C。 在具體實施例中，所采用CA125配對抗體為單克隆抗體技術制備的單抗。利用 雙抗體夾心檢測CA125抗原的原理檢測標本，當待測標本中含有CA125抗原時，抗原會先 和磁顆粒上偶聯的抗體結合，隨著層析作用的進行，結合物向前移動到達CA125抗體包被 線T處，抗原會再次和包被抗體結合形成雙抗體夾心復合物而聚集在T線處，另外，未結合 FITC-抗體的抗熒光素抗體標記磁顆粒會繼續前行，到達指控線C時，FITC-BSA會與抗熒 光素抗體結合從而在C線處同樣出現磁顆粒聚集。整個反應在30分鐘內進行完全， 一般反 應十五分鐘后即可進行上機讀卡，T線以及C線都會產生相應的磁性信號值，磁性免疫層析 檢測儀會根據檢測卡上的二維碼信息將實際測值代入預設的標準曲線即可得出確定量的 結果。整個讀卡、識別二維碼、將實測值代入預設標準曲線得出定量值的過程已經完全程序 化，磁性檢測儀會直接給出定量結果。 本發明所述的定量檢測血液中CA125的磁性免疫層析試紙條的制備方法見以下 實例 實施例1 定量檢測血液中CA125的磁性免疫層析試紙條及試紙盒的制備方法
本實施例的試紙條及試紙盒的制備方法包括以下步驟 A、抗體制備選用商品化的的CA125配對抗體，對20mM， pH7. 2(pH7. 0-7. 6均適 用)的PBS 4t:透析過夜備用。 B、包被膜的制備 包被緩沖液的配制0. 02M pH 7. 2的磷酸緩沖液(PB)為包被緩沖液，0. 22 y m微
孔濾膜過濾除菌后置4t:保存備用，有效期兩周。 封閉液的配制含0. 5% BSA的0. 02M， pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均適用)的磷酸鹽緩沖 液(PBS) ，0. 22 ii m微孔濾膜過濾除菌后置于4t:保存備用，有效期一周。
包被膜的制備用包被緩沖液(0. 02M PB，pH7. 2(pH7. 0-7. 6均適用))將CA125抗 體稀釋為0. 5mg/ml，FITC-BSA稀釋為lmg/ml，使用定量噴膜裝置以1 y 1/cm的量將二者以 0. 6cm的間隔均勻噴印于3. 5cm寬度硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉液(含有 0. 5% BSA的0. 02M PBS， pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均適用))中浸泡10分鐘后于25-35度烘干8
小時，加入干燥劑封存備用。
C、磁顆粒的制備 PBS緩沖液的配制用雙蒸水和磷酸二氫鈉及磷酸氫二鈉配制pH值為 7. 4 (pH7. 0-7. 6均適用)，濃度為50mM的PBS，加入Tween-20至終濃度為0. 1 % ， 0. 22 y m微
孔濾膜過濾除菌后4t:保存備用，有效期兩周。
硼酸保存緩沖液的配制用雙蒸水，硼酸和硼砂配制pH為8. 5(pH8. 2_9. 0均適 用)，終濃度為50mM的硼酸緩沖液，加入PVP， Casine， Tween-20，蔗糖，終濃度分別為1%， 1 % ， 0. 5 % ， 5 % ， 0. 22 ii m微孔濾膜過濾除菌后fC保存備用，有效期一周。
偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒的制備使用含有0. 1 % Tween-20的50mM， pH7. 4 (pH7. 0-7. 6均適用)PBS洗滌磁顆粒，加入EDC和NHS使二者終濃度均為20mmol，室 溫反應1小時，充分洗滌磁顆粒后，加入抗熒光素抗體使抗熒光素抗體與磁顆粒的分子比 例為5 : 1 (摩爾比)，室溫反應3小時，加入含有0. 5% BSA的0. 02M， pH7. 2 (pH7. 0_7. 6均 適用)的PBS室溫封閉30分鐘，使用含有0. 1% Tween-20的50mM，pH7. 4 (pH7. 0-7. 6均適 用)的PBS洗滌磁顆粒，使用含有1% PVP， 1% Casein, 0. 5% Tween-20， 5%蔗糖的50mMpH 8. 5 (pH8. 2-9. 0均適用)硼酸保存緩沖液，復溶磁顆粒，fC保存備用。
FITC-CA125抗體的制備方法是將CA125抗體對0. 02M， pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均 適用)的PBS 4t:透析過夜，調整濃度為2mg/ml，將FITC使用DMF溶解，終濃度為50mM， 以5 : 1的分子比例向抗體溶液中加入所需量的FITC溶液，室溫反應1小時，對0.02M， pH7.2(pH7.0-7.6均適用)的PBS 4"透析過夜，加入等體積甘油后-2(TC保存備用。
FITC-抗體與偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒的混合，以0. 5iU/mg的量向偶聯抗熒 光素抗體的磁顆粒溶液中加入FITC-CA125抗體，充分混勻后使用保存緩沖液以1 : 5的比 例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用。
D、磁顆粒的噴涂與凍干 使用BioDot噴膜儀的專用噴頭將處理好的磁顆粒以50 y 1/cm的量均勻噴涂于 0. 8cm寬度玻璃纖維墊上，過夜冷凍干燥，加入干燥劑封存備用，
E、樣品墊的處理 將1. 8cm寬度樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出25-35。C烘干 8小時。 樣品墊處理液是含有1% -5% Casein和O. 1% _1 %的PVA以及O. 01-0. 2% Tween-20的0. 02M， pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均適用)的PBS溶液。
F、試紙條的組裝及切割 下述所有操作都必須在濕度小于20%，溫度20-25t:的房間內進行。試紙板的組裝使用BioDot LM5000型組裝儀按照要求將3. 5cm包被膜，2. 5cm吸
水紙，O. 8cm磁顆粒墊，1. 8cm樣品墊組裝于9. 8cm寬度透明塑料底板上，覆蓋上層透明塑料
蓋板，組裝成試紙板。 試紙條的裁切使用BioDot CM4000型切條機將組裝好的試紙板切成0. 5cm寬的 成品試紙條。 G、試紙卡的組裝 將本發明所述的切割好的單人份試紙條置于塑料底卡上的卡槽內，蓋上上蓋，使 用壓卡機將上下兩片塑料卡壓緊，確保整個試紙條處于繃緊狀態。加入干燥劑室溫封存備 用。 H、確定該批次的二維碼信息
品名CA125定量磁性檢測卡 批次試紙卡的組裝日期，格式為年/月/日，XXXX/XX/XX
判讀標準的確定取CA125標準抗原原料，以國家標準品為參照標準進行標定，用 標準品稀釋液稀釋成400U/mL， 200U/mL， 100U/mL， 50U/mL， 15U/ml，每個標準點作10個測 試，按照統計學方法確定每個標準點與磁性測量值的關系并建立方程使之擬合成線性，此 方程和標準曲線即可使磁性檢測儀得以確定標本測量值。標準品稀釋液配方20mmo1 PBS， pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均適用)，0. 5% BSA，O. 01%
NaN3。 1、二維碼的打印粘貼 將上述二維碼信息輸入二維碼打印機內并打印，將二維碼粘貼于試紙卡的特定位 置，使用二維碼粘貼位置檢測器隨機抽檢2%確保二維碼粘貼無誤。
J、成品包裝 將貼好二維碼的單人份試紙卡與一包干燥劑密封于鋁箔袋內，100人份為一個包 裝置于一個包裝盒內，一盒一份說明書和1瓶10ml裝層析緩沖液即制成試紙盒，該試紙盒 于室溫避光保存，保質期為18個月。 層析緩沖液配方為1% Tween-20，0. 5% Triton X_100， 1 % NP_40，0. 05% NaN3， 20mmolPBS， pH7. 2 (pH7. 0-7. 6均適用)。
實施例2 除了偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒的制備的步驟中抗熒光素抗體使抗熒光素抗體 與磁顆粒的比例為l : 2，其它步驟同實施例1，
實施例3 除了偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒的制備的步驟中抗熒光素抗體使抗熒光素抗體 與磁顆粒的比例為l : IO，其它步驟同實施例1。
實施例4 除了 FITC-抗體與偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒的混合步驟中充分混勻后使用保 存緩沖液以l : 5的比例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用，其它步驟同實施例1。
實施例5 除了 FITC-抗體與偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒的混合步驟中充分混勻后使用保 存緩沖液以l : 20的比例將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用，其它步驟同實施例1。
實施例6 本發明的檢測卡的使用方法
1、加樣 從包裝盒中取出單人份的檢測卡，撕開鋁箔帶包裝，將試紙卡置于平整桌面上，用 微量移液器取50 1樣本血清加入卡上的加樣孔內，再加入50 1層析緩沖液，等待反應進 行15分鐘。 2、測量及結果輸出 將檢測卡插入磁性免疫層析檢測儀的插卡口 ，運行儀器，儀器會自行讀取卡的二
維碼信息，進行測量并即時打印測量結果，陰陽性結果會在打印結果中顯示。 實施例7本發明的試紙條的方法學鑒定 按照本領域中常規的制造及檢定規程對實施例1中制備的試紙條進行檢定，
(1)試紙條靈敏度實驗
以SO校準品進行10次重復測定，其平均值加上兩倍標準差帶入曲線方程所得的 濃度值為試紙條的靈敏度，其靈敏度為2. 6U/mL。
(2)試紙條特異性實驗 與其類似物作交叉反應實驗，交叉反應率< 0. 01 % 。
(3)試紙條精密性實驗
批內變異 取低、中、高三份質控血清樣品分別進行IO孔平行實驗，計算測定值的平均值(？) 和標準差(s)。按公式CV二s/iX100X計算變異系數，批內變異系數CV分別為6.3X， 4. 9%，4. 1%。
批間變異 選擇5份不同濃度的血清樣品對每份血清進行3次重復測定，計算其批間變異系 數(CV% )，批間變異CV在7. 21 9. 5%之間。
(4)試紙條穩定性實驗 試紙條保存條件為18-26°C ，經過18個月的測定試紙條的各項指標均滿足要求， 考慮到運輸和使用過程中對試紙條的影響，我們進行37°C 7天的加速實驗，實驗結果表明 試紙條的各項指標完全符合要求。 說明"定量檢測血液中CA125的磁性免疫層析試紙條及試劑盒"的靈敏度、特異 性、精密性和穩定性是完全合格的。
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權利要求
一種定量檢測血液中腫瘤相關抗原125(CA125)的磁性免疫層析試紙條，其特征在于該試紙條是在底板上依次相互交錯2mm地粘貼包被膜、結合了CA125抗體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊、然后在上層覆蓋透明塑料密封膜而組裝成的試紙條，包被膜上預包被有CA125抗體的檢測線T和質控線C。
2. 根據權利要求1的定量檢測血液中CA125的磁性免疫層析試紙條，其特征在于所 述的樣品墊是經過樣品墊處理液預處理的纖維素膜，所述的樣品墊處理液是含有1% _5% 酪蛋白和0. 1% _1%的聚乙烯醇以及0. 01-0. 2%吐溫-20的O. 02M， pH7. 0-7. 6的磷酸鹽 緩沖液。
3. 根據權利要求1的定量檢測血液中CA125的磁性免疫層析試紙條制備方法，其特征 在于包括以下步驟A、 異硫氰酸熒光素(FITC)抗體的制備選用FITC進行CA125抗體的標記；B、 磁顆粒的制備選用直徑為100-300nm的超順磁顆粒，使用碳二亞胺共價偶聯的方 式將抗熒光素抗體標記到磁顆粒上，將標記好的FITC-抗體以1 : 2-1 : 5的分子比例(摩 爾比)與偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒混合，確保偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒過量；C、 將制備好的磁顆粒使用定量噴液裝置以25 iU/cm-50 iU/cm的量噴涂于磁顆粒墊上；D、 包被膜的制備使用0. 02mM， pH7. 0_7. 6的PBS，分別將抗CA125包被抗體以及 FITC-牛血清白蛋白稀釋到0. 5-2mg/ml濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0. 5_1. Ocm 的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，晾干后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35t:烘干8小時，加 入干燥劑封存備用；E、 樣品墊的處理將樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡處理1小時后取出25-35t:烘 干8小時；F、 試紙條的組裝在透明塑料底板上依次相互交錯2mm貼上包被膜，磁顆粒墊，樣品 墊，吸水墊，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜得到試紙板，根據要求寬度切割即得到試紙 條。
4. 根據權利要求3所述的磁性免疫層析法定量檢測血液中CA125的試紙條的制備方 法，其特征在于所述的步驟A如下將CA125抗體對0. 02M pH7. 0-7. 6的PBS 4。C透析過夜，調整濃度為2mg/ml，將FITC 使用二甲基甲酰胺溶解，終濃度為50mmol，以5 : 1的分子比例向抗體溶液中加入所需量 的FITC溶液，室溫反應1小時，對0. 02M，pH7. 0_7. 6的PBS 4"透析過夜，加入等體積甘油 后-2(TC保存備用。
5. 根據權利要求3所述的磁性免疫層析法定量檢測血液中CA125的試紙條的制備方 法，其特征在于所述的步驟B包括以下兩步1)偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒的制備使用含有O. 1 % Tween-20的50rnmo1， pH7. 0-7. 6的PBS洗滌磁顆粒，加入碳二亞胺和琥珀酰亞胺使二者終濃度均為20mmo1，室 溫反應1小時，充分洗滌磁顆粒后加入抗熒光素抗體使抗熒光素抗體與磁顆粒的分子比為 5 : 1(摩爾比)，室溫反應3小時，加入含有0. 5XBSA的0. 02M，pH7. 0-7. 6的PBS室溫封 閉30分鐘，洗滌磁顆粒，使用含有1 % PVP， 1 % Case in ， 0. 5% Tween-20， 5%蔗糖的50,1， pH8. 2-9. 0的硼酸保存緩沖液，復溶磁顆粒，4t:保存備用；2)FITC-抗體與偶聯抗熒光素抗體的磁顆粒的混合，以0.5iU/mg磁顆粒的量向偶 聯抗熒光素抗體的磁顆粒溶液中加入FITC-CA125抗體，充分混勻后使用保存緩沖液以 1:5-1: 20的比例(體積比)將混合物稀釋待噴涂玻璃纖維墊使用。
6. 根據權利要求3所述磁性免疫層析法定量檢測血液中CA125的試紙條的制備方法， 其特征在于所述的步驟C中，磁顆粒的噴涂方法是將制備好的磁顆粒使用定量噴膜裝置 以50iU/cm的量均勻噴涂于玻璃纖維上，冷凍干燥后加入干燥劑封存備用。
7. 根據權利要求3所述磁性免疫層析法定量檢測血液中CA125的試紙條的制備方法， 其特征在于所述的步驟D中，包被膜的制備方法是用包被緩沖液將CA125抗體稀釋為 0. 5mg/ml， FITC-BSA稀釋為lmg/ml，使用定量噴膜裝置以1 y 1/cm的量將二者以0. 6cm的 間隔噴印于硝酸纖維素膜上，室溫晾干30分鐘后于封閉液中浸泡10分鐘后于25-35t:烘干 8小時，加入干燥劑封存備用。
全文摘要
本發明涉及一種定量檢測血液中腫瘤相關抗原125的磁性免疫層析試紙條及其制備方法。該試紙條是在底板上依次相互交錯2mm粘貼上包被膜、結合了腫瘤相關抗原125抗體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜組裝而成的試紙條，包被膜上預包被有腫瘤相關抗原125抗體檢測線和質控線，本發明將磁性免疫層析技術和異硫氰酸熒光素系統引入到腫瘤相關抗原125的定量檢測中，大大提高了檢測靈敏度，并且可以準確的給出定量結果，操作簡便，診斷快速。
文檔編號G01N33/552GK101762699SQ20091008764
公開日2010年6月30日 申請日期2009年6月24日 優先權日2009年6月24日
發明者于尚永, 唐寶軍, 應希堂, 李強, 胡國茂, 鄭金來 申請人:北京科美東雅生物技術有限公司