專利名稱：一種新的檢測血清樣本中sars抗體的方法和產品的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的檢測血清樣本中SARS抗體的定量檢測方法和產品及 其制備方法。
背景技術：
在2002年冬到2003年春肆虐全球的嚴重急性呼吸綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS,傳染性非典型肺炎)的病原體SARS冠狀病毒 (SARS-CoV)就是冠狀病毒科，冠狀病毒屬中的一種。冠狀病毒是成人普通感 冒的主要病原之一，兒童感染率較高，主要是上呼吸道感染， 一般很少波及下 呼吸道。另外，還可引起嬰兒和新生兒急性腸胃炎，主要癥狀是水樣大便、發 熱、嘔吐，每天可拉10余次，嚴重者甚至出現血水樣便，極少數情況下也引起 神經系統綜合征。SARS-CoV為單股正鏈RNA病毒，屬巢狀病毒目，冠狀病毒 科，冠狀病毒屬。根據血清型，冠狀病毒屬主要分為3個Group,包括多種哺乳 動物冠狀病毒和鳥感染性支氣管炎病毒。SARS-CoV是引起人類嚴重疾病的第一 個冠狀病毒。SARS-CoV主要結構蛋白有S蛋白(刺突糖蛋白)、M蛋白(跨 膜蛋白)、E蛋白(包膜蛋白)、N蛋白(核殼體蛋白)。N蛋白是其中最穩定 的一個結構蛋白，也是感染過程中最豐富的病毒蛋白，證實是理想的診斷抗原。原或抗體主要有由雙抗原夾心測抗體、雙抗體夾心測抗原、竟爭法、間接法等。間接法測抗體的原理是特異性抗原結合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應抗體結合形成免疫復合物，洗滌后再加酶標記抗體與免疫復合物中的抗體結合形成酶標記抗體-抗體-固相抗原復合物，加底物顯色，判斷抗體含量。懸浮芯片(suspension array)^稱液相芯片，是20世纟己70年代美國Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術，利用帶編碼的孩t球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質等生物分子進行大規模測定。目前，該技術已廣泛應用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、抗體篩選及受體與配體的識別分 析等領域。目前發展的懸浮芯片主要是對于細胞因子的4企測。但是懸浮芯片是否能夠檢測人血清中的SARS抗體，尚缺乏模型和評價。 發明內容本發明涉及一種新的檢測血清中SARS抗體的蛋白懸浮芯片，該芯片包括 編碼微球，作為包被微球抗原的SARS-CoV N蛋白，生物素標記的羊抗兔IgG 作為檢測抗體，鏈親和素-藻紅蛋白和適宜的緩沖溶液，所述編碼微球優選是044 號編碼微球。所述的SARS-CoVN蛋白例如是重組SARS-CoV全長核蛋白-N32 (aal-422)和重組SARS-CoV核蛋白片段N13 (aa221-422),均經鎳親和柱純 化。本發明提供上述檢測SARS抗體的蛋白懸浮芯片的制備方法，其特征在于， 在相關緩沖溶液中，將編碼微球包被SARS-CoVN蛋白、生物素標記的4企測抗 體為羊抗兔IgG、鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)，所述編碼孩(球優選是044號編 碼微球，所述的SARS-CoV N蛋白例如是重組SARS-CoV全長核蛋白-N32 (aal-422)和重組SARS-CoV核蛋白片段N13 (aa221-422),均經鎳親和柱純 化。本發明提供一種SARS抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測方法，該方法采用間 接法檢測抗體的免疫學檢測原理，其特征在于，在檢測過程中所有反應可在96 孔濾板上或在微量離心管中進行，其中包括下列步驟(1 )每孔或管中加入含 有已包被捕獲抗原，即SARS-CoVN蛋白包被的編碼微球的工作溶液，用清洗 液清洗；(2)加入待測血清樣品，孵育后清洗；(3 )加入用生物素化的4企測 抗體，孵育后清洗；(4)加入鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE),孵育后清洗，(5) 加入檢測緩沖液后混勻，(6)用懸浮芯片系統讀取MFI數值(即平均熒光強度) 并分析數據判定檢測結果陰性或陽性。本發明還提供一種檢測血清樣品種SARS抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測方 法，其特征在于，該方法包括下列步驟(1)加入的陽性;險測樣品或標準品經 4倍梯度倍比系列稀釋，(2 )制作樣品濃度對應MFI值的劑量-反應標準曲線， (3 )用分析軟件擬合劑量-反應曲線和方程，(4 )可根據劑量-反應曲線判斷動 態檢測范圍，未知濃度樣品可根據劑量-反應方程計算出樣品檢測濃度，還可判 定方法檢測限。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不 同比例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏色，作為100種獨特5的色彩編號，每顆微球大小約5.5|am，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、 酶分析、受體和配體識別分析等，并根據不同研究目的而標定特定抗體、核酸 探針及各種受體探針。標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應。反應后， 利用機器自動將反應液吸起并通過一微細管檢測通道，每次僅允許一個微球通 過檢測通道。檢測通道中設有兩道激光， 一道為紅色，激發微球基質中的顏色， 識別微球分類編碼以確定檢測項目； 一道為綠色，激發報告分子的顏色，記錄 信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時， 兩道激光所激發的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中 的激發光可被檢測到。再通過機器與計算機自動統計分析兩道激光所激發的微 球種類與數量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本 中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數十種病原。懸浮芯片技術由于利 用微球在溶液中反應，克服了片膜芯片在大分子檢測時受表面張力、空間效應 等對反應動力學的影響，同時利用激光檢測技術，大大提高了樣品檢測的準確 性和重復性，具有優于片膜芯片的操作簡便、重復性好等特點。本發明人經過大量和深入的研究，對SARS抗體的蛋白懸浮芯片制備及其 檢測條件作了實質性的改進和創新，其具有下列優點1、 抗原包被量的改進SARS-CoV N蛋白的包被量是成功檢測的關鍵，本發明對包被微球的抗原 包被量進行實質性優化使血清樣本的檢測效果非常良好，并且包被懸浮芯片所 需的抗原包被量很低，本發明的抗原包被量為3-9pg/1.25xl()S個微球，即 6-36ng/2500"5000個孩"求/測試。2、 生物素標記的改進通常，標記抗體需要使用過量的生物素。理論上講，在檢測過程中，過量 的生物素因未標記上抗體而不被微球上結合捕獲抗體的抗體連接，清洗時凈皮抽 濾掉，不會與隨后加入的SA-PE反應，不影響檢測。但在實際檢測過程中，偶 爾遇到過檢測信號可能過高的現象，出現假陽性，因此建議生物素標記抗體后, 盡量去除多余的生物素。以標記2 mg/mL的IgG (分子量150,000) 1 mL溶液為 例，需加入10 mM生物素溶液約27 )oL。3 、 檢測的靈敏度及動態范圍本發明的血清樣品SARS抗體的定量^f企測方法和芯片與經典的免疫學 ELISA檢測方法相比，結果有著很好的吻合性(相關系數R、0.9994)。同時， 懸浮芯片方法靈敏度為402.9 pg/mL，高于ELISA方法的600ng/mL，靈敏度增6高1000倍以上；并且，本發明的懸浮芯片方法動態檢測范圍為 146.48-2400000pg/mLL，高于ELISA方法動態檢測范圍0.6-38.4ug/mL達2個數量級。4、 方法的特異性本發明通過選用SARS-CoVN蛋白為包被抗原，以兔抗SARS抗體為待測 抗體，以生物素化的羊抗兔為4全測抗體。本研究試驗"i正明，在存在鼠抗流感NP IgG、兔抗結核血清、兔抗結核抗體、兔抗鼠疫F1 IgG干擾抗體存在條件下本方 法具有良好的特異性。5、 樣品的檢測能力本發明評價了懸浮芯片方法對人血清中SARS抗體的檢測能力。通過對人 血清的檢測，初步證實了該方法在檢測人血清中SARS抗體實用性。
圖1: 044號微球包被SARS-CoVN蛋白檢測SARS抗體示意圖； 圖2:蛋白懸浮芯片方法檢測兔抗SARS抗體劑量-反應標準曲線圖； 圖3: ELISA方法檢測兔抗SARS抗體標準曲線圖； 圖4:蛋白質懸浮芯片與ELISA方法檢測兔抗SARS抗體的相關性。
具體實施方式
本發明涉及的檢測SARS抗體的蛋白懸浮芯片制備方法、檢測及定量方法 通過下面的具體實施方式
作進一步說明，但本發明不以任何方式受該實施例的 限定。一、材料1.蛋白懸浮芯片的相關緩沖液(1 ) PBS緩沖液(pH7.4) : NaCl 137mmol/L; KC1 2.7賺ol/L; Na2HP04 10mmol/L; KH2P04 2mmol/L。用800mL蒸餾水溶解8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4。用HC1調節溶液的pH值至7.4,加水至1L。分裝后 在15psi ( 1.05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘，或過濾除菌，保存于室溫。 (2)孩i球清洗液PBS (pH7.4) ， 0.05% TWEEN-20。 (3 )微球活化緩沖液100 mM NaH2P04: 3g NaH2P04, 5N NaOH 1.5 mL, 定容于250mL， pH6.2。液0.05MMES,pH5.0: 2.44gMES, 5NNaOH 0.15 mL， 定容于250mL。(5) 微球保存液PBS-TBN: PBS, 0.1%BSA, 0.02% T WEEN, 0.05%疊氮 化物，pH7.4。(6) 微球封閉液PBS-BN: PBS， 1%BSA， 0.050/。疊氮化物，pH7.4。(7) 4企測緩沖液PBS， 1%BSA, pH7.4。(8) 抗體稀釋液PBS， pH7.4。(9) 微球稀釋液PBS, 1%BSA, pH7.4。(10) 樣品稀釋液PVX: PBS, 0.5%PVA, 0.8% PVP;(11 )生物素化抗體稀釋液PBS-TBN(PBS, 0.1%BSA， 0.02% TWEEN-20， 0.05%NaN3, pH7.4)。(12) SA畫PE稀釋液PBS (pH7.4) , 1%BSA。 2.抗原與抗體本發明所使用抗原SARS-CoVN蛋白抗原例如是重組SARS-CoV全長核蛋 白-N32 (aal-422)和重組SARS-CoV核蛋白片段N13 (aa221-422)，均經鎳親 和柱純4匕。本發明所使用待測抗體為兔抗SARS IgG。檢測抗體為生物素化羊抗兔IgG 和生物素化羊抗人IgG，所述的羊抗兔IgG和羊抗兔IgG。 二、待測樣品的制備1、 目標分析物樣品的制備目標分析物為兔抗SARS IgG，干擾樣品或作為方法特異性測試的樣品是目 標檢測物外的其它抗體或其它蛋白質，包括兔抗結核血清、兔抗流感NPIgG 、 兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫FlIgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將上述 待分析樣品均溶于樣品稀釋液中，4。C保存。兔抗兔抗SARS N IgG的儲備液濃 度為.036mg/mL 。比較實驗中，相同樣品用于ELISA和懸浮芯片的檢測。將待分析的兔抗SARS IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣 品，以繪制樣品檢測劑量-反應的標準曲線，其中幾個樣品濃度低于檢測的敏感 度，高濃度樣品應使編碼微球的結合位點處于飽和狀態。2、 人血清樣本的處理分別將人血清樣本用樣品稀釋液1: 10稀釋，例如人血清樣本5pL加樣品 稀釋液50pL混勻后，作為待檢樣品進行懸浮芯片方法的檢測。實施例1、檢測SARS抗體的蛋白懸浮芯片的制備
1、 捕獲抗原包被編碼微球
本發明采用的044號編碼微球購自美國BIO-RAD公司，編碼微球用于標記 可以捕獲SARS抗體的SARS-CoV N蛋白抗原，即利用SARS-CoV N蛋白包被微球。
A、 編碼孩O求的活化
取lOOpL ( 1.25xl()6個)編碼孩t球到1.5mL離心管中，14000 x g離心，小 心吸出并棄去上清液。加入100nL的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100pL的微球活化緩沖液，接著先加入 10pL新鮮配置的EDC ( 50mg/mL)，再加入10pL新鮮配置的50mg/mL的 Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室溫震搖20分鐘。加入150jliL的 PBS (pH7.4),震蕩后，14000xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入lOOpL 的PBS (pH7.4)懸浮編碼微球。
B、 用抗原包被編碼微球
取捕獲抗原SARS-CoVN蛋白抗原4-50嗎加入到活化后的編碼微球中，用 PBS緩沖液定容至500pL,室溫震搖2小時。14000xg離心，小心吸出并棄去 上清液。用500|iL的PBS緩沖液洗一次，14000xg離心，小心吸出并棄去上 清液。加入250^iL的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000 xg 離心，小心吸出并棄去上清液。加入500jiL的微球保存液洗滌編碼微球，16000 xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150(iL的微球保存液懸浮編碼孩史球， 于4'C避光保存備用。
C、 包被微球的計數
吸取適量微球，稀釋后，用血球計數板(0.10mm; 1/400mm、在普通顯微鏡 下計數。根據公式(每個大格數xlO、稀釋倍數x體積(mL))計算微球數量。
2、 檢測抗體標記生物素
A、 生物素的標記
分別配制好濃度為10mM生物素溶液和2mg/mL的待標記抗體溶液，將計 算好體積的生物素加入到待標記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或水上2小 時)，過柱脫鹽后分裝，-20°。凍存備用。
B、 抗體用量計算
以標記2mg/mL的IgG (分子量150,000) lmL溶液為例，需加入10mM生物 素溶液約27 ^L。實施例2、懸浮芯片制備法條件的優化
1、 微球包被抗原包被量的選擇
分別以lpg、 3pg、 6pg、 9|ig、 12pg、 15pg、 20pg的量包被100pL編碼為 027號的微球。經檢測效果比較，以6嗎/1.25xl()6個微球即12-24ng/2500"5000
個微球/測試包被效果最好，顯微鏡下計數后避光冷藏保存待用。如圖l所示， 包被SARS-CoVN蛋白抗原的044號微球均落在其正確檢測區域內，并且獲得 高信噪比結果(MFI值遠大于2000),說明優化的懸浮芯片檢測系統可成功用 于SARS抗體的檢測。
2、 生物素化抗體的優化
本發明分別用氛基活性的生物素例如LC-酰肼(hydrazide)-生物素和羧基 活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標記^r測抗體，經 質控過程檢測效果比較，本實驗中SH-活性的生物素標記檢測抗體檢測效果較 好，檢測效果的方法采用本領域的常規方法或安裝制造商的產品說明書所述的 方法。
本發明人經過試驗驗證，發現2mg/mL生物素化的抗體羊抗兔以1: 250稀 釋作為檢測抗體進行檢測，檢測結果顯示生物素化檢測抗體Bio-羊抗兔抗體可 獲得高檢測值和低背景值的檢測效果;2mg/mL生物素化的抗體羊抗人以1:2500 稀釋作為檢測人血清中鼠疫抗體，檢測結果顯示生物素化檢測抗體Bio-羊抗人 抗體可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果。
實施例3、懸浮芯片樣品制備、檢測及結果判定
1、 待測樣品制備
用樣品稀釋液將待測樣本配置為不同濃度樣本進行蛋白懸浮芯片檢測。
2、 樣品的檢測及結果判定
檢測過程全部反應均在96孔濾板上進行，檢測過程如下
1) 每孔加入50nL含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽
濾；
2) 加入50pL檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽
濾；
3) 加入50 pL適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫 避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4) 加入50pL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌并真空泵 抽濾；
5) 加入125pL的檢測緩沖液，經蝸旋重懸混勻；
6) 用懸浮芯片系統讀取MFI數值并分析數據。 3、檢測結果判定
根據試驗研究結果與相關研究報道，本發明定義蛋白懸浮芯片方法檢測 SARS抗體的最低檢出限(LOD值)為檢測熒光強度臨界值(Cutoff)對應的檢 測物濃度。其中，Cutoff的定義是采用空白對照樣品(Blank)熒光檢測信號MFI 均值加3倍標準差(SD)，即Cutoff值為=]^^1(空白對照)+3倍標準差。若檢 測結果高于Cutoff對應熒光強度值則判定為SARS抗體檢測結果陽性；若檢測 結果低于Cutoff對應熒光強度值則判定為SARS抗體檢測結果陰性。 實施例4、懸浮芯片對SARS-CoVN蛋白抗原特異性檢測
應用懸浮芯片檢測方法分別對兔抗結核IgG 、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG 、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫FlIgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等 進行檢測，根據實施例3中檢測結果判定標準，僅兔抗SARSIgG為陽性，其余 干擾抗體或蛋白均為陰性。說明本發明所建立的SARS抗體的蛋白懸浮芯片檢 測方法與其它測試抗體均不發生交叉反應或非特異反應。
實施例5、懸浮芯片定量檢測模型的建立
1 、兔抗SARSIgG標準曲線樣品制備
用樣品稀釋液將兔抗SARS IgG標準品由0.036mg/mL以4倍倍比梯度稀釋 至0.55ng/mL成系列濃度樣品。
2 、劑量-反應標準曲線的繪制
按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據懸浮芯片系統 檢測結果繪制劑量-反應標準曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表抗.體的濃度 (ng/mL) ， Y軸代表懸浮芯片儀檢測的熒光值(MFI)。每個數據代表3次的 檢測結果平均值，坐標軸以對數-對數關系設定，圖2中兔抗SARS抗體的濃度 (ng/mL)分別為Sl: 0.549， S2: 2.197， S3: 8.789， S4: 35.156, S5: 140.625， S6: 562.5， S7: 2250.0， S8: 9000.0。
懸浮芯片系統根據檢測結果擬合兔抗SARS IgG劑量-反應標準曲線方程 FI = 0.774363 + (15544.5 - 0.774363) / [1 + (Cone / 2884.69)-7 77675f0999461 3、懸浮芯片檢測兔抗SARS IgG的靈敏度和動態范圍根據最低檢出限定義和劑量-反應標準曲線方程，本發明即蛋白懸浮芯片方
法檢測兔抗SARSIgG的靈敏度為105.57pg/mL (Cutoff =6.31066， MFI(空白 對照)=5.25， 標準差=0.35355)。
本發明定義最高檢出限為使編碼微球的結合位點處于飽和狀態的檢測物濃 度。根據標準曲線隨著兔抗SARSIgG濃度的升高，其對應的MFI值也隨之遞 增，當兔抗SARSIgG濃度達到0.025mg/mL時，抗原抗體的免疫反應即達到飽
和狀態，MFI值也進入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度高，需要將高濃度樣 品稀釋后再檢測。
因此，根據最低檢出限與最高檢出限可以判定本發明即懸浮芯片定量檢測 兔抗SARS IgG的動態范圍為4.883 ~ 25000ng/mL。
實施例6、蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法檢測兔抗SARS IgG的比較
1、 生物素-親和素ELISA (BAS-ELISA)檢測方法 作為對比，生物素-親和素ELISA采用包括下列步驟的
作為對這，采用包括下列步驟的間接法ELISA檢測
1) 向普通ELISA微孔板每孔加入50pL用PBS緩沖液稀釋的SARS-CoV N 蛋白5-50pg， 4。C靜止過夜；
2) 加入封閉液，在37。C封閉2小時；
3) 洗液洗3次，拍干；
4) 加入檢測樣品，每孔50pL，室溫it置40分鐘；洗液洗3次，拍干；
5) 加入適量生物素化檢測抗體，每孔50pL，室溫放置30分鐘；洗液洗3次， 拍干；
6) 加入適量SA/HRP (辣根酶標記鏈霉親和素)，50pL/孔，室溫放置3分 鐘；洗液洗3次，拍干；
7) 加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50^L/孔，室溫 放置10分鐘；
8) 用2MH2S04終止反應；
9) 應用酶標儀測讀A450nm數值。
2、 樣品的懸浮芯片檢測方法
采用間接法測抗體的免疫學檢測模式，檢測過程中全部反應均在96孔濾板 上進行。1 )每孔加入50pL含相應編碼微球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾2
次；
2) 加入50 (iL檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽 濾3次；
3) 加入50 jiL適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫 避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾3次；
4) 加入50pL的SA-PE,混勻后室溫避光震搖IO分鐘。用清洗液洗滌并真 空泵抽濾3次；
5) 加入125(iL的檢測緩沖液，經蝸旋重懸混勻；
6) 用Bio-Plex懸浮芯片系統讀取MFI數值并分片斤凄史據。 3、兩種檢測方法的靈敏度和動態范圍及相關性的比較
制備的相同一組兔抗SARS抗體樣品用樣品稀釋液4倍比稀釋同時應用懸 浮芯片和ELISA方法進行檢測。繪制ELISA方法檢測兔抗SARS抗體的標準曲 線(圖中橫坐標為樣品濃度，縱坐標為吸光度值，坐標軸取對數-對數關系)， 并與懸浮芯片方法結果進行比較。
才艮據兩種方法標準曲線懸浮芯片方法如圖2所示靈每文度為402.9pg/mL, 線性4企測范圍146.48-2400000pg/mL; ELISA方法如圖3所示靈敏度為600ng/mL, 線性檢測范圍0.6-38.4|xg/mL。可以得出結論檢測相同兔抗SARS抗體樣品， 蛋白懸浮芯片方法比ELISA方法具有更高的檢測靈敏度，即高1000倍；并且具 有更寬的動態檢測范圍，即高3個數量級。
另外，將兩種方法檢測結果在0.6-38.4[ig/mL范圍內進行比較如圖4所示， 可以判定蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法有良好的相關性，相關系數為0.9518。
實施例7、 Ajk清樣品的檢測
1、 人血清樣品的準備
將人血清樣品稀釋液1:10稀釋(人血清樣本5pL加樣品稀釋液50|iiL混勻) 后用于蛋白懸浮芯片檢測。
2、 人血清樣品的檢測
1) 每孔加入50pL含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽
濾；
2) 加入50 pL待檢測人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液 洗滌并抽濾；
133) 加入50 (iL適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人抗體，混勻 后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；
4) 加入50jiL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌并真空泵 抽濾；
5) 加入125pL的檢測緩沖液，經蝸旋重懸混勻；
6) 用懸浮芯片系統讀取MFI數值，根據標準曲線，確定待檢測人血清中 SARS抗體的濃度。
經過多次重復試驗，生物素化羊抗人IgG稀釋比例選用1: 2500稀釋，SA-PE 稀釋比例選用1: 300稀釋，經過對94份人血清的檢測，所得的MFI值的均值 與其標準差的3倍之和為作為判斷陰陽性的界值，即Cutoff值為3123.355，換 算為濃度值是366ng/mL,檢測得到的MFI值如果大于3123.355,即血清中的 SARS抗體濃度超過366ng/mL可視為SARS抗體陽性可能被SARS病毒感染， 如果MFI值小于3123.355,即血清中的SARS抗體濃度低于9.6ng/mL可判斷為 SARS抗體陰性，未感染SARS病毒。
權利要求
1、一種采用蛋白懸浮芯片檢測血清樣品中SARS抗體的間接免疫學定量檢測方法，其特征在于，檢測過程中全部反應可在96孔濾板或者微量離心管中進行，該方法包括下列步驟(1)包被微球的捕獲抗原為SARS-CoV N蛋白抗原；(2)向孔內加入含已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(3)加入待測血清樣品，孵育后清洗；(4)加入用生物素化的檢測抗體，孵育后清洗；(5)加入鏈親和素-藻紅蛋白，孵育后清洗；(6)加入檢測緩沖液后混勻；(7)用懸浮芯片系統讀取平均熒光強度(MFI)數值并分析數據判定檢測結果。
2、 權利要求1的方法，其特征在于所述SARS-CoV N蛋白抗原為重組 SARS-CoV全長核蛋白-N32 (aal-422)和重組SARS-CoV核蛋白片^殳 N13 (aa221-422),均經鎳親和柱純化。
3、 如權利要求1所述的方法，其特征在于，采用生物素標記的羊抗人IgG 作為檢測抗體，并且其與SARS-CoVN蛋白的組合組成間接法檢測體系。
4、 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕獲抗SARS N蛋白抗原用量為3-9pg /1.25xl(^個編碼微球或6 36ng/2500-5000個微球/測試。
5、 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法中的標記檢測抗體 羊抗人IgG的生物素為羧基活性的生物素。
6、 如權利要求l所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的檢測抗 體Bio-羊抗人IgG以1: 2500稀釋作為檢測抗體進行檢測。
7、 一種定量檢測血清樣品中SARS抗體的蛋白懸浮芯片方法，其特征在于，該方法包括下列步驟(1 )加入的陽性檢測樣品或標準品經梯度倍比稀釋，所述梯度倍比稀釋 為4倍；(2)將系列稀釋樣品在懸浮芯片系統中檢測讀取對應熒光值(MFI); (3 )制作樣品濃度對應MFI值的劑量-反應曲線；(4) 用分析軟件擬合劑量-反應曲線和方程；(5) 未知濃度樣品可根據劑量-反應曲線和方程判斷未知樣本中SARS 抗體的濃度。
8、 一種采用檢測血清樣品中SARS抗體的蛋白懸浮芯片，該芯片包括 編碼孩"求，作為包被微球抗原的SARS-CoVN蛋白抗原，生物素標記的 羊抗兔IgG和羊抗人IgG作為檢測抗體，鏈親和素-藻紅蛋白和適宜的緩 沖溶液。
全文摘要
本發明涉及一種檢測SARS抗體的蛋白懸浮芯片的SARS抗體的定量檢測方法和產品。本發明的方法檢測能力好、靈敏度高、特異性強、動態范圍寬，并建立了以SARS抗體為代表的病毒抗體蛋白質懸浮芯片檢測的開放性檢測模式化平臺。
文檔編號G01N21/64GK101533020SQ200910082600
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月28日 優先權日2009年4月28日
發明者孫肖紅, 張曉龍, 宇 楊, 靜 王, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院