專利名稱：：一種快速檢測卡介苗活菌含量的方法
技術領域：
：本發明涉及活菌疫苗質量監測
技術領域：
，是一種定量的快速檢測卡介苗活菌含量的方法。
背景技術：
：肺結核病是一種慢性傳染疾病，其傳染途徑主要是通過呼吸道傳染，目前已成為傳染病的首要殺手，近年來發病率有上升的趨勢，給我國的國民經濟生活、人民生命健康造成了極大的危害。因此，對結核病的預防和早期診治具有重要的現實意義。當前，對結核病的預防和控制所采取的主要措施是接種預防性疫苗——卡介苗。卡介苗是一種減毒的活性牛型結核桿菌疫苗，它注入人體后，能使人體內產生對結核桿菌的免疫力，防止感染和發生結核病，尤其在減少和控制兒童重癥結核和結核性腦膜炎的發病及死亡方面的作用更為顯著。現在世界上多數國家都已將卡介苗列為計劃免疫必須接種的疫苗之一。在卡介苗藥物的生產和保存過程中，需要對卡介苗質量進行監測，即活菌數是否達到合格標準(活菌數>1X106個/mg)，即將lmg卡介苗樣品配制為lmL溶液，則合格標準為活菌數>1X106個/mL。常規的檢測方法是取一定量的試樣在試管中進行活菌斜面培養計數，但培養時間通常需要1個月，導致疫苗在庫內存放期延長，縮短了疫苗的有效期，且這種方法操作復雜，檢測效率較低，國家檢定部門及防疫系統在監測疫苗質量時亦不能及時獲得結果，影響了質量管理。因此，急需要建立一種快速、簡便、準確的卡介苗活性檢測方法。
發明內容本發明的目的是針對現有技術的不足，公開一種快速檢測卡介苗活菌含量的方法，無需培養，檢測快速，解決了傳統培養法耗時長，效率低等問題，為活菌疫苗質量監控提供了關鍵技術。為達到上述目的，本發明的技術解決方案是—種快速檢測卡介苗活菌含量的方法，包括四個步驟A)制作標準ATP曲線檢測ATP標準溶液的發光強度，作出ATP標準溶液濃度與其發光強度的標準曲線，獲得線性回歸方程；B)樣品前處理，提取活菌ATP:將凍干卡介苗用緩沖液稀釋為合適濃度的樣品溶液，對樣品溶液進行裂解處理，提取卡介苗活菌中的ATP;C)卡介苗樣品生物發光測定將處理過的卡介苗樣品溶液進行發光檢測，獲得樣品溶液的發光強度；D)卡介苗ATP濃度及活菌數計算由于各生長時期的活菌中ATP含量大致相同，研究證明平均每個卡介苗活菌中的ATP含量為2.032.63fg。根據標準曲線回歸方程推算出卡介苗的ATP含量，即可推算出活菌數量。所述的快速檢測卡介苗活菌含量的方法，其所述B)步中對卡介苗樣品中ATP的提取，是通過加熱方法來裂解卡介苗活菌，實現對活菌內ATP的提取。所述的快速檢測卡介苗活菌含量的方法，其所述B)步中對卡介苗樣品中ATP的提取，是將預熱到80°C100°C的ATP提取劑與樣品溶液混合后，再在80°C100°C內繼續加熱220min。所述的快速檢測卡介苗活菌含量的方法，其所述ATP提取劑，含有15150mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)(pH7.8)，0.18mM乙二胺四乙酸(EDTA);0.130mg/mL十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)，曲拉通(TritonX-100)，二甲基亞砜(DMSO)中至少一種。本發明提供的快速檢測卡介苗活菌含量的方法，無需對活菌進行培養，具有快速，操作簡便，重復性好等優點。本發明方法不局限于卡介苗活性的檢測，也適用于其他活菌疫苗質量的監控和真菌等其他微生物標準品的計數。圖1是本發明方法的卡介苗活菌數的檢測流程圖。具體實施例方式本發明的一種快速檢測卡介苗活菌含量的方法，所使用的生物發光試劑的制備方法，請參照申請號為:200610112410.0的已申請專利。本發明的一種快速檢測卡介苗活菌含量的方法，是通過對卡介苗樣品進行前處理，檢測卡介苗活菌中ATP含量，從而推算其活菌數目。本發明的一種快速檢測卡介苗活菌含量的方法，所用的ATP提取劑，是由15150mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)(pH7.8)，0.18mM乙二胺四乙酸(EDTA);0.130mg/mL十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)，曲拉通(TritonX-100)，二甲基亞砜(DMSO)中至少一種組成。其制備過程是取O.130mg的DTAB或TritonX-100或DMSO中至少一禾中，0.18iimol的EDTA溶于15150mM的Tris緩沖液(pH7.8)中，使溶液終體積為lmL。所用試劑均為分析純。M為一種濃度單位，即摩爾/升。本發明的一種快速檢測卡介苗活菌含量的方法，以皮內注射卡介苗為具體實施例對本發明方法進一步描述。本發明的具體實施例皮內注射卡介苗中活菌含量的檢測。具體操作過程如下(見圖1)l)制作標準ATP曲線配制濃度為0.0625nM20nM的ATP標準溶液；取30yL的ATP標準溶液與180yL的生物發光試劑(請參照申請號為200610112410.0的已申請專利)進行反應，記錄相對發光強度(RLU)，根據ATP濃度與發光強度的響應關系，得到線性回歸方程。2)樣品前處理，提取活菌ATP4優選了一套ATP提取劑，其組成及濃度如下DMSO5mg/mLTris25mMEDTA0.5mM按上述濃度配制ATP提取劑，然后按照下述過程對卡介苗樣品進行裂解處理將皮內注射卡介苗按照相關質控標準配制為合適濃度的樣品溶液；將500L的上述ATP提取劑在水浴鍋中預熱到IO(TC，再加入lOOiiL樣品溶液與其混合，在IO(TC下加熱5分鐘(min)后，恢復至室溫。3)卡介苗樣品生物發光測定取30L裂解后的樣品溶液與180yL的生物發光試劑進行反應，記錄相對發光強度。4)計算卡介苗ATP含量及活菌數量根據標準曲線回歸方程，推算卡介苗中的ATP含量及活菌數量。表1皮內注射卡介苗樣品中ATP含量及活菌數量<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>權利要求一種快速檢測卡介苗活菌含量的方法，其特征在于，包括步驟A)首先進行ATP標準溶液的發光檢測，獲得標準曲線及線性回歸方程；B)再將凍干卡介苗配制為合適濃度的樣品溶液，對樣品溶液進行ATP提取，得到樣品ATP提取液；C)然后加入生物發光試劑進行發光檢測；D)最后根據標準曲線回歸方程和樣品發光強度推算出卡介苗樣品中的ATP含量及活菌數。2.如權利要求1所述的快速檢測卡介苗活菌含量的方法，其特征在于，所述B)步中對卡介苗樣品中ATP的提取，是通過加熱方法來裂解卡介苗活菌，實現對活菌內ATP的提取。3.如權利要求1或2所述的快速檢測卡介苗活菌含量的方法，其特征在于，所述B)步中對卡介苗樣品中ATP的提取，是將預熱到80°C100°C的ATP提取劑與樣品溶液混合后，再在80°CIO(TC內繼續加熱220min。4.如權利要求3所述的快速檢測卡介苗活菌含量的方法，其特征在于，所述ATP提取劑，含有15150mM三羥甲基氨基甲烷，pH7.8，0.18mM乙二胺四乙酸；0.130mg/mL十二烷基三甲基溴化銨，曲拉通，二甲基亞砜中至少一種。全文摘要本發明公開了一種快速檢測卡介苗活菌含量的方法，涉及活菌疫苗質量監測技術，首先檢測三磷酸腺苷(ATP)標準溶液的發光強度獲得ATP濃度與其發光強度的響應關系，作出線性回歸方程；再將凍干卡介苗用緩沖液稀釋為合適濃度的樣品溶液，對樣品溶液進行ATP提取，得到樣品ATP提取液；然后加入生物發光試劑進行發光檢測；最后根據標準曲線回歸方程和樣品發光強度推算出卡介苗樣品中的ATP及活菌含量。本發明方法檢測快速，無需培養，操作簡單，適用于活菌疫苗質量監測領域，和真菌等其他微生物標準品的計數。文檔編號G01N21/76GK101793832SQ200910077949公開日2010年8月4日申請日期2009年2月4日優先權日2009年2月4日發明者劉春秀,劉曉紅,田青,羅金平,蔡新霞申請人:中國科學院電子學研究所