專利名稱：用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法及測試筆的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、免疫學和蛋白檢測技術領域。更具體地，涉及一種用抗原 刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法；此外，本發明還涉及一種檢測病原微生物 的膠體金免疫層析測試筆。
背景技術：
由病原微生物感染引起的疾病很多，如肺結核、艾滋病(AIDS)、禽流感、嚴重急性 呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、肝炎、瘧疾、炭疽病、肺炎、肝 炎、瘋牛病等，這些疾病由于能嚴重危害個人健康且具有很強的傳染性，給人類的健康帶來 了很大的威脅。另外，由于很多時候這些病原微生物在體內能潛伏很長時間而不發病或發 病較輕，給疾病的準確及時診斷帶來了極大障礙，往往在病人病得很重、癥狀很明顯時才能 確診，既延誤了治療時機，也容易傳染他人。因此，盡早檢測出動物或人體內是否有這些病 原微生物十分重要。
目前常用的方法多是檢測體液中病原微生物的抗體、抗原、DNA或RNA，但是由于 初期病原微生物含量很少而不易檢測出來，而取樣品在培養擴增微生物又要花很長時間且 過程復雜，不僅容易引入人為的錯誤而且往往貽誤了最佳的治療時間，因此有必要開發一 種快速、簡單、有效的檢測方法來檢測這類病原微生物引起的疾病。
眾所周知，動物體內免疫系統的主要功能是清除動物體內的感染原，如病原微生 物。在清除感染原的過程中，依賴于B淋巴細胞的體液免疫和依賴于T淋巴細胞的細胞免 疫都必不可少。細胞內的病毒或細菌相對遠離了體液免疫，但源自這些微生物的經處理和 呈遞的蛋白能促進T淋巴細胞的激活。相應的，對細胞內病原微生物(結核桿菌、HIV、流感 病毒)的獲得抗性依賴于T淋巴細胞和伽瑪干擾素(interferon γ，IFN- y )，IFN- γ和其 他細胞因子的協同作用對于獲得對細胞內病原微生物感染的抗性十分關鍵。因此，激活后 T淋巴細胞的IFN-Y釋放是針對胞內病原微生物抗原的細胞免疫反應的重要標志，可用于 檢測細胞免疫反應進而表明細胞內病原微生物的存在。
對于已經接觸過病原微生物的免疫細胞，如T淋巴細胞，當再次受病原微生物的 抗原刺激時，因細胞免疫反應會釋放大量細胞因子，如IFN- Y、白介素(interleukin，IL)， 轉化生長因子(transforming growthfactor β , TGF-β )等，因此可以通過檢測刺激后血液 中的細胞因子來反映動物體內是否有該病原微生物。
溶液中細胞因子的檢測方法很多，都要用到細胞因子特異的抗體，具體方法可以 是ELISA、化學發光、免疫熒光或抗體免疫層析等。發明內容
本發明要解決的技術問題在于提供了一種用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病 原微生物的方法，該方法能夠快速有效地檢測出潛伏期或發病早期的病原微生物。為此，本發明還提供了一種檢測病原微生物的膠體金免疫層析測試筆。
利用細胞免疫反應的原理，本發明提供了一種新的檢測病原微生物的方法和測試 筆。主要過程就是用病原微生物特異的抗原或抗原的功能片段與血液或血細胞保溫至少6 小時，然后用膠體金標記免疫層析法檢測血液樣品的IFN-γ、IL或TGF-β等細胞因子，從 而判斷動物是否感染了病原微生物，如結核桿菌、HIV、禽流感病毒、SARS冠狀病毒、肝炎病 毒、埃博拉病毒、朊蛋白等。
在本發明的一方面，提供一種用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方 法，該方法采用病原微生物特異的一個或多個抗原或抗原的功能片段與動物或人的全血或 血細胞混合并在37°C保溫至少6小時，再用特異的抗體來檢測血細胞釋放的細胞因子，檢 測到較無抗原刺激時更高濃度的細胞因子表明有病原微生物。
本發明中“病原微生物”也叫傳染病原，指可通過呼吸道、消化道、皮膚、血液傳播、 傳染的能夠引起動物疾病的微生物，包括原核生物、細菌、病毒、真菌、朊蛋白等。更具體的， 前述原核生物包括瘧原蟲，細菌包括導致肺結核的結核桿菌、引起炭疽病的炭疽桿菌、引起 肺炎的鏈球菌或假單胞菌、引起梅毒的蒼白螺旋體等，病毒包括HIV、各種流感病毒、SARS 冠狀病毒、肝炎病毒、埃博拉病毒等，真菌包括酵母等。朊蛋白則能引起瘋牛病、羊瘙癢癥。
本發明中“抗原”指病原微生物特異的抗原，主要是病原微生物表面特異的蛋白、 糖或脂，特異的抗原是一種病原微生物專有的，可以通過這些抗原特異的抗體鑒別一種病 原微生物而把它與不同的病原微生物區分開來。不同病原微生物特異的抗原也能被動物的 免疫系統區分開來并且被記住，以后當這些抗原再次進入動物體內時就會引發免疫系統的 免疫反應。
本發明中“抗原的功能片段”指含有病原微生物抗原的全部或部分抗原決定簇的 抗原組分或片段。在病原微生物進入動物體內被動物的免疫系統識別并記住后，當其抗原 的功能片段進入動物體內時也會引發動物免疫系統的免疫反應。
優選地，所述病原微生物為結核桿菌，所述抗原為結核桿菌特異的抗原ESAT6、 CFPlO 或 P4。
優選地，所述病原微生物為HIV，所述抗原為HIV特異的抗原GP120、GP41、GP36或 P24。
優選地，所述病原微生物為禽流感病毒，所述抗原為禽流感病毒特異的抗原血凝 素(hemagglutinin，·)、神經氨酸酶(neuraminidase，NA)或質子通道 M2。
優選地，所述病原微生物為SARS冠狀病毒，所述抗原為SARS冠狀病毒 特異的抗原刺突糖蛋白(spike glycoprotein)、紅細胞凝集素乙酰酯酶糖蛋白 (hemagglutinin-acetylesterase glycoprotein)或 M 蛋白。
所述血細胞釋放的細胞因子為伽瑪干擾素IFN-γ、白介素IL或轉化生長因子 TGF- β。
優選地，所述特異的抗體是IFN-Y的單克隆抗體。
所述檢測的方法可采用ELISA(酶聯免疫吸附劑測定法)、化學發光、免疫熒光或 膠體金標記的抗體免疫層析法。
優選地，所述用特異的抗體來檢測血細胞釋放的細胞因子采用膠體金標記的 IFN-Y單克隆抗體免疫層析測試筆。
在本發明的另一方面，提供一種檢測病原微生物的測試筆，包括濾血紙、膠體金 墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙和PVC底板；所述膠體金墊上面包被有小鼠抗人INF-γ的單克 隆抗體——膠體金的復合物，所述硝酸纖維素膜上有測試線和控制線，該測試線上包被有 IFN-γ，該控制線上包被有羊抗小鼠IgG多克隆抗體。
圖1所示檢測IFN- γ的測試筆包括塑料件帽子1，吸水棒2，濾血紙3，膠體金墊 4，測試線(T線)5，硝酸纖維素膜(NC膜)6，控制線(C線)7，吸水濾紙8，塑料件下蓋9，干 燥劑10，塑料件上蓋11，觀察窗口 12，PVC底板13。而圖2所示檢測IFN-γ的測試條包括 濾血紙3、膠體金墊4、T線5、NC膜6、C線7、吸水濾紙8、PVC底板13。其中膠體金墊4上 面包被有小鼠抗人INF- γ的單克隆抗體——膠體金的復合物，NC膜6上包被有T線5 (含 IFN- Y )和C線7 (含羊抗小鼠IgG多克隆抗體)。該測試筆的測試原理為樣品滴加到吸 水棒后，樣品中的IFN-Y隨溶液移動到膠體金墊上并與其中的金標IFN-Y單克隆抗體結 合形成抗原抗體復合物，若樣品中的IFN-Y不夠多從而使金標IFN-γ單克隆抗體還能再 結合抗原IFN-Y，那么這些單克隆抗體隨溶液移動到T線時可與T線處的IFN-Y結合而 使T線呈紅色；反之，若樣品中的IFN-Y過量而使金標IFN-Y單克隆抗體不能再結合抗原 IFN- γ，這些單克隆抗體隨溶液移動到T線時則不能與T線處的IFN- γ結合，T線將無顏色 出現。未與T線結合的金標IFN-γ單克隆抗體繼續隨溶液移動到C線，和C線處的羊抗小 鼠多克隆抗體結合而使C線呈紅色，提示小鼠抗人IFN- γ單克隆抗體能被羊抗小鼠多克隆 抗體識別。綜上所述，當C線呈紅色時，T線若也呈紅色說明樣品溶液中的IFN- γ濃度較 低，受檢病人體內無病原微生物；C線呈紅色而T線無顏色出現則說明樣品溶液中的IFN-γ 濃度較高，受檢病人體內含病原微生物。
該方法利用接觸過病原微生物的動物或人的血細胞據有記憶功能，再次接觸該病 原微生物的蛋白組分時能被刺激而釋放出細胞因子，如IFN-γ、IL, TGF-β等，從而通過檢 測這些細胞因子就能判斷該動物體內是否有該病原微生物。該方法可以通過選擇特異的蛋 白組分(抗原或其功能片段)而提高特異性。因為不需要檢測病原微生物的抗原或體內產 生的抗體，只需檢測血細胞反應，所以可以在病原微生物的潛伏期或發病的早期就檢測出 體內病原微生物的存在，縮短診斷時間，便于病人及時治療，早日康復。
本發明通過檢測細胞免疫反應的方法來檢測結核桿菌、HIV、禽流感病毒、SARS冠 狀病毒等傳染性較強的病原微生物，可以在微生物潛伏期或發病早期檢測出微生物，不像 現有的主要直接檢測抗原或抗體的血清學方法需等到有大量的病原微生物或較強的體液 免疫反應后才能檢測，因此可盡早地檢測出病原微生物，為病人的早日治療贏得了時間。而 且檢測時間很短只需20小時左右，方法也很簡單，大大減少了人力物力，節省了成本。另外 本發明通過利用各種病原微生物特異的抗原或其功能片段，也顯著提高了檢測方法的特異 性和靈敏度。
圖1是本發明中膠體金標記的IFN- γ單克隆抗體免疫層析法檢測IFN- γ的測試 筆的結構示意圖2是本發明中膠體金標記的IFN- γ單克隆抗體免疫層析法檢測IFN- γ的測試 條的結構示意圖。
在圖1和圖2中，附圖標記1-13說明1-塑料件帽子；2_吸水棒；3_濾血紙；4-膠 體金墊；5-測試線(T線)；6-硝酸纖維素膜(NC膜)；7-控制線(C線)；8-吸水濾紙；9-塑 料件下蓋；10-干燥劑；11-塑料件上蓋；12-觀察窗口 ； 13-PVC底板。
具體實施方式
以下通過實施例和對比試驗對本發明作進一步的闡述
實施例1，檢測IFN-Y的膠體金免疫層析測試筆的制備
圖1所示測試筆的制備方法如下
1.膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法(HAuC14、檸檬酸三鈉購自Sigma公司) 制備膠體金，膠體金顆粒大小在40nm左右。
2.抗IFN-γ抗體膠體金墊的制備
以Img抗體/1500D膠體金的比例在pH8. 4的條件下，用膠體金標記抗IFN- γ單 克隆抗體(Abeam公司)，30分鐘后，在pH7. 4的條件下加入適量BSA，離心濃縮后即得到 IFN-Y抗體金探針。
該金探針以膠體金膜稀釋液(0. IM TAPS緩沖液，20%蔗糖，3. 75% BSA，pH8. 0)稀 釋至0D2.0后備用。
將玻璃纖維(Millipore公司)在0D2. 0的IFN- γ膠體金膜溶液中充分浸泡后， 取出并擠去多余液體，平鋪于專用網架上；于相對濕度< 20%的環境中室溫干燥過夜得 IFN-Y抗體膠體金墊，備用。
3. IFN- γ硝酸纖維素膜(NC膜)的制備
以 ρΗ7· 4 的 IOmM PBS 溶液將 IFN- y (Abeam)稀釋至 0. 12mg/ml,0. 22 μ m 過濾。
以pH7. 4的IOmM PBS溶液將羊抗小鼠IgG多克隆抗體(廈門波生生物技術有限 公司)稀釋至2. 0mg/ml，0. 22 μ m過濾。
用IFN- γ溶液在NC膜(Millipore公司)T線(測試線)噴點的同時用羊抗小鼠 IgG多克隆抗體溶液在NC膜C線(控制線)噴點以在膜上形成測試線和控制線，并將噴點 完成的硝酸纖維素膜于相對濕度< 20%的環境中室溫干燥過夜，備用。
4.粘膜大卡的制備
粘膜時車間工作環境相對濕度要求低于30%。
如圖1和圖2所示，取60mmX300mm膠板(底襯)一塊，在中心位置上粘貼包被 后的NC膜6，NC膜的T線5位置朝下；在NC膜T線5的一側下部粘貼一條膠體金墊4并 部分覆蓋NC膜6的下緣，保證兩者有1 2mm的重疊；在膠體金墊4下側粘貼一條濾血紙 3 (Ahlstrom Filtration公司)并部分覆蓋膠體金墊4下緣；在PVC底板13 (miIlipore公 司)未貼濾血紙3的一端粘貼吸水濾紙8 (Ahlstrom Filtration公司)一條，并保證部分 覆蓋NC膜6上緣；將粘貼后的大卡裝入塑料袋，在相對濕度低于20%的低濕儲存間保存。
5.測試芯片的切割、裝配及包裝
切割、裝配時的車間工作環境相對濕度要求低于30%。
如圖1所示，將大卡用Matrix2501切割機切割成6mm寬度的生物測試芯片試紙 條，將6mm試紙條、吸水棒2 (Filtrona Fibertec公司)和干燥劑10 (Sud-Chemie公司)按 測試筆裝配步驟按序裝入塑料件(包括塑料件帽子1、塑料件下蓋9和塑料件上蓋11)裝配成測試筆，將測試筆用鋁箔包裝密封。
實施例2，通過檢測人血液中的IFN- γ來檢測結核桿菌
第一步，收集血液樣品。抽取病人Iml血液，加入含肝素(香港先進技術工業有 限公司)的無菌試管中作陰性對照管；然后抽取病人Iml血液，加入含肝素、結核桿菌抗原 (ESAT6和CFP10，香港先進技術工業有限公司)的無菌試管中作測量管；再抽取病人Iml血 液，加入含肝素、細胞分裂原(如植物凝集素，phytohemagglutinin，香港先進技術工業有 限公司)作陽性對照管。將3管血液分別充分震蕩。12小時內開始檢測試驗。第二步，樣 品保溫。收集血液樣品后，在12小時內將3個試管于37°C保溫6- 小時。第三步，樣品 檢測。取100 μ 1樣品滴加到圖1所示檢測IFN- γ的膠體金免疫層析測試筆(盒中含圖2 示檢測IFN-γ的膠體金免疫層析測試條)的吸水棒2，10分鐘后如果控制線7位置出現紅 線，測試線5位置也出現紅線，表明樣品中IFN-Y濃度較低；反之若控制線7位置出現紅 線，測試線5位置不出現紅線，表明樣品中IFN-Y濃度較高。第四步，結果判讀。對于該檢 測人體內結核桿菌的方法，當陰性對照中IFN-Y濃度較低(測試線位置出現紅線)且陽性 對照中IFN-Y濃度較高(測試線位置不出現紅線)時，若測量管中IFN-Y濃度較低(測 試線位置出現紅線)，提示病人體內沒有結核桿菌；反之，若測量管中IFN-Y濃度較高(測 試線位置不出現紅線)，提示病人體內有結核桿菌。如果陰性對照中IFN-Y濃度較高(測 試線位置不出現紅線)或者陽性對照中IFN-Y濃度較低(測試線位置出現紅線)，提示血 液樣品本身IFN-Y基線太高或者血液中血細胞出現問題而對細胞分裂原沒反應，發生這 兩種情況時表明檢測失敗，要重新檢測。
用10例病人的血樣檢測后結果顯示7例含結核桿菌，3例不含結核桿菌，與臨床診斷結果一致。
#( 中的 IFN—Y iiinTffi ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) lljfi。 IlJ 量方法為將酶標板的孔用IFN-Y的單克隆抗體(abeam公司)包被，再加入樣品溶液，室溫 保溫2小時后洗板，再加入辣根過氧化物酶HRP偶聯的IFN- γ的單克隆抗體(abeam)，室 溫保溫2小時后洗板，加入HRP的底物(abeam)反應后將酶標板置于Bio-Rad酶標儀中于 450nm讀數，根據IFN- γ的標準曲線分析IFN- γ的濃度。
本領域的技術人員知道還可以采取化學發光、免疫熒光等方法來用抗體檢測 IFN-Y等細胞因子。
該方法不僅能夠檢測出結核病人體內的結核桿菌，還能夠檢測出未發病的人體內 潛伏的結核桿菌。該方法克服了現有的噬菌體快速擴增法不夠快，血清學診斷方法中靈敏 度和特異性不高的缺陷，將診斷過程縮減到20個小時左右，并且提高了靈敏度和特異性， 以滿足快速確診肺結核的需要，便于對患者及時用藥治療。
實施例3，通過檢測人血液中的IFN- γ來檢測HIV
第一步，收集血液樣品。抽取病人Iml血液，加入含肝素(香港先進技術工業有限 公司)的無菌試管中作陰性對照管；然后抽取病人Iml血液，加入含肝素、HIV抗原(GP120、 GP41、GP36和Ρ24，香港先進技術工業有限公司)的無菌試管中作測量管；再抽取病人Iml 血液，加入含肝素、細胞分裂原(如植物凝集素，phytohemagglutinin，香港先進技術工業 有限公司)作陽性對照管。將3管血液分別充分震蕩。12小時內開始檢測試驗。第二步， 樣品保溫。收集血液樣品后，在12小時內將3個試管于37°C保溫6-M小時。第三步，樣品檢測。取100 μ 1樣品滴加到圖1所示檢測IFN- γ的測試筆(盒中含圖2示檢測IFN- γ的 膠體金免疫層析測試條)的吸水棒2，10分鐘后如果控制線7位置出現紅線，測試線5位置 也出現紅線，表明樣品中IFN-Y濃度較低；反之若控制線7位置出現紅線，測試線5位置不 出現紅線，表明樣品中IFN-Y濃度較高。第四步，結果判讀。對于該檢測人體內HIV的方 法，當陰性對照中IFN-γ濃度較低(測試線位置出現紅線)且陽性對照中IFN-γ濃度較高 (測試線位置不出現紅線)時，若測量管中IFN-Y濃度較低(測試線位置出現紅線)，提示 病人體內沒有HIV;反之，若測量管中IFN-Y濃度較高(測試線位置不出現紅線)，提示病 人體內有HIV。如果陰性對照中IFN-Y濃度較高(測試線位置不出現紅線)或者陽性對照 中IFN-Y濃度較低(測試線位置出現紅線)，提示血液樣品本身IFN-Y基線太高或者血液 中血細胞出現問題而對細胞分裂原沒反應，發生這兩種情況時表明檢測失敗，要重新檢測。
用10例病人的血樣檢測后結果顯示4例含HIV，6例不含HIV，與臨床診斷結果一 致。
實施例4通過檢測人血液中的IFN- γ來檢測禽流感病毒
第一步，收集血液樣品。抽取病人Iml血液，加入含肝素(香港先進技術工業有限 公司)的無菌試管中作陰性對照管；然后抽取病人Iml血液，加入含肝素、禽流感病毒抗原 (血凝素HA和神經氨酸酶ΝΑ，香港先進技術工業有限公司)的無菌試管中作測量管；再抽 取病人Iml血液，加入含肝素、細胞分裂原(如植物凝集素，phytohemagglutinin，香港先進 技術工業有限公司)作陽性對照管。將3管血液分別充分震蕩。12小時內開始檢測試驗。 第二步，樣品保溫。收集血液樣品后，在12小時內將3個試管于37°C保溫6-M小時。第三 步，樣品檢測。取100 μ 1樣品滴加到圖1所示檢測IFN-Y的測試筆(盒中含圖2示檢測 IFN-Y的膠體金免疫層析測試條)的吸水棒2，10分鐘后如果控制線7位置出現紅線，測 試線5位置也出現紅線，表明樣品中IFN-Y濃度較低；反之若控制線7位置出現紅線，測試 線5位置不出現紅線，表明樣品中IFN-Y濃度較高。第四步，結果判讀。對于該檢測人體 內禽流感病毒的方法，當陰性對照中IFN-Y濃度較低(測試線位置出現紅線)且陽性對照 中IFN-Y濃度較高(測試線位置不出現紅線)時，若測量管中IFN-Y濃度較低(測試線 位置出現紅線)，提示病人體內沒有禽流感病毒；反之，若測量管中IFN-Y濃度較高(測試 線位置不出現紅線)，提示病人體內有禽流感病毒。如果陰性對照中IFN-Y濃度較高(測 試線位置不出現紅線)或者陽性對照中IFN-Y濃度較低(測試線位置出現紅線)，提示血 液樣品本身IFN-Y基線太高或者血液中血細胞出現問題而對細胞分裂原沒反應，發生這 兩種情況時表明檢測失敗，要重新檢測。
用10例病人的血樣檢測后結果顯示3例含禽流感病毒，7例不含禽流感病毒，與臨 床診斷結果一致。
實施例5通過檢測人血液中的IFN- γ來檢測SARS冠狀病毒
第一步，收集血液樣品。抽取病人Iml血液，加入含肝素(香港先進技術工業有 限公司)的無菌試管中作陰性對照管；然后抽取病人Iml血液，加入含肝素、SARS冠狀病 毒抗原(刺突糖蛋白和紅細胞凝集素乙酰酯酶糖蛋白，香港先進技術工業有限公司)的 無菌試管中作測量管；再抽取病人Iml血液，加入含肝素、細胞分裂原(如植物凝集素， phytohemagglutinin,香港先進技術工業有限公司)作陽性對照管。將3管血液分別充分震 蕩。12小時內開始檢測試驗。第二步，樣品保溫。收集血液樣品后，在12小時內將3個試管于37°C保溫6-M小時。第三步，樣品檢測。取100 μ 1樣品滴加到圖1所示檢測IFN- γ 的測試筆(盒中含圖2示檢測IFN- γ的膠體金免疫層析測試條)的吸水棒2，10分鐘后如 果控制線7位置出現紅線，測試線5位置也出現紅線，表明樣品中IFN-Y濃度較低；反之若 控制線7位置出現紅線，測試線5位置不出現紅線，表明樣品中IFN-Y濃度較高。第四步， 結果判讀。對于該檢測人體內SARS冠狀病毒的方法，當陰性對照中IFN-Y濃度較低(測 試線位置出現紅線)且陽性對照中IFN-Y濃度較高(測試線位置不出現紅線)時，若測量 管中IFN-Y濃度較低(測試線位置出現紅線)，提示病人體內沒有SARS冠狀病毒；反之， 若測量管中IFN-Y濃度較高(測試線位置不出現紅線)，提示病人體內有SARS冠狀病毒。 如果陰性對照中IFN-Y濃度較高(測試線位置不出現紅線)或者陽性對照中IFN-Y濃度 較低(測試線位置出現紅線)，提示血液樣品本身IFN-Y基線太高或者血液中血細胞出現 問題而對細胞分裂原沒反應，發生這兩種情況時表明檢測失敗，要重新檢測。
用10例病人的血樣檢測后結果顯示2例含SARS冠狀病毒，8例不含SARS冠狀病 毒，與臨床診斷結果一致。
權利要求
1.一種用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法，其特征在于，該方法采 用病原微生物特異的一個或多個抗原或抗原的功能片段與動物或人的全血或血細胞混合 并在37°c保溫至少6小時，再用特異的抗體來檢測血細胞釋放的細胞因子，檢測到較無抗 原刺激時更高濃度的細胞因子表明有病原微生物。
2.如權利要求1所述的用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法，其特征 在于，所述病原微生物為結核桿菌，所述抗原為結核桿菌特異的抗原ESAT6、CFPlO或P4。
3.如權利要求1所述的用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法，其特征 在于，所述病原微生物為HIV，所述抗原為HIV特異的抗原GP120、GP41、GP36或P24。
4.如權利要求1所述的用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法，其特征 在于，所述病原微生物為禽流感病毒，所述抗原為禽流感病毒特異的抗原血凝素HA、神經氨 酸酶NA或質子通道M2。
5.如權利要求1所述的用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法，其特征 在于，所述病原微生物為SARS冠狀病毒，所述抗原為SARS冠狀病毒特異的抗原刺突糖蛋 白、紅細胞凝集素乙酰酯酶糖蛋白或M蛋白。
6.如權利要求1所述的用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法，其 特征在于，所述血細胞釋放的細胞因子為伽瑪干擾素IFN- Y、白介素IL或轉化生長因子 TGF- β。
7.如權利要求1-5任一項所述的用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方 法，其特征在于，所述特異的抗體是IFN-Y的單克隆抗體。
8.如權利要求1所述的用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法，其特征 在于，所述檢測的方法采用ELISA、化學發光、免疫熒光或抗體免疫層析法。
9.如權利要求1所述的用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法，其特征 在于，所述用特異的抗體來檢測血細胞釋放的細胞因子采用膠體金標記的IFN-Y單克隆 抗體免疫層析測試筆。
10.一種檢測病原微生物的膠體金免疫層析測試筆，其特征在于，包括濾血紙、膠體金 墊、硝酸纖維素膜、吸水濾紙和PVC底板；所述膠體金墊上面包被有小鼠抗人INF-γ的單克 隆抗體——膠體金的復合物，所述硝酸纖維素膜上面含有測試線和控制線，該測試線上包 被有IFN-γ，該控制線上包被有羊抗小鼠1gG多克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種用抗原刺激的細胞免疫反應來檢測病原微生物的方法。本發明利用病原微生物的特異抗原或其功能片段刺激血液中已接觸過該微生物的免疫細胞，使免疫細胞產生細胞因子，如伽瑪干擾素(interferonγ，IFN-γ)，然后通過檢測IFN-γ的量來判斷動物體內是否有該病原微生物。本發明用膠體金標記免疫層析法來檢測血液中的IFN-γ。此外，本發明還公開了一種檢測病原微生物的膠體金免疫層析測試筆。本發明能夠快速有效地檢測出潛伏期或發病早期的病原微生物。
文檔編號G01N21/76GK102033129SQ20091005798
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月29日 優先權日2009年9月29日
發明者楊吉, 楊揮 申請人:上海英伯肯醫學生物技術有限公司