專利名稱：Cd4細胞芯片及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞芯片，尤其涉及一種CD4細胞芯片及其制備方法和應用。
背景技術：
CD4細胞是指帶有CD4抗原的T淋巴細胞，又被稱為輔助T細胞，在維持機體的細 胞免疫和體液免疫中具有樞紐作用。CD4細胞是免疫系統中的主要戰斗細胞，也是人類免疫 缺陷病毒(HIV)感染的主要靶細胞。人體感染HIV后的主要病理過程是免疫系統的損害， 主要表現為CD4細胞的丟失和絕對數量的減少。目前，CD4細胞計數已經廣泛應用于指導 臨床抗HIV治療，并已成為世界衛生組織對艾滋病發病定義的金標準。世界衛生組織定義 當人體外周血中CD4細胞數量< 200個/微升則判定為艾滋病患者。準確可靠的CD4細胞 計數已成為評價HIV感染者免疫狀況、預測病程進展、評價抗病毒藥物治療效果和估測預 后的重要指標。此外，有研究表明，CD4細胞在惡性腫瘤、乙型肝炎、慢性阻塞性肺疾病、肺 結核、腦梗死等其他疾病的病程監測、療效評估、預后評價等方面也發揮重要作用。CD4細 胞的數量已是衡量個體免疫狀態及功能的重要指標。當人體外周血中CD4細胞數量< 350 個/微升，為免疫力低下，需詳細診斷是否為艾滋病患者；當人體外周血中CD4細胞數量在 350 450個/微升，為免疫力弱化，是亞健康狀態；當人體外周血中CD4細胞數量在450 1440個/微升，為正常范圍。目前CD4細胞計數的標準檢測方法是傳統流式細胞法。該方法的基本原理是將樣 品中CD4細胞與熒光標記抗體反應后，進入流式細胞儀，然后使樣品中所有細胞依次排列 成單行，測定每個細胞的熒光量從而得到CD4細胞在淋巴細胞中的百分率。流式細胞法在 得到CD4細胞在淋巴細胞中的百分率以及淋巴細胞絕對值后，兩者相乘即獲得CD4細胞數。 現在國內外臨床使用的流式細胞儀被美國BD公司和貝克曼庫爾特公司所壟斷，其售價根 據型號及等級不同大致在60至100萬元人民幣，而每次測試所需費用在150至400元人民 幣。因此雖然流式細胞法具有結果精確，操作過程自動化，樣本處理量大等諸多優點，但價 格昂貴，加上其檢測所用的進口試劑，使每次測試成本很高，而且流式細胞儀培訓要求高、 維護也十分繁瑣。現國內在一些大、中城市的省級醫療衛生單位，流式細胞儀的使用已獲得普及，而 在地區級醫療衛生單位，尤其是艾滋病流行嚴重的貧困邊遠地區，還鮮見流式細胞儀的使 用。國外流式細胞儀的使用現狀也與國內相似，在發達國家的大、中型醫療衛生機構流式細 胞儀的使用已獲得普及，而在艾滋病流行最嚴重的一些發展中國家，尤其是一些非洲國家， 幾乎還很少有流式細胞儀。流式細胞儀的昂貴限制了其臨床上的普及。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種成本低廉、操作簡便的CD4細胞芯片。此外， 還需要提供一種CD4細胞芯片的制備方法和應用。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現
在本發明的一個方面，提供了一種CD4細胞芯片，包括固相載體和固定于該載體 上的抗體，所述抗體為CD4單克隆抗體，所述固相載體為玻片。優選的，在所述玻片表面設有反應區，所述CD4單克隆抗體固定在該反應區；更優 選的，所述反應區為單凹，或是在玻片表面圈出的具有一定形狀的封閉區域。進一步優選 的，單凹的孔徑為9 12mm，孔深為0. 2 0. 3mm，采用表面設有單凹或封閉區域的玻片，使 被測樣品局限于反應區范圍內進行抗原抗體特異性結合反應，有效降低了血液用量，使手 指術梢血采樣成為可能，同時在滿足細胞檢測要求的情況下，大大降低了抗體使用成本。在本發明的另一方面，提供了一種⑶4細胞芯片的制備方法，包括以下步驟用酸清洗玻片，使玻片表面帶陰離子電荷；將清洗過的玻片放入多聚賴氨酸溶液中浸泡適當時間，通過多聚賴氨酸攜帶的陽 離子電荷與所述玻片表面陰離子電荷之間的吸引，使多聚賴氨酸吸附于玻片表面；將CD4單克隆抗體滴加在玻片表面，室溫孵育合適時間，再用磷酸鹽緩沖液清洗 后烘干，于2 26°C保存待用。優選的，用酸清洗玻片的步驟包括先用鉻酸清洗玻片，再用5% 10%硝酸水溶 液清洗玻片，然后用水將玻片沖洗干凈。由于玻片的主要成分是二氧化硅，用鉻酸、硝酸水 溶液先后處理后玻片表面呈陰離子，有利于吸附攜帶的陽離子的多聚賴氨酸。優選的，所述玻片表面設有反應區，將CD4單克隆抗體滴加在玻片表面的反應區 內，經過酸清洗后玻片表面帶陰離子電荷，與多聚賴氨酸所帶正電荷異性相吸，多聚賴氨酸 與抗體蛋白以肽鍵結合。玻片表面設有反應區，不僅降低抗體使用成本，而且有效降低被測 血液用量。在本發明的另一方面，提供了 一種⑶4細胞檢測試劑盒，至少包括上述⑶4細胞芯 片。優選的，該CD4細胞檢測試劑盒還包括稀釋液、過氧化氫溶液、染色液和復染液。所述稀釋液為磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0 7. 4 ；所述過氧化氫溶液的體積百分 比濃度為2. 5 3. 5% ；所述染色液由堿性品紅、亞硝基鐵氰化鈉、聯苯胺按1 5%、3 5%、1 5%的質量體積百分比濃度溶解于95%乙醇配制而成；所述復染液由堿性品紅按 2 5%的質量體積百分比濃度溶解于95%乙醇配制而成。在本發明的另一方面，還提供了一種應用⑶4細胞芯片進行檢查的方法，包括以 下步驟將待測血樣滴加在CD4細胞芯片表面的抗體處，使其進行抗原抗體特異性結合反 應；用稀釋液洗去非特異性結合細胞和多余血樣；將玻片放入染色液中染色，并把染色后的玻片在過氧化氫溶液中浸置后，再轉入 復染液中染色，以區分CD4細胞和單核細胞；在光學顯微鏡下對CD4細胞計數，或采用自動計數儀完成CD4細胞計數。在本發明的另一方面，還提供了一種上述⑶4細胞芯片在制備診斷、監測或輔助 治療包括艾滋病、腫瘤性疾病、自體免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、腦梗死、慢性阻塞性 肺疾病的免疫力低下疾病產品中的應用。在本發明的另一方面，還提供了一種上述CD4細胞檢測試劑盒用于診斷、監測或
4輔助治療包括艾滋病、腫瘤性疾病、自體免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、腦梗死、慢性阻 塞性肺疾病的免疫力低下疾病的用途。CD4細胞檢測可獨立或與病毒載量協同作為艾滋病診斷、病程監測及輔助治療的 重要指標。監測和調控艾滋病感染者及患者的⑶4細胞數量，使其維持在一定范圍，讓患者 保持正常穩定的免疫功能，與病毒共存，維持正常的學習、工作和生活。CD4細胞檢測作為人體細胞免疫功能評估的重要指標之一，廣泛應用于免疫力低 下疾病、慢性疾病等臨床疾病的病理分析、輔助診斷、指導治療、預后判斷等方面。主要應用 于病毒感染性疾病；腫瘤性疾病；自體免疫性疾病；器官移植患者；乙型肝炎；腦梗死；慢 性阻塞性肺疾病；其他免疫缺損或異常的患者。在本發明的另一方面，還提供了一種上述CD4細胞檢測試劑盒用于健康體檢的用 途。CD4細胞檢測提供了人體免疫力的量化指標。檢測免疫力的主要指標是血清免疫 球蛋白(Ig)定量分析和T淋巴細胞亞群分析。主要應用于亞健康檢測；健康人群免疫功 能評估；功能性免疫制劑(中藥、保健品、免疫球蛋白等)功效的評價；疾病預防、篩查的輔 助診斷。由于采用上述技術方案，本發明⑶4細胞芯片具有如下優點(1)成本低廉，檢測費用遠遠低于流式細胞法，特別適用于無流式細胞儀檢測條件 而又急需開展CD4細胞檢測項目的艾滋病流行嚴重地區。(2)操作簡便，無需特殊專業培訓，檢測人員通過簡單培訓即可掌握全套流程，實 現醫務專業人員缺乏地區的可操作性。(3)產品室溫貯存，無需冷藏，器具簡便易攜，操作環境無特殊要求，為資源匱乏地 區進行正常檢測提供有力保障。(4)用血量少，靜脈血或手指末梢血均可，手指血的使用極大降低了采血難度，減 少了受檢者的受壓程度，為幼兒、常住院病人等采血困難者提供了便利。(5)玻片樣本可長期保存，隨時隨地復查，因為通過檢測已將⑶4細胞永久固定于 玻片，可隨時隨地進行計數或復查；可為受檢者建立免疫力數據庫，制作個性化健康管理檔 案，實現病程監測。(6)檢測樣本處理時間短，無需溶血。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明制備CD4細胞芯片所依據的多聚離子電荷結合法原理示意圖；圖2是本發明實施例3應用CD4細胞芯片進行檢測的步驟示意圖；圖3是本發明CD4細胞檢測盒與流式細胞法檢測結果的相關性示意圖。
具體實施例方式本發明突破常規細胞檢測法的傳統原理，將細胞投入到固相包被抗體上加以固定 并進行分析。當血樣中表達有CD4抗原的細胞與預先包被有CD4單克隆抗體的玻片接觸后 反應，CD4細胞便會被固定在玻片上。經淋洗、染色后，即可用顯微鏡或自動計數儀對CD4細胞進行計數。常用的抗體固相包被技術中，利用范德華力的物理吸附法不適用于玻璃載體；而 利用共價鍵結合的多聚賴氨酸反應法及氨基硅烷偶聯法雖能包被抗體，但非特異性細胞固 定過多，不適用于特異性細胞檢測。本發明開發出以多聚離子電荷結合法(見圖1)為原理 的抗體包被新技術，即玻片載體通過處理后表面帶陰離子電荷，帶陽離子電荷的多聚賴氨 酸通過陰陽離子相互作用吸附于玻片載體上，多聚賴氨酸與抗體蛋白以肽鍵結合，從而有 效地將抗體包被于玻片上，基于多聚離子電荷結合法原理制成的本發明⑶4細胞芯片，包 括固相載體玻片和固定于該玻片上的CD4單克隆抗體，既能使抗體均勻包被，又適用于特 異性細胞檢測。優選的，本發明在玻片表面設有反應區，CD4單克隆抗體固定在該反應區；更優選 的，反應區為單凹，或是在玻片表面圈出的具有一定形狀的封閉區域。在本發明實施例中， 采用一種特殊加工的表面帶有微小單凹的載玻片作為固相載體，CD4單克隆抗體固定于該 單凹中。單凹的孔徑為9 12mm，孔深為0. 2 0. 3mm，單凹的孔形圓整、無塌眼、無擦痕、 無砂眼、無氣泡、無睫毛狀孔邊，孔內外不得有霉斑、麻斑。玻片上的單凹結構使被測樣品局 限于一定范圍內進行抗原抗體特異性結合反應，血液用量僅0. 25微升左右，為流式細胞法 所用量的1/400，既大大降低了抗體使用成本，又滿足了細胞檢測的要求，同時使手指術梢 血采樣成為可能。實施例1⑶4細胞芯片的制備1.玻片清洗在室溫下，將玻片于鉻酸清洗液中浸泡2 4小時，工藝用水沖洗干凈。將玻片浸 泡于5% 10%硝酸水溶液中，85°C烘箱加熱1. 5 3. 5小時。工藝用水沖洗干凈后，將玻 片浸泡于工藝用水中室溫保存。由于玻片的主要成分是二氧化硅，用鉻酸、硝酸水溶液先后 處理后玻片表面帶陰離子電荷。2.抗體包被前處理取出浸泡于工藝用水中的玻片，敲擊掉適量工藝用水，使玻片仍以濕潤狀態浸泡 于0. 1 0. 5% (W/V)的多聚賴氨酸溶液中30 60分鐘，用工藝用水淋洗干凈后，以600 800r/min速度離心4分鐘甩干，室溫保存。多聚賴氨酸攜帶陽離子電荷，通過與玻片表面陰 離子電荷的相互作用，使多聚賴氨酸吸附于玻片表面。3.抗體包被將濃度為5 10 μ g/ml的鼠抗人⑶4單克隆抗體10_20 μ 1滴加在單凹上，室溫 孵育30 40分鐘。用PBS液淋洗后，80°C烘箱干燥5 10分鐘，放入玻片盒中2 26°C 密閉保存。實施例2⑶4細胞檢測試劑盒的制備CD4細胞檢測試劑盒包含CD4細胞芯片、稀釋液、過氧化氫溶液、染色液和復染液。⑶4細胞芯片通過實施例1制備。稀釋液可以由稀釋液片劑溶于水溶液而制成。稀釋液片劑為市售商品，購自上海 保康生物高科技有限公司，主要成分為氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸、 吐溫20等，以一片溶解于40ml水溶液即可配制成pH7. 0 7. 4的磷酸鹽緩沖液。其規格 為10片/包，密封鋁箔袋裝，遮光密閉保存。試劑盒組裝時僅在袋外加貼標簽即可。稀釋液也可以通過將上述各種鹽按一定的濃度配制而成。過氧化氫溶液體積百分比濃度為2. 5 3. 5%，遮光密閉陰涼處保存。實際生產時 只需分裝成30ml/瓶，并在瓶外加帖標簽即可。染色液的配制將堿性品紅、亞硝基鐵氰化鈉、聯苯胺按1 5%、3 5%、1 5% (W/V)的濃度比例溶解于95%乙醇后，置于棕色聚酯乙烯塑料試劑瓶中，于2 26°C密封保存。復染液的配制將堿性品紅按2 5% (W/V)的濃度比例溶解于95%乙醇后，置于 棕色聚酯乙烯塑料試劑瓶中，于2 26°C密封保存。實施例3應用⑶4細胞芯片進行檢測(整體流程見圖2)1、特異結合反應加水于濕盒內，使濕盒底部完全被水覆蓋，擱置玻片處應保持干 燥。取出玻片，將玻片置于濕盒支架上，蓋緊盒蓋。將稀釋后血樣滴加在CD4細胞芯片的已 包被抗體處，進行抗原抗體反應。室溫下(20 30°C )濕盒內反應40分鐘。2、淋洗、染色反應后的玻片用稀釋液提拉5 10次不等，主要是用稀釋液洗去非 特異性結合細胞和多余血樣，然后放入染色液缸中(有CD4抗原表達的細胞將被染上色)， 靜置1分鐘后，將稍加浙干的玻片架轉入新鮮過氧化氫工作溶液中，靜置4分鐘。接著將玻 片架轉入75%酒精專用缸中浸泡2分鐘后，根據玻片數量不同提拉5 10次不等，直至玻 片呈無色透明或淡粉紅色后將玻片架轉入復染液缸中，靜置1分鐘。最后將玻片架轉入水 中，根據玻片數量不同提拉5 10次不等，直至玻片呈淡紫紅色(如鏡檢發現細胞染色過 淡，請重復復染)。上述染色步驟中，染色液染色后的玻片轉入過氧化氫溶液中浸置，是因為除了 CD4 淋巴細胞表面有CD4抗原的高表達外，單核細胞也存在CD4抗原的低表達，經染色液染色， CD4細胞與單核細胞都被染上色。但是單核細胞胞漿內含有過氧化物酶，而CD4細胞為淋 巴細胞，淋巴細胞胞漿內不含有過氧化物酶，采用過氧化物酶染色法對固定在玻片上的CD4 細胞與單核細胞進行區別，即將染色后的玻片轉入過氧化氫溶液中，讓氧化物酶與過氧化 氫反應。由于單核細胞胞漿內含有過氧化物酶，經過過氧化物酶染色后，細胞內會出現黑灰 色顆粒。與此相反，由于所需檢測的CD4細胞胞漿內不含過氧化物酶，在過氧化氫溶液中浸 置后，細胞內不出現黑灰色顆粒，通過光學顯微鏡即可對CD4細胞與單核細胞進行區分，該 方法簡單，而且無需增加CD4抗體來剔除單核細胞，成本非常低廉。3、計數玻片自然晾干后可直接用普通光學顯微鏡的10倍物鏡計算⑶4細胞數 量；或用上海匯中細胞生物科技有限公司研發的自動計數儀進行自動計數。4、準確性分析本發明⑶4細胞檢測盒經上海傳染病醫院、北京協和醫院、北京佑安醫院、上海中 山醫院、美國疾病預防控制中心(CDC)和日本大分大學艾滋病診療中心共1301例臨床考核 所得數據與流式細胞法進行Pearson相關性分析和Bland-Altman散點圖分析(見圖3)。 Pearson相關性分析和Bland-Altman散點圖分析是研證兩方法能否互相替代的經典分析 工具，其中Pearson相關性分析可得兩方法之間具有良好的相關性；Bland-Altman散點圖 分析是臨床檢驗研究中用來比較兩檢驗方法之間差異的最佳分析方法。結果表明CD4細 胞檢測盒與流式細胞法檢測結果的相關性達0. 95，平均絕對誤差僅3個/ μ 1。5、特異性定量分析
本發明CD4細胞檢測盒通過用流式細胞法檢測分別包被CD4、CD8抗體的細胞芯片 反應前后CD4、CD8的百分含量的變化進行芯片特異性定量分析，數據表明當細胞芯片包 被有CD4抗體時，僅特異的與CD4細胞結合，反應后芯片上血樣幾乎無CD4細胞殘留，而CD8 細胞則完全沒有被結合，反之亦然(見下表1)。表1⑶4細胞檢測盒特異性定量分析同一血樣反應前后⑶4、⑶8細胞百分率(η = 6)
玻片包被 抗體種類CD4抗體包被玻片CD8抗體包被玻片流式細胞 測記結果反應前反應后反應前反應后CD4%42. 30. 742. 341. 943. 30. 243. 343. 234. 10. 134. 134. 037.90. 637. 937. 335. 50. 435. 534. 933.80. 333. 833. 6CD8%29. 129. 029. 10. 535. 235. 135. 20. 330. 930. 730. 90. 431. 531.431. 50. 727. 627. 127.60. 332. 732. 232. 70. 56、批次間重復性檢測本發明CD4細胞檢測盒中細胞芯片進行不同生產批次間重復性檢測結果比較數 據表明，CV控制在5%之內，重復性良好(見下表2)。其中CV為數據波動百分數，用來評 價重復性，一般重復性考核CV控制在20%以內為合格。表2⑶4細胞檢測盒批次間重復性檢測
健康人柞木(n=5)流式法901玻片法896920892916872f-均數=899,CV=2.166%患各樣木(n=5)流式法295玻片法308292324296300平均數=304，CV=4.161%7、操作者間重復性檢測本發明CD4細胞檢測盒中細胞芯片進行操作者間重復性檢測結果比較數據表明， CV控制在5 %之內，重復性良好(見下表3)。表3⑶4細胞檢測盒操作者間重復性檢測
8
健康人樣本(n=10)
流式法670操作存 A640604632672664 均數=647 cv=3,879%636680680636632操作者 B692680744708668平均數=677 cv=4.547%640664660646676
丁 檢驗F (5.132)<F0 05(8.28), P>0.05
不同操作者之間無差異8、靈敏度測定本發明CD4細胞檢測盒對血樣不同稀釋濃度的CD4細胞進行靈敏度測定，數據表 明無論血樣中CD4細胞過多或過少均能準確檢測(見下表4)，表4中的“r”指與流式檢 測的相關性。表4⑶4細胞檢測盒靈敏度測定
靈敏度的測試(n=6)稀釋比例CD4細胞計數(個/μΙ)1 416621776145452071 8871134075241081 1642601939115111 3223299185261 64111449212r0.99970.99960.99940.99960.99890.9996 以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能 因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說， 在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范 圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
權利要求
一種CD4細胞芯片，包括固相載體和固定于該載體上的抗體，其特征在于，所述抗體為CD4單克隆抗體，所述固相載體為玻片。
2.根據權利要求1所述的CD4細胞芯片，其特征在于，在所述玻片表面設有反應區，所 述CD4單克隆抗體固定在該反應區。
3.—種CD4細胞芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟用酸清洗玻片，使玻片表面帶陰離子電荷；將清洗過的玻片放入多聚賴氨酸溶液中浸泡適當時間，通過多聚賴氨酸攜帶的陽離子 電荷與所述玻片表面陰離子電荷之間的吸引，使多聚賴氨酸吸附于玻片表面；將CD4單克隆抗體滴加在玻片表面，室溫孵育合適時間，再用磷酸鹽緩沖液清洗后烘 干，于2 26°C保存待用。
4.一種CD4細胞檢測試劑盒，其特征在于，至少包括權利要求1所述的CD4細胞芯片。
5.根據權利要求4所述的CD4細胞檢測試劑盒，其特征在于，還包括稀釋液、過氧化氫 溶液、染色液和復染液。
6.根據權利要求5所述的CD4細胞檢測試劑盒，其特征在于，所述染色液由堿性品紅、 亞硝基鐵氰化鈉、聯苯胺按1 5%、3 5%、1 5%的質量體積百分比濃度溶解于95% 乙醇配制而成。
7.一種應用CD4細胞芯片進行檢查的方法，其特征在于，包括以下步驟將待測血樣滴加在CD4細胞芯片表面的抗體處，使其進行抗原抗體特異性結合反應；用稀釋液洗去非特異性結合細胞和多余血樣；將玻片放入染色液中染色，并把染色后的玻片在過氧化氫溶液中浸置后，再轉入復染 液中染色，以區分CD4細胞和單核細胞；在光學顯微鏡下對CD4細胞計數，或采用自動計數儀完成CD4細胞計數。
8.權利要求1所述的CD4細胞芯片在制備診斷、監測或輔助治療包括艾滋病、腫瘤性疾 病、自體免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、腦梗死、慢性阻塞性肺疾病的免疫力低下疾病產 品中的應用。
9.權利要求4所述的CD4細胞檢測試劑盒用于診斷、監測或輔助治療包括艾滋病、腫瘤 性疾病、自體免疫性疾病、器官移植、乙型肝炎、腦梗死、慢性阻塞性肺疾病的免疫力低下疾 病的用途。
10.權利要求4所述的CD4細胞檢測試劑盒用于健康體檢的用途。
全文摘要
本發明公開一種CD4細胞芯片，包括固相載體和固定于該載體上的抗體，所述抗體為CD4單克隆抗體，所述固相載體為玻片。本發明還公開了CD4細胞芯片的制備方法、含CD4細胞芯片的CD4細胞檢測試劑盒、以及應用CD4細胞芯片進行檢測的方法。本發明還公開了CD4細胞芯片和CD4細胞檢測試劑盒的應用。本發明CD4細胞芯片，成本低廉、操作簡便，特別適用于艾滋病毒感染嚴重的貧困地區。
文檔編號G01N33/552GK101957378SQ20091005759
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月13日 優先權日2009年7月13日
發明者何駿杰, 曹波, 楊君 申請人:上海匯中細胞生物科技有限公司