專利名稱：：適用于快速檢測食品中微生物總數狀況的微量熱法的制作方法
技術領域：
：本發明屬于食品安全微生物快速檢測
技術領域：
，特別涉及一種適用于檢測食品中的微生物總數狀況的微量法。
背景技術：
：目前，國內外研究的基于代謝學的快速檢測技術快速檢測食品中微生物總數的方法主要有ATP生物發光技術、酶底物法、電化學技術、噬菌體技術等。這些方法大多存在操作繁瑣、檢測時間太長的缺點且受樣品復雜性的影響，造成結果的不準確性。微量熱技術是一種通過測定細菌生長時熱量的變化對細菌進行鑒別和檢測的方法。通過敏感的微量熱計對微生物在生長過程中產生的熱量進行測量，由于不同細菌新陳代謝各異，因而經測量得到的熱圖譜也各不相同。但是由于放熱量與微生物數量呈相關性，一旦建立了參考熱譜圖，就可以對細菌進行鑒定和檢測，使鑒定檢測步驟大為簡化，一般只需數小時，因此微量熱技術具有廣泛的應用前景。實驗證實微量熱法可用于檢測食品中的微生物總數的狀況，采用量熱的方式來進行分析，具有通用性強、適用于大多數生化樣品、在測量時不受其他電化學活性物質或光學物質的干擾等優點。但是由于微生物生長放熱量過于微小，利用高精度的MicroDSCIII微量熱儀才能夠檢測出，但由于測量結果平行性較差，降低了這種方法的實用性。
發明內容為克服微量熱法檢測食品中微生物總數狀況中微生物生長放熱量過于微小的缺點，本發明提出一種適用于快速檢測食品中微生物總數狀況的微量熱法。本發明采用如下技術方案一種適用于快速檢測食品中微生物總數狀況的微量熱法，通過檢測微生物生長過程中產生的C02的量檢測食品中微生物總數狀況。進一步地，所述產生的C02的量的計算方法為將產生C02與堿液發生酸堿化學反應，通過計算被消耗掉的堿液的量，推算出C02的量。進一步地，所述被消耗掉的堿液的量的計算方法為計算未與C02發生化學反應的相同的堿液與酸中和產生的熱量值，計算與C02發生化學反應的剩余堿液與酸中和產生的熱量值，計算兩者之間的熱量差值，算出被消耗的堿的量。本發明將熱與微生物生長過程緊密結合在一起，利用微生物生長呼吸產生的C02與堿液反應所產生的熱量實現對樣品的檢測。針對熱量過小的問題，改進微量熱法的檢測方式，利用酸液再次中和與C02反應后剩余的堿液的方式，將待測熱量值放大，在保持結果準確的同吋提高了試驗結果的平行性，使微量熱法真正成為簡易、方便、實用的快速檢測微生物方法。圖1為本發明檢測C02溶于堿液的實驗裝置；圖2為本發明驗證檢測C02與堿液反應熱量被檢測的可行性的實驗裝置；圖3為本發明微量熱儀槍測得到的C02與堿液反應曲線；圖4為本發明含菌的標準菌液釋放的C02與堿液反應的熱圖譜；圖5為本發明不含菌的標準菌液釋放的C02與堿液反應的熱圖譜；圖6為本發明測定細菌總數的標準曲線；圖7為本發明測定另一種細菌總數的標準曲線。具體實施例方式一種適用于快速檢測食品中微生物總數狀況的微量熱法，通過檢測微生物生L侖過程中產生的C02的量檢測食品中微生物總數狀況。由于菌體生長放熱是每一種菌體都會產生的，而替代物也需要具有同樣的普遍性。微生物的基本生長過程是C源+0一N源一細胞量+H"+C02+產物+熱量從上面方程式看出，微生物將各種能源物質分解利用，除了生長用之外，還會產生水、C02、各種產物以及熱量。由于微生物是培養在水環境中，因此無法對產生的水進行檢測，而熱量已經被否定了，同時不同的微生物所產生的產物是不同的，無法從中找到共同性，因此C02將是最好的選擇。由于食品中易污染的菌體通常都是好氧菌，菌體在呼吸過程中均會產生C02，C02能溶于水(體積比l:l)生成碳酸，即可與堿反應。利用二氧化碳與堿液發生酸堿化學反應放熱，與微生物生長熱相比，熱值有了較大的提升。進一步地，本發明將微生物生長直接放的微小熱量檢測轉化為酸堿反應放熱檢測，具體檢測方法為用酸去同時中和微量熱儀(MicroDSCIII)樣品池和參比池中的剩余堿液，通過熱量差值推算樣品中微生物總數。由于整個實驗的檢測時間約8個小時，這些熱量平均在8個小時內，所需檢測的熱值仍然是很小的，通過量熱儀器檢測是很難實現的。因此有必要將待測熱量放大，最好能在短時間內釋放大量的熱。由于C02在與堿液反應時會消耗掉部分堿，反應結束時，樣品池內的堿液與參比池內的堿液濃度必然會有差別，酸液過量情況下用酸去同時中和樣品池和參比池中的剩余堿液，參比池釋放的熱量必然會大于樣品池的熱量，這兩個熱值的差即為被消耗的堿的量，從而可以推算出這部分堿消耗掉的C02的量，繼而推算出樣品中含有的微生物的量。而且，由于酸堿反應屬于無機化學反應，短時間內放出的熱量很大，因此，在利用C02與堿反應的基礎上，再添加一步用酸去中和剩余的堿，就達到了放大熱量的目的。為驗證本發明方法的可行性，本發明采用圖1所示的實驗裝置檢測C02溶于堿液的可行性，圖l中各部分功能如下蠕動泵l，用于向微生物培養瓶中不斷吹入含氧的空氣；空氣洗脫瓶2，用于處理蠕動泵1吹入含氧的空氣中的C02,如果空氣不經處理就直接吹入堿瓶中將會引起堿液的消耗而得出錯誤的結論；微生物的培養裝置3，包括培養瓶和在培養瓶周圍設置的溫度環境，此處的溫度環境為恒溫(37°C)水浴，因為微生物的生長是有最適合生長的溫度，選擇合適生長的溫度培養能夠加快檢測速度；堿瓶，包括樣品瓶41和參比瓶42，堿瓶中的堿液中含有酸堿指示劑(藍色)，以方便觀察顏色的變化。培養12小時(h)后，堿瓶中原本藍色的堿液，參比瓶42中顏色基本沒有變化；而樣品瓶41中由于吸收了細菌呼吸產生的C02而成為黃色，效果十分明顯。可見菌體呼吸產生的C02是能夠溶于堿液并與堿液反應的。碳酸與堿液反應消耗堿，堿液的pH會發生變化。利用酸堿指示劑會對不同pH的液體產生不同顏色變化的特性，實現對堿液的pH的簡單測定。如果菌體產生的C02消耗了堿，就會引起堿液的顏色發生變化，可以直觀的觀測到檢測C02溶于堿液是可行的。進一步地，通過圖2中的裝置驗證檢測C02與堿液反應熱量被檢測的B/行性。如圖2所示，將圖1中的堿瓶換成微量熱儀(本實施例中采用的型號為MicroDSCIII),由于微量熱儀有一種循環池非常適合氣液混合放熱的檢測，本試驗選擇微量熱儀作微量熱儀器，其余各部分與圖丄相同。圖3為微量熱儀檢測得到的C02與堿液反應曲線，圖中橫坐標為時間單位(秒)，縱坐標為熱量單位(毫瓦mW)。從圖3看出，熱值曲線在后期有一個明顯的上升峰，與菌體的生長過程狀態十分吻合，由此可知C02與堿液反應產生的熱量也是可以被檢測得的。在細菌培養的優化條件下，利用已知濃度的B3菌液作為待測菌液，可得到一條與菌體生長狀態相關的熱圖譜，如圖4、圖5所示，圖4為標準菌液釋放的C02與堿液反應的熱圖譜(含菌)，圖中橫坐標為時間單位(小時)，縱坐標為熱量單位(毫瓦mW)，圖5為標準菌液釋放的C02與堿液反應的熱圖譜(不含菌)，圖中橫坐標為時間單位(小時)，縱坐標為熱量單位(毫瓦mW)。通過對熱圖譜中4h到8h的累積放熱值進行面積積分，就得到了8h內菌體生長釋放出的C02與堿液反應產生的熱量值。在相同條件下，用已知的不同細菌總數的B3菌懸液重復試驗，將熱量值與初始細菌總數一一對應，即得到此種細菌的標準曲線，如圖6所示。經過對所得試驗數據進行線性擬合，得到曲線方程為y=0.0007x+l.5375，R2=0.9738。線性關系非常好。下表1為標準曲線驗證實驗結果-<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1從表1中看出，利用最佳培養條件，對未知濃度的B3菌液檢測，同時利用標準曲線及平板計數法進行對比，所得的結果偏差不大，誤差值為8.86%和0.7%，基本符合要求，證明了這條標準曲線的準確性。同時，標準曲線提供了500cfu/ml左右菌量的熱量值，可以滿足大多數食品安全標準對細菌總數的要求，也表明這種方法得出的標準曲線有著實際應用價值。為了驗證這種方法有普遍的應用性，選擇另一種菌再次驗證。測定細菌總數的標準曲線如圖7所示，從實驗結果看，對于不同的菌體，利用C02作為測量對象檢測樣品初始細菌總數的方法仍然可行，因此這種方法在檢測食品中微生物含量時是完全可行的，并可以普遍應用于不同的微生物檢測中。權利要求1、一種適用于快速檢測食品中微生物總數狀況的微量熱法，其特征在于通過檢測微生物生長過程中產生的CO2的量檢測食品中微生物總數狀況。2、根據權利要求l所述的適用于快速檢測食品中微生物總數狀況的微量熱法，其特征在于所述產生的C02的量的計算方法為將產生C02與堿液發生酸堿化學反應，通過計算被消耗掉的堿液的量，推算出C02的量。3、根據權利要求1或2所述的適用于快速檢測食品中微生物總數狀況的微量熱法，其特征在于所述被消耗掉的堿液的量的計算方法為計算未與C02發生化學反應的相同的堿液與酸中和產生的熱量值，計算與C02發生化學反應的剩余堿液與酸中和產生的熱量值，計算兩者之間的熱量差值，算出被消耗的堿的量。全文摘要適用于快速檢測食品中微生物總數狀況的微量熱法，將微生物生長放熱轉化為酸堿反應放熱，其方法步驟為1)用檢測菌體生長放出的CO<sub>2</sub>替代直接檢測菌體生長熱，利用CO<sub>2</sub>與堿液發生酸堿化學反應放熱；2)用酸去同時中和MicroDSCIII樣品池和參比池中的剩余堿液，參比池內的堿液由于未被CO<sub>2</sub>中和，釋放的熱量必然會大于樣品池的熱量，這兩個熱值的差即為被消耗的堿的量，從而可以推算出這部分堿消耗掉的CO<sub>2</sub>的量，據測定細菌總數的標準曲線推算出樣品中含有的微生物的量。由本檢測方法進行微生物總數檢測大大提高了檢測靈敏度、縮短了檢測時間，適用于量熱法檢測微生物總數。文檔編號G01N25/20GK101592624SQ200910053379公開日2009年12月2日申請日期2009年6月19日優先權日2009年6月19日發明者斐徐,李學輝,李思超,章海鵬申請人:上海理工大學