人組織因子途徑抑制物-2單克隆和多克隆抗體的制備及應用的制作方法

專利名稱：人組織因子途徑抑制物-2單克隆和多克隆抗體的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及識別作為抗原的人組織因子途徑抑制物-2的單克隆抗體，涉及識別 作為抗原的hTFPI-2的多克隆抗體，一種產生所述單克隆抗體的雜交瘤，一種作為免疫原 的hTFPI-2，一種鑭系稀土元素銪(Eu3+)標記的羊抗鼠IgG，免疫印跡，免疫組化和檢測試劑
品.ο
背景技術：
hTFPI-2，又稱胎盤蛋白-5 (placental protein 5，PP-5)和基質相關性絲氨酸蛋 白酶抑制劑(matrix-associated serine protease inhibitor,MSPI),是一禾中帶有Kunitz 型結構域的蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員。hTFPI-2與人組織因子途 徑抑制物(hTFPI)的氨基酸順序有著很高的同源性，且二者的性質也有一定的相似性，因 此最終命名為組織因子途徑抑制物_2 (TFPI-2)。hTFPI-2主要由胎盤滋養細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、角化細胞合成和分泌， 廣泛存在于胰腺、肝臟、腎、肺等器官中。此外，還有一定量的hTFPI-2存在于精漿及卵泡液 中。精漿中的hTFPI-2和精子的活動率相關，而卵泡液中的hTFPI-2則可能和卵泡成熟過 程中卵泡的破裂過程有關。體外研究發現hTFPI-2能夠抑制胰蛋白酶、纖溶酶、基質金屬蛋白酶(MMP)、糜蛋 白酶、血漿緩激肽釋放酶和凝血因子Vn (F νπ)/組織因子復合物活性，但是對組織型纖溶 酶原激活物(tPA)、尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)無抑制作用。已有的研究表明，機體 內hTFPI-2主要定位于細胞外基質(ECM)，因此，推測hTFPI-2在胚胎發育、傷口愈合、惡 性腫瘤侵襲轉移和動脈粥樣硬化等涉及ECM重塑的生理病理過程中發揮作用。文獻表明， hTFPI-2能夠抑制纖維肉瘤、膠質瘤等多種腫瘤細胞的侵襲轉移，也能夠抑制動脈粥樣硬化 部位斑塊的脫落。在多種惡性程度比較高的腫瘤細胞中TFPI-2的表達量很低，而在惡性程 度比較低的腫瘤細胞中其表達量較高。據此有人提出可根據血液hTFPI-2水平來初步判斷 腫瘤細胞的惡性程度。鑒于hTFPI-2的重要性，許多研究者認為hTFPI-2具有潛在治療惡 性腫瘤和動脈粥樣硬化的作用。此外，hTFPI-2還反映胎盤的功能，并與抗凝功能有關。hTFPI-2在正常男性及非妊娠女性循環血液當中的含量甚微，而在正常妊娠女 性血液當中，TFPI-2水平可升高40-70倍。在妊娠高血壓綜合征(以下簡稱妊高征)患 者，由于胎盤功能受損，血液TFPI-2水平會出現明顯下降。此外，肝素也可以明顯提高血 液中hTFPI-2的含量，小劑量的肝素即可使hTFPI-2升高10-40倍，這提示有相當數量的 hTFPI-2和內皮細胞相結合，當注入肝素后hTFPI-2便釋放入血。hTFPI-2有兩個糖化位點，分別位于Asnl 16和Asnl70。糖化程度的不同，使 hTFPI-2的分子量從25Kda到33Kda不等，有25KDa、27KDa、32KDa、33KDa等幾種不同的形式。由于hTFPI-2在正常男性及非妊娠女性循環血液當中的含量甚微，鑒于上述hTFPI-2所涉及到的一些生理功能，需要建立一套能夠準確監測血液TFPI-2水平的方法。 雖然也有一些方法，比如ELISA，RIA等對TFPI-2濃度進行過檢測，但由于ELISA靈敏度不 夠，無法檢測出妊高征患者血液內的hTFPI-2，而RIA靈敏度盡管稍高于ELISA，但由于其放 射性污染的問題而未能得以廣泛應用，因此目前國內外尚沒有研制出用以檢測hTFPI-2水 平的完整試劑盒。在本領域內，運用了 DELFIA這一高靈敏度又無放射性污染的監測技術，克服了上 述ELISA與RIA所存在的問題，建立了一套靈敏、安全的檢測hTFPI-2的試劑盒。在運用了 DELFIA技術的hTFPI-2試劑盒當中，使用了 TFPI-2的單克隆抗體，可實現高度特異性，而不 顯示任何交叉反應性在批與批之間的差異，便于質量控制，而且實現了高靈敏度。發明簡述本發明屬生物技術領域，具體涉及一種通過基因克隆表達的hTFPI-2產生的單克 隆抗體以及一種通過此hTFPI-2產生的多克隆抗體。運用hTFPI-2單克隆抗體與多克隆抗 體建立了一種檢測方法，通過它可安全、靈敏的測定血液TFPI-2水平。而且由于使用了一 種單克隆抗體，沒有交叉反應性，特異性良好，在批與批之間沒有變化，便于質量控制，而且 當使用一種單克隆抗體時，也顯示良好的靈敏度。本發明提供了一種作為免疫原的hTFPI-2。本發明提供了一種識別作為抗原的hTFPI-2的多克隆抗體。本發明提供了一種識別作為抗原的hTFPI-2的單克隆抗體。本發明提供了一種雜交瘤，它產生識別作為抗原的hTFPI-2的單克隆抗體。本發明的雜交瘤優選是本發明的雜交瘤優選是hTFPI_22C8。由本發明的雜交瘤產生的單克隆抗體構成了本發明的一個方面。用本發明的單克隆抗體進行的免疫印跡構成了本發明的一個方面。用本發明的單克隆抗體進行的免疫組化構成了本發明的一個方面。本發明的免疫印跡優選用于人臍靜脈內皮細胞hTFPI-2的檢測。本發明的免疫組化優選用于乳腺癌細胞中hTFPI-2的檢測。本發明的免疫印跡的標本是臍靜脈內皮細胞。本發明的免疫印跡的標本是乳腺癌組織。含有本發明的單克隆抗體和多克隆抗體的檢測試劑盒也構成了本發明的一個方本發明的檢測試劑盒優選用于檢測孕婦及動脈粥樣硬化患者血液hTFPI-2水平。本發明的檢測試劑盒標本可以是血漿或血清。本發明的檢測試劑盒優選用DELFIA技術進行。附圖簡述

圖1說明了實施例1觀察到的親和層析柱的洗脫曲線。圖2A與B分別說明了實施例1所純化hTFPI-2單抗的還原型SDS-PAGE鑒定圖與 非還原型SDS-PAGE鑒定圖。圖3說明了實施例1所純化hTFPI-2單抗的染色體分析圖。圖4說明了實施例2觀察到的親和層析柱的洗脫曲線。圖5說明了實施例3觀察到的Sijphacryl S-200凝膠柱層析分離的洗脫曲線。
圖6為實施例4所建立的hTFPI-2測定標準曲線。圖7A與B分別為實施例5所測得的正常妊娠女性及妊高征患者血漿hTFPI_2水平。圖8為實施例6所采用的免疫印跡法鑒定人奇靜脈內皮細胞(HUVEC)hTFPI-2。圖9為實施例7所采用的免疫組織化學的方法檢測人乳腺癌細胞hTFPI-2。發明詳述本發明的單克隆抗體識別人hTFPI-2作為抗原。本發明的單克隆抗體可通過本發明的雜交瘤產生，因此是可以從培養本發明的雜 交瘤的培養液或用本發明的雜交瘤免疫小鼠從其腹水中獲得。然而產生本發明的單克隆抗 體的方法不受限制，但如果工程化的抗體如能與hTFPI-2特異性結合，它也在本發明的范 圍之內。本發明的雜交瘤產生識別hTFPI-2作為抗原的單克隆抗體，并可通過經hTFPI-2 免疫的動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合獲得。本發明的雜交瘤可以用本領域已知的細胞融合技術產生。因此，用hTFPI-2作為 免疫原免疫除了人以外的動物，將該動物的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，產生雜交瘤，從其選 出產生識別hTFPI-2的單克隆抗體的雜交瘤，從而獲得了本發明的雜交瘤。上述提到的免疫原不受特別限制，但包括基因克隆表達的hTFPI-2。用作上述免疫原的hTFPI-2的形式不受限制，可以是25KDa、27KDa、32KDa、33KDa 等幾種不同的形式。經免疫產生本發明的雜交瘤的動物不受特別限制，但包括例如山羊、綿羊、豚、小 鼠、大鼠和家兔。在其中優選的是小鼠。可用任何本領域已知的方法免疫上述產生本發明的雜交瘤的動物。在免疫小鼠 中，例如，可能提到的方法包括20-40ug，優選20微克脾內直接免疫。本發明的實踐中，免疫上述動物后選擇抗體滴度高的個體。免疫3-5日后切下它 們每一只的脾臟脾臟或淋巴結，將這些組織中所含的產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞，通過 本領域已知的細胞融合法，在融合促進劑存在下融合，制備雜交瘤細胞株。產生單克隆抗體的細胞與骨髓瘤細胞融合所使用的融合促進劑不受限制，但包括 例如聚乙二醇(下文稱PEG)，仙臺病毒等。然而PEG是優選的。上述細胞融合的方法不受限制，但可以包括方法按1 1-10 1之比混合脾細 胞和骨髓瘤細胞，加入Iml 37°C預熱的50% PEG進行細胞融合，優選2 1之比混合脾細 胞和骨髓瘤細胞。上述骨髓瘤細胞不受特別限制，但首選SP2/0骨髓瘤細胞。大量制備本發明的單克隆抗體的方法不受限制，方法可以是例如將雜交瘤移植 到預先施用降植烷的小鼠腹腔中，回收腹水并從中獲得抗體。可通過本領域已知的方法，用 蛋白A柱或蛋白G柱等純化腹水中的單克隆抗體。本發明所制備的單克隆抗體進行抗原抗體反應的鑒定方法不受限制，如采用 DELFIA、免疫印跡法或免疫組織化學。本發明的單克隆抗體的家族和亞家族不受特別限制，但可以是IgGp IgG2, IgG3、 IgG4JgMUgEUgA1UgA2* IgD任一。L鏈也不受特別限制，但可以是λ鏈或κ鏈。
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本發明的單克隆抗體不受特別的限制，但可以是任何能與hTFPI-2抗原表位結合 的抗體。例如，可以是F(ab’)2、Fab’或Fab，它們是本發明單克隆抗體的降解產物，或嵌合 抗體。本發明的單克隆抗體的應用領域不受特別限制，但能用于免疫測定，用于檢測 hTFPI-2 水平。經免疫產生本發明的多克隆抗體的動物不受特別限制，但包括例如家兔、山羊或 綿羊、馬、騾和豚鼠。在其中優選的是家兔。可用任何本領域已知的方法免疫上述產生本發明的多克隆抗體的動物。在免疫家 兔中，例如，初次免疫可能提到的方法包括200ug-lmg，注射途徑可能有皮內、皮下、肌肉、靜 脈或淋巴結內。優選Img皮內注射。可能提到加強免疫的劑量為首次劑量的1/5-2/5，注射 途徑可能有皮下或腹腔注射，優選首次劑量的2/5皮下注射，間隔時間為10天。本發明的多克隆抗體的應用領域不受限制，但能用于免疫測定，用于制備固相抗 體。下文提到的間接雙夾心DELFIA包括例如將hTFPI-2夾在本發明固定的多克 隆抗體和單克隆抗體之間，然后加入銪標記的羊抗鼠抗體及增強液，從而檢測了標本中的 hTFPI-2。對于下文提到的銪標記抗體的制備，其方法可以是一步標記法，即螯合劑DTTA先 螯合銪，再連接抗體。也可以是二步標記法，即螯合劑DTTA先連接抗體再螯合銪。對于上述螯合劑，提到例如DTTA、EDTA、DPTA。在將這些螯合劑與銪或抗體結合過 程中，可使用一步標記法或二步標記法。對于上述標記劑，提到鑭系稀土元素，例如銪(Eu3+)、釤(Sm3+)、鋱(Tb3+)。對于用 于該場合的螯合劑，可選擇適合該場合所用的螯合劑，例如上述的DTTA、EDTA、DPTA。上述提到的增強液，其主要成分是β - 二酮體螯合劑(2-ΝΤΑ)。在本發明的檢測試劑盒中，本發明的單克隆抗體可以作為一抗，然后加標記的抗 抗體，還可以用上述標記劑標記。本發明的檢測試劑盒的固相不受特別限制，但包括例如聚合物，如聚苯乙烯、玻璃 珠、微量滴定板或其他不溶性載體。本發明的檢測試劑盒還可含有其他組件。上述其他組件不受特別限制，但包括例如標記用的稀土元素、增強液、緩沖液，以 及上述提到的成分。雖然本發明的檢測試劑盒的形式不受限制，但含有本發明的檢測試劑盒的所有組 分的整合型檢測試劑盒是優選的，能快速、簡單和方便的進行檢測。上述整合型檢測試劑盒不受特別限制，但可以是盒型、芯型等。本發明的檢測試劑盒可以用于判斷腫瘤的惡性程度，動脈粥樣硬化的病情評估以 及妊娠高血壓綜合征患者胎盤功能的評估。因為本發明的檢測試劑盒使用單克隆抗體，具有高水平的檢測靈敏度，不產生假 陰性或假陽性問題，在批與批之間沒有任何差異。根據本發明，用單克隆抗體識別hTFPI-2作為抗原，可消除存在于樣品中的其他 物質的影響，從而可以非常高的靈敏度和特異性檢測hTFPI-2。由于已建立了產生針對hTFPI-2的單克隆抗體的雜交瘤，現在可以幾乎半永久性的產生同一單克隆抗體。使用本 發明的單克隆抗體的檢測試劑盒可用血清或血漿作為標本，因此可簡單方便有效的檢測 hTFPI-2，而不對病人造成痛苦。上述檢測試劑盒易于進行測定，對于醫藥護理的部門是非 常有用的。實施本發明的最佳模式下面實施例和測試實施例更詳細地說明本發明。然而它們不是為了限制本發明的 范圍。實施例1[單克隆抗體的制備](1) hTFPI-2表達(制備免疫原)I.胎盤總RNA的提取采用TRIzoI試劑盒，提取人足月妊娠的胎盤組織總RNA。II. hTFPI-2基因片斷的獲得以人胎盤總RNA為模板進行逆轉錄獲得cDNA單鏈 為模板用引物1和引物2進行PCR獲得hTFPI-2基因片斷。引物1 :5，-TACCCTCGAGGATGC TGCTCAGGAGCCAAC-3，，引物 2 :5，-GCTAGCTCAGCTTAAAATTGCTTCTTCCGAATTTTC—3’ ；兩條分 別引入XHo I和Bpul 102 I的酶切位點(下劃線部分)。反應條件-MV 4min,94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin，8 個循環，94°C 30s, 57°C 30s, 72°C lmin，22 個循環，72°C 7min。lOg/L 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR。III.目的片斷與pET19b重組RT_PCR產物經酚、氯仿純化后與載體pET19b同時 被XHo I和Bpull02 I的酶切后，經10g/L瓊脂糖凝膠電泳回收，然后用T4DNA連接酶連接 目的片斷與載體，轉化DH5a感受態細胞，挑取陽性克隆命名為rpET19b-TFPI-2，并測序分 析其序列。IV. hTFPI-2在大腸桿菌中的表達重組質粒rpET19b_TFPI_2轉化大腸桿菌表達 宿主BL21，涂于LBA平板，挑取單個克隆，接種至5mlLBA培養基中，37°C 250r/min搖至吸光 度(A600)為0. 8-1. 0，加入終濃度為lmmol/L的異丙基-β _D_硫代半乳糖苷(IPTG)誘導 3小時，8000r/min離心收集菌體，用PBS重懸菌體后，采用超聲法破碎菌體，10，OOOr/min離 心20min分離上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析。V.大規模發酵挑取表達量最高的克隆接種至5ml LBA培養基中，37°C 250r/min 4-5h，l 100稀釋至500ml LBA培養基中，37 °C 250r/min搖至A600為2時，接種于25L LBA培養基發酵罐中，培養至A600為1.0，加入終濃度為lmmol/L的IPTG誘導3h后下罐， 此時A600為2. 7，離心收集菌體。用20mmol/LTriS-HCL pH7. 4緩沖液洗凈菌體殘存的培養 基。菌體按質量體積比1 20重懸于20mmol/L Tris-HCL pH7. 4緩沖液中，高壓勻漿機加 壓破菌，壓力維持在60Mpa，每次5min，共三次，其間注意不要使溫度過高。勻漿后SOOOr/ min離心30min分離上清和沉淀。VI.包涵體純化收集的包涵體用含0. 5% TritonX-100、2mol/L尿素、20mmol/ L Tr i s-HCL (pH7. 4)緩沖液洗滌3次。每克包涵體用80ml 7. 5mol/L尿素、20mmol/L Tris-HCL (pH7. 4)緩沖液溶解，每50ml溶解液加入Ig亞硫酸鈉，攪拌30min，再加入0. 5g 連二硫酸鈉，4°C攪拌過夜。第二天，8000r/min離心30min，0. 45 μ m的濾膜過濾后取上清。 透析后的包涵體溶解液用陰離子柱Q-S印harose FF連接Pr印lc4000純化系統進行純化。 用 6mol/L 尿素、0. 15mol/NaCL 0.01%布里吉(Bri j) 35、20mmol/L Tris-HCL (pH8. 0)緩沖液作平衡液。以2ml/min的速度上樣，NaCL進行濃度梯度洗脫，收集洗脫峰進行SDS-PAGE 分析。純化后的包涵體溶液在截留相對分子質量為IOXlO3的透析膜中對0. 15mol/ NaCLU5mmol/L Tris-HCL(pH7. 4)緩沖液透析。測蛋白濃度，每克包涵體可獲取大約 600mghTFPI-2。將蛋白溶液凍干，分裝于-80°C保存。⑵免疫Balb/c小鼠取6周齡雌性Balb/c小鼠，乙醚麻醉后按無菌操作規程打開腹腔暴露脾臟，將(1) 生產的hTFPI-2免疫原20ug，沿脾臟長徑方向注入。逐層縫合皮下組織及皮膚。(3)細胞融合免疫Balb/c小鼠4天后，常規方法取出小鼠脾臟用100目不銹鋼網過濾分離收 集脾細胞，鏡下計數，取1 X IO8個脾細胞與5X IO7個SP2/0制成混懸液，1000g/min離心 lOmin，棄上清，加入Iml 37°C預熱的50% PEG進行細胞融合，補加1640-HAT培養液，置 370C 5% CO2培養箱中培養。2周后改用1640-HT培養液，3周后用1640-20%小牛血清培
養液培養.(3)陽性雜交瘤細胞篩選與克隆化培養用培養液將細胞懸混液稀釋成每毫升分別含5、10、50個細胞的懸液，加入96孔培 養板中，每孔IOOul，使相應每孔分別含有0. 5，1和5個細胞，置37°C 5% CO2培養箱中培養。 選擇效價高，成單個細胞克隆生長的細胞.按上述步驟繼續克隆三次.最后取穩定分泌抗 hTFPI-2單克隆抗體的雜交瘤細胞移入六孔板中培養，然后再轉入細胞培養瓶中培養。通過 以上操作，最終確立3個雜交瘤克隆能夠產生各種能作為腹水回收的單克隆抗體。分別命 名為hTFPI-22C8、hTFPI-2A、hTFPI_2B，以下分別稱單克隆抗體2C8、單克隆抗體A、單克隆 抗體B。(5)單克隆抗體的生產取Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷0. 5ml/只，2周后每只小鼠腹腔注射1 X IO6個雜 交瘤細胞，1周后小鼠腹部明顯脹大，用無菌注射器抽取腹水。3000g/min離心10分鐘。吸 上清，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌。(6)rprotein-A 親和層析柱純化 2C8待純化的腹水用20mmol/L PB (pH 7. 0)液稀釋3倍，50 %硫酸銨沉淀，離心去上 清，PBS液溶解沉淀，對PBS (pH7. 4)緩沖液透析。以0. 5ml/min的流速上柱.完畢后用 20mmol/L PB (pH 7. 0)液充分洗柱，直至無蛋白流出.然后用0. Imol甘氨酸/0. 5mol (pH 3.0)的緩沖液洗脫并收集洗脫峰，迅速加入lmol/L Tris-HCL (pH 8.8)緩沖液中調至pH至 7.5。對50mM Tris/0. 5M NaCL, pH 7. 5透析液透析過夜。濃縮單克隆抗體至濃度400ug/ ml，分裝成每管200ul，-80°C保存。hTFPI-2單克隆抗體純化洗脫峰如圖1 (7)單克隆抗體的全面鑒定I .抗體純度鑒定采用SDS-PAGE電泳，所用濃縮膠和分離膠濃度分別是5%和12%，考馬斯亮藍染 色，如圖2A、B II .抗體效價測定ELISA測定純化的單克隆抗體的效價。包被液(50mmol/L，pH 9. 6的Na2C03-NaHC03緩沖液)包被hTFPI_25ug/ml于96孔板，IOOul/孔，4 °C過夜。洗滌液 (0. 05mol/L, ρΗ7· 4 的 PBS-0. 05%土溫 20)洗板三次。加入封閉液(2% BSA-PBS) 200ul/ 孔，37°C2小時。分別加入不同稀釋度的單克隆抗體2C8、A、B，100ul/孔，37°C 1小時。洗 滌液洗板三次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgGa，100ul/孔，37°C 1小時。洗滌液洗 板三次，加入顯色液(臨用前于IOml ο. lmol/L檸檬酸緩沖液中加入5mg鄰苯二胺及30% H2025ul)，顯色10分鐘。加入終止液(20%硫酸)50ul/孔。492nm處測吸光度。測得單克 隆抗體2C8、A、B效價如表1 表1抗hTFPI-2單克隆抗體效價 III.抗hTFPI-2單克隆抗體2C8、A、B特異性鑒定運用ELISA法，將hTFPI_2、hTF、 hTFPI各5ug/ml分別包被96孔酶標板，分別加入單克隆抗體2C8、A、B，然后加入酶標二抗。 結果表明抗hTFPI-2單克隆抗體2C8、A、B只與hTFPI-2有反應，而與hTF、hTFPI均無結合。IV抗hTFPI-2單克隆抗體亞類鑒定依據鼠單抗IgG亞類檢測試劑盒說明書操作，測定結果為單克隆抗體2C8、A、B皆 為IgGl，輕鏈為λ型。V雜交瘤細胞的染色體分析雜交瘤細胞傳代培養48h后加秋水仙胺，使其終濃度為0. 04ug/ml，繼續培養2h后 將細胞移入離心管，1000r/min離心lOmin。棄上清，加入37°C預溫的0. 075mol/L KCL低滲 液5ml固定液，用吸管吹勻沉淀，置37°C水浴15min。加入固定液(甲醇乙酸=3 1) Iml 混勻，離心后棄上清，再加固定液5ml，混勻后靜止30min。離心后棄上清，再加固定液5ml， 重復上一步，然后加固定液5ml混勻，封上管口 4°C過夜。棄上清，混勻細胞沉淀，吸2-3滴 細胞懸液于潔凈載玻片上，自然干燥。以10% Giemsa染液染色lOmin，洗去染液自然干燥， 每個標本計數100個完整的中期核，鏡檢計數。結果染色體數目為98。證實得到的細胞 株是小鼠脾細胞與SP2/0細胞的雜交瘤細胞。結果如圖4所示。VI抗hTFPI-2單克隆抗體對hTFPI-2親和力的測定純化的2C8單克隆抗體用0. 15mol/L PBS pH 7. 4稀釋至1. 4X 107mol/L，與等體積 的 hTFPI-2 (1. 4X107mol/L)混勻，4°C置 18h，取上述混合液 IOOul 至包被有 hTFPI_2(5ug/ ml)的96孔板中，進行ELISA測定。分別測定hTFPI-2存在時的單克隆抗體ELISAA值和 hTFPI-2不存在時單克隆抗體ELISAA值(Atl)，按下述公式計算解離常數(K)，親和常數為1/ K。A0/(A0-A) = l+K/a0(a0 抗原摩爾濃度)。表2抗hTFPI-2單克隆抗體親和力測定
9 W抗hTFPI-2單克隆抗體相對分子質量的測定參見圖2A、B。實施例2[多克隆抗體制備]I初次免疫取lmghTFPI-2抗原溶于1.5mlPBS中，0. 2μπι濾過膜除菌，加入等 量的福氏完全佐劑。震蕩乳化，于雄性新西蘭白兔兔背部皮內注射10個點，每個點0.2ml。II加強免疫2周后進行第一次加強，用量為0.4mg，溶于0.8mlPBS中，0. 22μπι 膜過濾除菌，加入等量福氏非完全佐劑振蕩乳化。皮下注射。以后每隔十天加強一次，共加 強四次。III第五次免疫后七天試血瓊脂糖雙向擴散試驗測定抗體效價達1 32。IV頸動脈放血①家兔仰臥固定，頭部略放低以暴露頸部，剃毛及消毒皮膚。②沿頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側的胸鎖乳突 肌。③分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區疏松組織，暴露出頸總動脈后使之游離。④于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠心及近心端。結扎遠心端的絲線。近心 端的動脈用血管夾夾住；⑤用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心 端的絲線結扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；⑥松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80 100ml。V收集血液待血液凝固血塊收縮后，用毛細滴管吸取血清。于3000rpm離心15 分鐘，取上清加入防腐劑(最終濃度為0. 01%硫柳汞或0. 02%疊氮鈉)，0. 5ml每管分裝后 置-80°C冰箱中保存備用。VI多克隆抗體的純化①于抗血清中加入等量生理鹽水，以50%硫酸銨沉淀，離 心去上清，生理鹽水溶解沉淀。②rprotein-A親和層析柱純化抗hTFPI_2多克隆抗體，步驟同單克隆抗體純化。W hTFPI-2 多克隆抗體的鑒定Western_Blot。VDI rprotein-A親和層析柱純化抗hTFPI-2多克隆抗體洗脫峰如圖5 實施例3[銪標抗抗體制備]取純化好的單克隆抗體配成lmg/ml的溶液。加入Eu3+-DTTA螯合物300ug。用 0. 25mol/L NaOH 調至 pH9. 5，置 4°C反應過夜。通過 S印hacryl S-200 凝膠柱(1. OX 42cm) 層析分離 Eu3+ 標記抗體，用 50mmol/L、ρΗ7· 75/Tris-HCL 緩沖液(含 0· 9% NaCL R0. 05% NaN3)洗脫，收集含有Eu3+標記的單克隆抗體的組分。經0D280nm測定，收集含蛋白的洗 脫液，同時取樣加熒光增強液測定Eu3+含量。計算標記率(Eu3+AgG = Eu3+(umol/L)/蛋白(umol/L)，為10.0。合并峰管，每ml結合物加ImgBSA.放-80°C保存備用。洗脫峰如圖6 所示。 實施例4[間接雙夾心DELFIA的建立]I 固相抗體的制備將包被緩沖液(50mmol/L、pH 9. 6的Na2C03_NaHC03緩沖 液)稀釋兔抗TFPI-2多抗至5ug/ml，加入96孔板，IOOul/孔，室溫孵育16小時.倒去包 被液，洗滌液(50mmol/L，ρΗ7· 75Tris_HCL緩沖液，內含0. 5% tween-20)洗兩遍，扣干，加 入封閉液(5% BSA)200ul,37°C 2小時，洗滌液洗三遍，扣干。II參考標準品的制備用稀釋液(50mmol/L，pH7. 75Tris_HCL緩沖液，內含0. 9% NaCl,0. 2% BSA,0. 05% tween-20 和 20umol 的 EDTA)將 hTFPI-2 抗原標準品配制成 0、1、 5、10、20ng/ml的標準溶液；于96孔板分別加入不同濃度的標準品lOOul，室溫震蕩孵育90
分鐘；洗滌液洗三遍。III加一抗單克隆抗體2C8400ng/ml，IOOul/孔，室溫震蕩孵育90分鐘；洗滌液
洗三遍。IV加二抗Eu標記羊抗鼠IgG 400ng/ml, IOOul/孔，室溫震蕩孵育90分鐘；洗滌
液洗六遍。V檢測每孔加入增強液lOOul，避光震蕩10分鐘后在Victor 1420熒光分析儀 上檢測(激發波長337nm，測定波長614nm)。VI線性范圍及靈敏度hTFPI-2標準曲線線性測量范圍為l-20ng/ml.以零參考 標準品A測定值(η = 12)均值減去兩倍標準差代入標準曲線方程求得靈敏度為0. 4ng/mlW hTFPI-2標準曲線如表3，如圖7所示。表3DELFIA of hTFPI-2hTFPI-2 濃度 0151020(ng/ml)Eu 讀數0 8456 45033 95156 187837實施例5[用間接雙夾心DELFIA檢測正常妊娠女性及妊高征患者血液標本中hTFPI-2]于固相包被板上分別加正常妊娠女性及妊高征患者血液標本，IOOul/孔，其余基 本程序同實施例4。測得血液hTFPI-2水平如表四表四DELFIA檢測正常妊娠女性及妊高征患者血液標本中hTFPI-2 實施例6[采用免疫印跡的方法檢測人奇靜脈內皮細胞(HUVEC)hTFPI-2]I 將裂解液 A(50mmol/L Tri s，2% SDS，ρΗ6· 8)裂解 HUVEC。II SDS-PAGE電泳按79 20 1的比例分別加入將裂解液A、B (0. 1 %溴酚藍， 10%甘油)、C(10mol/LDTT)，上樣。III轉膜100v，2小時，將PVDF膜麗春紅染色可見蛋白質條帶。IV封閉用TTBS稀釋1 %脫脂奶粉，PVDF膜4 °C封閉過夜。V洗膜TTBS洗膜三次，每次10分鐘。VI加一抗單克隆抗體2C8，封閉液稀釋至1 500，室溫孵育2小時。洗膜同上。W加二抗辣根過氧化酶標記羊抗鼠IgG，1 2000,室溫孵育2小時。洗膜三次， 每次20分鐘。VDI發光發光試劑按1 1配成，發光約5分鐘。IX暗室曝光30秒，顯影，定影。X結果如圖8所示。實施例7[采用免疫組織化學的方法檢測乳腺癌細胞hTFPI-2]I組織標本制備乳腺癌組織標本經10 %甲醛固定24_48h，PBS洗4h，3系列乙醇脫水，二甲苯透明， 浸蠟，包埋。4 μ m石蠟切片，貼在涂有切片粘合劑的干凈載玻片上，58°C烤18小時。II操作流程1常規脫蠟后，二甲苯I 10分鐘，二甲苯II 10分鐘，二甲苯III 10分鐘，95%乙醇2
分鐘后，浸泡入另一 95%乙醇2分鐘，水洗3分鐘。2.切片入0. 3% H2O2-甲醇溶液，37°C，30分鐘，消除組織內源性過氧化物酶活性。3.切片經蒸餾水洗8-10分鐘，入0. 胰蛋白酶消化液，37°C，30分鐘。4.切片經蒸餾水洗8-10分鐘，0. 01mol/l PH7. 4PBS洗3次，每次5min。5.抗原修復洗2次，每次lOmin，自然冷卻至室溫，將切片置于0. Olmol/1 CB (檸 檬酸緩沖液PH6. 0)，中，微波III檔(980C ) 20min。6. PBS 洗 3 次，每次 5min。7.擦去組織周圍PBS，滴加1 20馬抗鼠血清，置切片于濕盒內，37°C，20分鐘。8.傾去正常馬抗鼠血清，滴加一抗(單克隆抗體2C8 1 400)，lOOul，37°C，60分鐘。4°c，過夜。9. PBS 洗 3 次，每次 5min。10.加二抗(羊抗鼠化6)，371，401^11，？85洗3次，每次5111士11。11. 0. 04% DAB+0. 03% H2O2 顯色 8min12.水洗，蘇木素襯染30s，水洗，鹽酸乙醇藍化2S，水洗，微波藍化，常規樹脂封片。13.切片鏡下觀察陽性為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀，背景呈紫藍色14.結果如圖9所示。
權利要求
一種單克隆抗體，其特征在于，通過基因克隆表達的hTFPI-2免疫小鼠，制備雜交瘤細胞，所獲單克隆抗體能夠運用于解離增強鑭系元素時間分辨熒光免疫分析(以下簡稱DELFIA)從而測定hTFPI-2。
2.如權利要求1所述的雜交瘤，其特征在于，該雜交瘤是hTFPI-22C8、hTFPI-2A、 hTFPI-2B。
3.如權利要求1所述DELFIA，其特征在于，該項免疫學測定法能夠運用于hTFPI-2水 平的監測。
4.如權利要求3所述的hTFPI-2監測，其特征在于，運用了雜交瘤hTFPI-22C8產生的 針對hTFPI-2的單克隆抗體。
5.一種多克隆抗體，其特征在于針對hTFPI-2。
6.如權利要求5所述多克隆抗體，其特征在于能夠與上述的單克隆抗體組合運用于 DELFIA,從而測定 hTFPI-2。
全文摘要
本發明涉及一種人組織因子途徑抑制物-2(hTFPI-2)的單克隆抗體，產生所述單克隆抗體的雜交瘤克隆，單克隆抗體的制備方法，以及所述單克隆抗體的用途，用途包括解離增強鑭系元素時間分辨熒光免疫分析(DELFIA)、免疫印跡、免疫組化。本發明還涉及一種hTFPI-2多克隆抗體，以及所述多克隆抗體在DELFIA中的應用。
文檔編號G01N21/64GK101885771SQ20091005118
公開日2010年11月17日 申請日期2009年5月14日 優先權日2009年5月14日
發明者蔣芳林 申請人:蔣芳林