一種檢測囊型包蟲病的免疫層析試條及其制備方法

專利名稱：一種檢測囊型包蟲病的免疫層析試條及其制備方法
技術領域：
本發明涉及寄生蟲疾病檢測領域，尤其涉及囊型包蟲病的檢測試條及其制備方 法。
背景技術：
M-^t^M (echinococcosis)(Hydatid disease Hydatidosis), 是由棘球屬絳蟲的幼蟲寄生于人、畜體內引起的一種人畜共患寄生蟲病，能感染人類 的棘球屬絳蟲有4種細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球絳蟲 (Echinococcus multilocularis, Em)、少節棘球緣蟲(E. oligarthrus)禾口伏氏棘球會條蟲 (E. vogeli)。這4種棘球絳蟲的成蟲和幼蟲期形態不同，可引起不同類型的棘球蚴病。我 國有兩種棘球蚴病即細粒棘球蚴病(cystic echinococ-cosis，CE)又稱囊型包蟲病，和多 MMW-M'-M (alveolar echinococcosis, AE) 31 禾爾ifeM^S^^；^!。包蟲病是一個重要的世界性公共衛生問題，廣泛流行于歐、亞、非和地中海區域沿 岸國家，以及澳洲和南美。在我國包蟲病主要流行于西部的農牧區，其中新疆、青海、甘肅、 寧夏、西藏、內蒙和四川西部最為嚴重，是世界上包蟲病患病率最高的地區。此外，吉林、陜 西、云南、貴州和河南等省局部地區也有小范圍流行。包蟲病流行區受威脅人口約7000萬。 新近完成的全國寄生蟲病調查結果表明流行區人群包蟲病的患病率平均為1.084%。據此 推算，目前流行區約有病人38萬人。由于B超診斷結果有一定的漏檢率，實際患病病人數 可能達60萬人以上。血清學檢查發現人群的感染率平均為11. 98%，感染人數約為700萬 人。在四川甘孜洲普查人群5414人，查出感染者1624人，感染率達30. 5% ；包蟲病患者709 人，患病率為13. 1%。包蟲病需要手術或長期服藥治療，其中泡型包蟲病被稱為“蟲癌”，10-15年的病死 率高達90%以上。漏診的包蟲病患者失去治療時機而危及生命。包蟲病不但給患者帶來極 大的痛苦和沉重的經濟負擔，且發病的高峰為20-50歲的青壯年，給社會帶來極大的壓力， 系西部農牧區群眾因病致貧，因病返貧的重要原因。此外，由于包蟲病在牛羊的感染率相當 高(可達90%)，每年因包蟲病也給我國畜產品造成的經濟損失達數十億。因此包蟲病不 但嚴重危害人民的生命健康，而且嚴重影響社會和經濟發展、邊疆穩定。我國政府對包蟲病嚴重威脅我國西部人民健康的問題密切關注，已在四川設立了 中央支持地方包蟲病防治項目。在政府的重視下，包蟲病的防治工作將全面開展，為滿足包 蟲病診斷和現場流行病學調查的需要，研制合適的包蟲病檢測方法是當務之急。目前對包蟲病的診斷極大地依賴影像學方法，如X光檢查、B型超聲診斷、CT掃描、 核磁共振等物理診斷方法。雖然影像學技術已廣泛應用，且能對包塊損害的部位、大小和物 理性狀等做出較為明確的判斷，但不能進行早期診斷(影像學診斷出的包蟲病人已不太適 合藥物治療)，且對有些囊腫、膿腫或腫塊不能進行有效鑒別而誤診。由于影像檢查設備攜 帶不便，加之昂貴，且對操作人員的技術要求較高，在疾病診斷與流行病學調查中(特別在 邊遠地區連電力供應都受到限制)的應用受到限制。
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免疫學方法在包蟲病診斷上的應用越來越受到重視，最有效的免疫學診斷方法 是應用純化天然抗原或重組抗原檢測包蟲病人特異抗體，常用檢測方法有間接血凝法 (Indirect haemagglutination assay ；IHA)、酶聯免疫吸附法(ELISA)、酶聯免疫電轉移印 漬法(Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay ;EITBA),以及金標免疫點印漬 法(Gold-labelled dot blotting ；⑶B ；俗稱膜法或滲濾法)。但這些方法或費時費力、或 需要冷鏈系統保存試劑、或對儀器設備及操作人員的要求較高而不適合現場使用。

發明內容
本發明的目的之一是提供一組用于免疫學方法檢測囊型包蟲病的試劑，用于檢測 包蟲病以及病原體的種屬。本發明的另一目的是提供一種快速檢測囊型包蟲病以及病原體種屬的免疫層析 試條(Immuno-Chromatographic Aassay, ICA)。本發明的再一目的是提供一種快速檢測囊型包蟲病以及病原體種屬的免疫層析 試條的制備方法。本發明的第一方面，提供了一組用于免疫學方法檢測囊型包蟲病以及病原體種屬 的試劑，包括⑴囊型包蟲病的天然抗原，⑵抗人IgG的標記抗體；其中囊型包蟲病天然抗原按如下方法制備取新鮮羊肝包囊液，以3000r/min離 心20min，吸上清液入透析袋，用PBS溶液于4°C下透析過夜，將透析過夜的包囊液6000r/ min離心20min，取上清，棄沉淀，即制得囊性包蟲病天然抗原；其中抗人IgG的標記抗體是利用人IgG免疫鼠、兔、羊或者其他動物獲得的多抗或 單克隆抗體，所說的標記酶標計、膠體金標記或者其他標記。優選的，所說的標記抗體是鼠 抗人IgG的單克隆抗體。更優選的，所說的標記抗體是鼠抗人IgG4的單克隆抗體。本發明的第二方面，提供了一種快速檢測囊型包蟲病以及病原體種屬的免疫層析 試條，包括樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有膠體金標記抗體的金標墊、與所述金標墊 緊密連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上遠離金 標墊的一端設置質控線，在質控線和金標墊之間的纖維素膜上設置檢測線；其中所述的檢測線由囊型包蟲病的天然抗原組成，所述的囊型包蟲病的天然抗原 為來源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液；所述的膠體金標記抗體為以人IgG為抗原免疫動物 獲得的抗體；所述的質控線由特異性結合膠體金標記抗體的抗抗體組成。在一個優選的方案中，所述標記抗體為以人IgG作為抗原免疫BALB/C小鼠獲得的 單克隆抗體，所述作為質控線的抗抗體為羊抗鼠抗體。在一個優選的方案中，羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白濃度為1 10mg/mL，噴涂 量為10 μ L/cm2 ；膠體金標記抗體濃度(以蛋白濃度計)1 5mg/15 20mL ；羊抗鼠抗抗 體溶液濃度為0. 1 5mg/mL，噴涂量為10 μ L/cm2。所述支持檢測線和質控線的纖維素膜可為硝酸纖維素膜(NC膜)或醋酸纖維素 膜；所屬支持膠體金標記抗體的金標墊為玻璃纖維膜或聚脂膜；所述樣品墊可以是濾血膜 樣品墊，所述的濾血膜是棉籽絨和纖維素的混合物或者玻璃纖維和纖維素的混合物，適合 于全血樣品；所述樣品墊也可以是玻璃纖維或吸水紙樣品墊，適合于血清樣品；所述吸水
5墊由吸水材料制備，如吸水紙。所述纖維素膜寬度控制在2. 5 3. Omm ；所述吸水墊可寬度為20 40mm，厚度為 0. 1 0. 2mm ；所述金標墊的寬度為5 IOmm ；所述樣品墊寬度為20 40mm。所述免疫層析試條背面可設置一個起支撐作用的背板，背板材料的選擇是多種多 樣的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板(PVC)等。可將所述帶有背板的免疫層析試條裝入一個盒體中，該盒體對應于濾血膜樣品墊 的部位設有檢測孔，對應于檢測線和質控線的部位設有觀測窗。檢測樣品時將全血或血清 加入檢測孔中。本發明的第三方面，提供了一種制備上述檢測囊型包蟲病的免疫層析試條的方 法，包括以下步驟(1)制備囊型包蟲病的天然抗原，將來源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白濃度 調整到1 lOmg/mL ；制備膠體金標記抗體，將1 5mg以人IgG為抗原免疫動物獲得的抗 體加入IOOmL膠體金溶液，離心取沉淀，復溶到15 20mL ；制備與膠體金標記抗體特異結 合的抗抗體，將溶液濃度調整到0. 1 5mg/mL ；(2)將囊型包蟲病的天然抗原溶液噴到所述纖維素膜上形成檢測線，將能與膠體 金標記抗體特異結合的抗抗體溶液噴到所述纖維素膜的另一區域形成質控線；將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標記抗體溶液，制備金標墊；(3)將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠離檢測線的一端，將金標墊粘貼在纖維素 膜的靠近檢測線的一端，將樣品墊粘貼于金標墊上與所述纖維素膜相對的一端，得到檢測 囊型包蟲病的免疫層析試條。在一個優選的方案中，上述纖維素膜在噴有檢測線、質控線后，先在37°C下干燥 0.5 2小時，再粘貼吸水墊。在一個優選的方案中，為使膠體金標記抗體溶液與玻璃纖維膜或聚脂膜更好地結 合，可向膠體金標記探針溶液中添加2% 10%的蔗糖；為使金標墊更易于纖維素膜粘貼， 可將金標墊在37°C下干燥0. 5小時，再與纖維素膜粘貼。本發明的免疫層析試條具有以下優點(1)敏感性及特異性高實驗室考核結果 顯示，本發明的免疫層析試條總的敏感性可達87. 16%，特異性為97%; (2)檢測方法簡單、 快速檢測過程中標本處理簡單，血清或全血都可以直接使用，無需處理，不需要專門儀器 和人員培訓，非專業技術人員按照說明書即可操作，并可迅速觀察結果，標本中的抗體經5 分鐘左右的紙層析后，即可出現肉眼可見的沉淀線，從而為包蟲病人的治療爭取了時間，很 適合現場和基層使用；(3)制備方法簡單，成本低廉，易于進行工業化生產。本發明將在包 蟲病的檢測及其相關疾病的診斷和治療中發揮重要作用，應用前景廣闊。


圖1、檢測囊型包蟲病的免疫層析試條的正面結構示意2、檢測囊型包蟲病的免疫層析試條的縱截面結構示意圖其中1為樣品墊2為金標墊3為纖維素膜4為吸水墊5為檢測線6為質控線7為背板
具體實施例方式樣品與抗棘球蚴抗體^ ^f (Hydatid disease Hydatidosis) X ^ # it ^J (echinococcosis) 病，是由棘球屬絳蟲的幼蟲寄生于人、畜體內引起的一種人畜共患寄生蟲病，能感染人類 的棘球屬絳蟲有4種細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus, Eg)、多房棘球絳蟲 (Echinococcus multilocularis, Em)、少節棘球緣蟲(E. oligarthrus)禾口伏氏棘球會條蟲 (E. vogeli)。這4種棘球絳蟲的成蟲和幼蟲期形態不同，可引起不同類型的棘球蚴病。包 蟲病患者體內血液中含有能特異性結合所感染的棘球蚴抗原的抗棘球蚴抗體，檢測受試者 體內血液中是否含有抗棘球蚴抗體，可作用受試者是否患有包蟲病的指標。本發明的的檢測包蟲病以及病原體種屬的免疫層析試條適用于從囊型包蟲病患 者體內抽取的全血樣品和血清樣品。對于全血樣品，本發明的檢測囊型包蟲病以及病原體 種屬的免疫層析試條中的樣品墊采用濾血膜樣品墊；對于血清樣品，本發明的檢測囊型包 蟲病以及病原體種屬的免疫層析試條中的樣品墊可采用玻璃纖維或吸水紙樣品墊。抗原與檢測線可以將棘球蚴抗原固定在纖維素膜等支持物上作為固相抗原，用以捕獲受試者者 血樣中的抗棘球蚴抗體。本發明的一個優選的方案中，將我國常見的細粒棘球蚴的天然抗 原(來源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液)固定在纖維膜上形成檢測線，該固相抗原可以捕 獲受試者血樣中相應的抗棘球蚴抗體，在檢測線位置形成抗原抗體復合物沉淀。膠體金標記抗體探針包蟲病患者體內血液中含有的抗棘球蚴抗體的優勢抗體類型為IgG抗體，優勢亞 類為IgGl、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4等亞類。膠體金標記抗體探針采用抗人IgG抗體或抗 人IgG4抗體制備，該抗人IgG抗體或抗人IgG4抗體可以是購買的商品化抗體，或按照常規 方法自行制備。本發明的一個優選的方案中采用膠體金標記的鼠抗人IgG4的單克隆抗體 作為檢測探針，該膠體金標記抗體附著于金標墊上。檢測過程中，復溶的膠體金標記抗體可 與受試者血樣中的人IgG4抗體結合，從而當受試者血樣中存在包蟲病特異性抗體時在檢 測線位置形成色帶。膠體金標記抗體不限于鼠抗人IgG4的單克隆抗體，也可采用鼠抗人IgG的單抗或 多抗，或者采用其他動物如兔抗人IgG抗體，同樣能實現本發明的發明目的，這是領域的一 般技術人員都知曉的。質控線可以將與膠體金標記抗體特異性結合的抗抗體固定在纖維素膜上作為質控線。在 本發明一個優選的方案中，膠體金標記抗體是鼠抗人IgG4的單克隆抗體，相應的，質控線 采用羊抗鼠的抗抗體。無論待檢樣品中是否含有抗棘球蚴抗體，本發明的檢測囊型包蟲病 以及病原體種屬的免疫層析試條中質控線位置總能形成色帶，該條色帶是判定檢測過程是 否正常和免疫層析試條是否變質的標準。質控線不限于羊抗鼠的抗抗體，只要能與選定的膠體金標記抗體特異性結合，同 樣能實現本發明的發明目的，這是領域的一般技術人員都知曉的。免疫層析試條
如圖所示，圖1為檢測囊型包蟲病的免疫層析試條的正面結構圖，圖2為檢測包蟲 病的免疫層析試條的縱截面結構圖。檢測囊型包蟲病的免疫層析試條由吸水墊4、硝酸纖維 素膜(NC膜)3、金標墊2和濾血樣品墊1四部分粘貼在PVC底板7上組成；硝酸纖維素膜3 上設有檢測線5和質控線6。檢測原理與結果判斷測定時將樣本血清或全血加在濾血膜樣品墊1上，1分鐘后滴一滴(約50 μ L)樣 本稀釋液，稀釋液帶動樣品按樣品墊1、金標墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4的方向移動，流 經金標墊2時使金標墊2上的膠體金標記抗體復溶，并帶動其向硝酸纖維素膜3、吸水墊4 移動。膠體金標記抗體(本發明實施例為鼠抗人抗體)可與樣品中的抗體或抗體亞類結 合，形成免疫復合物。此免疫復合物流至檢測線5時，若標本中有待測抗體或抗體亞類(抗 囊型包蟲病抗原的抗體)，即被檢測線5的特異性固相抗原所捕獲，在硝酸纖維素膜3上的 檢測線5位置顯出紅色檢測線條；此免疫復合物流經質控線6時，即被質控線6的固相抗體 (本發明實施例為羊抗鼠抗體)所捕獲，在硝酸纖維素膜3上的質控線6位置顯出紅色質控 線條。 陽性標本既顯示檢測線，又顯示質控線；陰性標本沒有檢測線，僅顯示質控線。以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法；所述百 分含量如無特別說明均為質量/體積百分含量或體積/體積百分含量。實施例1、包蟲病人血清對粗抗原的反應分析及優勢特異抗體亞類的分析1、針對囊型包蟲病的天然抗原的制備取新鮮羊肝包囊液，以3000r/min離心20min，吸上清液入透析袋，用PBS溶液于 4°C下透析過夜，將透析過夜的包囊液6000r/min離心20min，取上清，棄沉淀，即制得囊液 粗抗原，凍干后低溫儲存備用。2、方法以ELISA法進行分析，以囊液粗抗原為包被抗原分別與包蟲病人、非包蟲 病人和健康人血清進行反應，再以羊抗人IgGl抗體辣根過氧化物酶結合物(購自美國BD 公司)、鼠抗人IgE抗體辣根過氧化物酶結合物(購自美國BD公司)、鼠抗人IgG4抗體辣 根過氧化物酶結合物(購自美國BD公司)進行識別，在酶標儀上以490nm波長讀取OD值。 以20個非疫區健康人的酶標OD值均值加2個標準差(X+2SD)定為陽性閾值。3、結果如表1所示，用抗人IgG4抗體作為酶標二抗檢測包蟲病人血清的敏感性和 特異性都較好。表1包蟲病人血清對粗抗原的反應分析及優勢特異抗體亞類的分析結果
8 實施例2、檢測囊型包蟲病的免疫層析試條的制備1、針對囊型包蟲病的天然抗原的制備同實施例1。2、抗棘球蚴抗原的優勢特異抗體亞類的單克隆抗體的制備按常規方法用人IgG4抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠脾細胞與SP2/0瘤細胞融 合，融合成功能高效分泌特異抗體的雜交瘤細胞經3次克隆后注射小鼠生產腹水。采用常 規的飽和硫酸銨鹽析法對獲得的單克隆抗體進行純化，用免疫瓊脂擴散法檢測抗體效價， 結果抗體滴度均大于1 128，表明獲得的單克隆抗體具有較好的特異性和親和性。3、制備免疫膠體金探針及金標墊用下述方法制備鼠抗IgG4抗體標記的免疫膠體金探針及金標墊1)采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，具體方法為將HAuCl4 (滬試牌購于上 海國藥集團化學試劑有限公司)配制成0. 01 %水溶液，取IOOmL加熱至沸騰，攪動下準確加 入1. 6mL的的檸檬酸三鈉水溶液，待液體顏色穩定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液。2)確定膠體金偶聯抗體飽和濃度用0. 2M K2CO3調節步驟1)制備的膠體金溶液的pH值至9. 2，準備5支潔凈試管， 分別加入ImL膠體金溶液。將步驟1)制備的經純化的抗IgG4抗體稀釋為0. 5mg/mL,分別 向4支試管中加入20 μ L、25 μ L、30 μ L、35 μ L，另一支為空白對照，混勻后于室溫下放置5 分鐘，加入10% NaCl水溶液，混勻，靜置10-20分鐘后觀察液體顏色。膠體金溶液顏色不變 時所含最少抗體量即為穩定ImL膠體金溶液所需抗體的最適濃度，以此為基礎增加20%抗 體量即為膠體金偶聯抗體飽和溶液。結果維持膠體金溶液顏色不變的抗體量為25 μ L，即 偶聯抗體濃度為12.5yg/mL。3)鼠抗人IgG4抗體標記的免疫膠體金探針及金標墊的制備取50mL膠體金溶液，用0. 2M K2CO3調節pH值為8. 5 (8-8. 5均可)，按12. 5 μ g/mL 加入已純化的鼠抗IgG4抗體，得到含有濃度為12. 5 μ g/mL鼠抗人IgG4抗體的免疫膠體金 探針溶液50mL，攪拌1小時，再加入終濃度為0. 05% PEG20000，攪拌1小時，IOOOOrpm離心 30分鐘，棄上清，用20mM硼酸緩沖液洗滌沉淀，并將其保存于IOmL含5%蔗糖的20mM硼酸 緩沖液中，得到鼠抗人IgG4抗體標記的膠體金探針溶液。取5mL鼠抗人IgG4抗體標記的 膠體金探針溶液均勻加在玻璃纖維膜上，37°C下干燥0. 5小時，得到金標墊。4、檢測包蟲病的免疫層析試條的制備
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該試條的制備方法包括以下步驟1) NC膜的包被羊肝棘球蚴包囊液抗原包被用0. OlM pH7. 2PBS稀釋實施例1制備的棘球蚴包囊 液抗原至終濃度為2mg/mL，用于包被檢測線；質控抗體羊抗鼠IgG(購自捷寧生物公司)的包被用0. OlM pH7. 2PBS稀釋羊抗 鼠IgG至終濃度為0. 5mg/mL，用于包被質控線；BIODOT公司XZ1000噴膜機將分別噴于300mm長、25mm寬的硝酸纖維素膜(購自 MILLIP0RE公司)上，噴涂量為10 μ L/cm2，形成一條檢測線和一條質控線，37°C下干燥1小 時。2)檢測囊型包蟲病的免疫層析試條的制備用一塊單面涂了不干膠的PVC背板，中間粘貼上處理好的NC膜；NC膜靠近質控線 的一端緊密粘貼吸水墊(購于MILLIP0RE公司)；NC膜靠近質控線的一端緊密粘貼金標抗 體墊；金標抗體墊另一端緊密粘貼濾血膜樣品墊(購自WHATMAN公司)。得到檢測包蟲病 的免疫層析試條，可按所需大小進行切割，加干燥劑后密封保存。5、檢測囊型包蟲病的免疫層析試劑盒的制備為了方便使用，將步驟3制備的檢測包蟲病的免疫層析試條裝入試劑盒中，加干 燥劑后密封保存。該試劑盒對應于樣品墊的部位設有點樣孔，對應于檢測線和質控線的部 位設有觀測窗。實施例3、檢測囊型包蟲病的免疫層析試條的制備用購買自美國BD公司的鼠抗人IgG4單克隆抗體(貨號555881)制備膠體金標記 抗體作為檢測探針，其他步驟同實施例2。實施例4、檢測囊型包蟲病的免疫層析試條的實驗室考核1、檢測方法于實施例1制備的免疫層析試條的濾血膜樣品墊加入待測血清，1分鐘后加入樣 本稀釋液(PBS) 1滴(約50 μ L)，2分鐘后開始觀察結果，15分鐘觀察終止。結果判定如 果檢測線5和質控線6均出現紅色條帶，即判為囊型包蟲病，如果僅有質控線6出現紅色條 帶，即判為陰性。2、實驗結果用本發明實施例2制備的檢測囊型包蟲病的免疫層析試條進行實驗室考核結果 如表2所示。由表2可以看出本發明的免疫層析試紙的敏感性可達87. 16%，特異性可達 97%。上述檢測結果表明本發明的免疫層析試條可用于囊型包蟲病的快速檢測。表2本發明檢測囊型包蟲病的免疫層析試條的實驗室考核結果 用本發明實施例3制備的檢測囊型包蟲病的免疫層析試條進行實驗室考核，結果 與表2所示結果沒有統計學差異。實施例4、檢測包蟲病的免疫層析試條的濾血效果考核1、樣品制備取確診包蟲病人血清10份，正常人血清10份，正常人全血10份，確診囊型包蟲病 人全血5份。用部分正常人全血離心去除血清，加入同樣量的包蟲病人血清混合，成為包蟲 抗體陽性混合全血血樣。2、試驗方法按實施例3的方法檢測囊型包蟲病人血清10份，包蟲抗體陽性混合全血血樣10 份，正常人血清10份，正常人全血10份，確診囊型包蟲病人全血5份。其中檢測血清用量 20 μ L，檢測全血用量40 μ L。3、試驗結果全血檢測在規定時間內和血清檢測結果完全一致，包蟲抗體陽性混合全血血樣的 反應強度與加入的包蟲病人血清的反應強度完全一致。上述檢測結果表明本發明的免疫層 析試條可用于囊型包蟲病人全血血樣的快速檢測。本發明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發明各 個方面的單個例子，本發明范圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的 內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進，所 述改進也落入所附權利要求書的范圍之內。
權利要求
一種用于免疫學方法檢測囊型包蟲病的試劑，包括以下組分(1)囊型包蟲病的天然抗原；(2)抗人IgG的標記抗體；所述的囊型包蟲病天然抗原按如下方法制備取新鮮羊肝包囊液，以3000r/min離心20min，吸上清液入透析袋，用PBS溶液于4℃下透析過夜，將透析過夜的包囊液6000r/min離心20min，取上清，棄沉淀，即制得囊型包蟲病天然抗原；所述的抗人IgG的標記抗體是利用人IgG免疫鼠、兔、羊或者其他動物獲得的多抗或單克隆抗體，所說的標記包括酶標記、膠體金標記或者其他標記。
2.根據權利要求1的檢測包蟲病的試劑，其特征在于，其中所述的標記抗體是鼠抗人 IgG的單克隆抗體。
3.根據權利要求1的檢測囊型包蟲病的試劑，其特征在于，其中所述的標記抗體是鼠 抗人IgG4的單克隆抗體。
4.一種快速檢測囊型包蟲病的免疫層析試條，包括以下組分樣品墊、緊密連接于所述樣品墊的含有膠體金標記抗體的金標墊、與所述金標墊緊密 連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上遠離金標墊 的一端設置質控線，在質控線和金標墊之間的纖維素膜上設置一條檢測線；所述的檢測線由囊型包蟲病的天然抗原組成，所述的囊型包蟲病的天然抗原為來源于 羊肝棘球蚴包囊液的上清液；所述的膠體金標記抗體為以人IgG為抗原免疫動物獲得的抗 體；所述的質控線由特異性結合膠體金標記抗體的抗抗體組成。
5.根據權利要求4的檢測囊型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于，所述金標墊的膠 體金標記抗體為以人IgG作為抗原免疫小鼠獲得的單克隆抗體，所述質控線為羊抗鼠抗抗 體。
6.根據權利要求5的檢測囊型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于，羊肝棘球蚴包囊 液的上清液蛋白濃度為1 10mg/mL，噴涂量為10 μ L/cm2 ；膠體金標記抗體濃度以蛋白濃 度計為1 5mg/15 20mL ；羊抗鼠抗抗體溶液濃度為0. 1 5mg/mL，噴涂量為10 μ L/cm2。
7.根據權利要求4-6中的任一項的檢測囊型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于，所 述支持檢測線和質控線的纖維素膜選自硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；所述支持膠體金標 記抗體的金標墊選自玻璃纖維膜或聚脂膜；所述樣品墊選自濾血膜、玻璃纖維或吸水紙，其 中濾血膜是棉籽絨和纖維素的混合物或者玻璃纖維和纖維素混合物；所述吸水墊為吸水 紙。
8.根據權利要求7的檢測囊型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于，其中所述的纖維 素膜寬度為2. 5 3. Omm ；吸水墊寬度為20 40mm，厚度為0. 1 0. 2mm ；金標墊的寬度為 5 IOmm ；樣品墊寬度為20 40mm。
9.根據權利要求8的檢測囊型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于，所述免疫層析試 條背面設置一個起支撐作用的背板，背板材料為塑料。
10.根據權利要求9的檢測囊型包蟲病的免疫層析試條，其特征在于，將所述帶有背板 的免疫層析試條裝入一個盒體中，該盒體對應于樣品墊的部位設有檢測孔，對應于檢測線 和質控線的部位設有觀測窗。
11.根據權利要求4的檢測囊型包蟲病的免疫層析試條的制備方法，其特征在于，包括 以下步驟(1)制備囊型包蟲病的天然抗原，將來源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白濃度調整 至Ij 1 10mg/mL ；制備膠體金標記抗體，將1 5mg以人IgG為抗原免疫動物獲得的抗體加入IOOmL膠 體金溶液，離心取沉淀，復溶到15 20mL ；制備與膠體金標記抗體特異結合的抗抗體，將溶液濃度調整到0. 1 5mg/mL ；(2)將囊型包蟲病的天然抗原溶液噴涂到所述纖維素膜上形成檢測線，將能與膠體金 標記抗體特異結合的抗抗體溶液噴涂到所述纖維素膜的另一區域形成質控線；將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標記抗體溶液，制備金標墊；(3)將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠離檢測線的一端，將金標墊粘貼在纖維素膜的 靠近檢測線的一端，將樣品墊粘貼于金標墊上與所述纖維素膜相對的一端，得到檢測囊型 包蟲病的免疫層析試條。
12.根據權利要求11的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)制備囊型包蟲病的天然抗原，將來源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白濃度調整 至Ij 1 10mg/mL ；制備膠體金標記抗體，將1 5mg以人IgG為抗原免疫動物獲得的抗體加入IOOmL膠 體金溶液，離心取沉淀，復溶到15 20mL，加入蔗糖使蔗糖的終濃度為2% 10% ；制備與膠體金標記抗體特異結合的抗抗體，將溶液濃度調整到0. 1 5mg/mL ；(2)將囊型包蟲病的天然抗原溶液噴到所述纖維素膜上形成檢測線，將能與膠體金標 記抗體特異結合的抗抗體溶液噴到所述纖維素膜的另一區域形成質控線；將噴涂有檢測 線、質控線的纖維膜在37°C下干燥0. 5 2小時；將玻璃纖維膜或聚脂膜浸入膠體金標記抗體溶液，制備金標墊；將金標墊在37°C下干 燥0.5小時；(3)將吸水墊粘貼在所述纖維素膜的遠離檢測線的一端，將金標墊粘貼在纖維素膜的 靠近檢測線的一端，將樣品墊粘貼于金標墊上與所述纖維素膜相對的一端，得到檢測囊型 包蟲病的免疫層析試條。
全文摘要
本發明公開了一種檢測囊型包蟲病的免疫層析試條及其制備方法。該試條包括濾血膜樣品墊、緊密連接于所述濾血膜樣品墊的含有抗棘球蚴抗原優勢特異抗體亞類的抗體標記膠體金探針的金標墊、與所述金標墊緊密連接的纖維素膜和緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊；所述纖維素膜上設有一條檢測線和一條指控線；所述檢測線含有針對囊型包蟲病的粗抗原，所述質控線含有能與所述抗棘球蚴抗原優勢特異抗體亞類的抗體特異結合的抗抗體。本發明的免疫層析試條具有簡便性、敏感性、特異性和快速性的優點，適于臨床和現場使用。
文檔編號G01N33/577GK101881773SQ200910050688
公開日2010年11月10日 申請日期2009年5月6日 優先權日2009年5月6日
發明者朱慧慧, 楊玥濤, 汪俊云, 王立英, 石鋒, 高春花 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所