專利名稱：：一種高效液相色譜檢測血液中吡啶硫胺素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種高效液相色譜檢測血液中吡啶硫胺素的方法，屬于生物醫(yī)療
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)已經(jīng)成為最常見的神經(jīng)變性性疾病，給個人、家庭和社會產(chǎn)生嚴重的危害。迄今為止，晚發(fā)性(散發(fā)性)AD的發(fā)病機理仍然沒有得到完全解析，大量的研究形成了很多假說，也發(fā)現(xiàn)了一些被認為與AD發(fā)病相關(guān)的生物靶標，這些生物靶標雖然大多與p-淀粉樣蛋白(l3-amyloid，A0)和tau蛋白代謝有關(guān)，但并未能發(fā)展成特異性的診斷標志和有效的治療措施。目前臨床使用腦內(nèi)膽堿酯酶抑制劑(如石杉堿甲和多奈哌齊等)和非競爭性M1DA受體拮抗劑(美金剛)并不能阻止AD病情的進展。被認為最有前景的(i-淀粉樣蛋白疫苗治療盡管確實有清除腦內(nèi)p-淀粉樣蛋白斑的作用，但不能抑制癡呆癥狀的發(fā)展。所以不得不從更為廣泛的視角重新思考晚發(fā)性AD發(fā)病的可能病理機制及其防治策略。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者和動物模型腦細胞糖與能量代謝顯著降低、而且明顯早于臨床癥候和特征性病理損害的形成，糖代謝障礙已被認為是AD的獨立危險因素，部分學(xué)者甚至建議將AD歸類為III型糖尿病。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者，與腦細胞糖和能量代謝障礙有關(guān)的酶活性異常中，僅以硫胺素(維生素Bl)作為輔酶的a-酮戊二酸脫氫酶(a-ketoglutaratedehydrogenase,KGDH)、丙酉同酸脫氧酵(pyruvatedehydrogenase,PDH)禾口轉(zhuǎn)嗣醇醇(transketolase,TK)等活性下降最為明顯。由于KGDH、PDH和TK分別為機體葡萄糖代謝僅有的兩條通路——葡萄糖氧化脫羧一三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖代謝旁路的關(guān)鍵酶，其活性下降將嚴重損害細胞糖和能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)和細胞代謝必備物質(zhì)合成功能(如乙酰膽堿、乙酰輔酶A、NDAH、NADPH、5—磷酸核糖等)等，并導(dǎo)致氧化應(yīng)激等病理生理學(xué)變化。因此，引起以硫胺素為輔酶的蛋白酶機能性抑制導(dǎo)致細胞糖代謝組學(xué)異常和能量代謝障礙與AD的發(fā)生發(fā)展可能密切相關(guān)。AD患者體內(nèi)PDH、KGDH和TK酶活性下降顯然難以用這三個蛋白酶相關(guān)的基因同時變異等分子生物學(xué)機制來解釋。由于硫胺素是這三個酶的輔酶，而慢性硫胺素缺乏(如慢性酗酒)導(dǎo)致的病理學(xué)損害特征與AD驚人地相似如腦區(qū)選擇性神經(jīng)元丟失、海馬及其鄰近腦區(qū)tau蛋白異常磷酸化、Ae分泌增多和異常沉積等，硫胺素缺乏加重APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠易損腦區(qū)氧化應(yīng)激的同時，也顯著增加Ae沉積。因而，硫胺素缺乏或機能抑制才可能是AD患者PDH、KGDH和TK活性下降的真正原因。硫胺素缺乏在AD人群中是一個非常普遍的現(xiàn)象，而且?guī)缀跛辛虬匪卮x環(huán)節(jié)均出現(xiàn)異常不僅血和腦組織中游離硫胺素含量下降25%、單磷酸硫胺素下降33—45%、焦磷酸硫胺素下降28—40%，而且硫胺素單磷酸酶(下降31_64%)和硫胺素焦磷酸酶(下降28—62%)等活性也顯著下降。Gold等人的研究發(fā)現(xiàn)，血硫胺素水平降低與晚發(fā)性AD發(fā)病有關(guān)，而與帕金森病無關(guān)。這提示機體硫胺素缺乏與AD的關(guān)聯(lián)具有一定的特異性。但問題是(l)在并無飲食缺乏或限制的情況下，為什么這些患者體內(nèi)硫胺素會顯著缺乏？(2)除上述三個硫胺素作為輔酶的活性下降以外，為什么AD患者體內(nèi)幾乎所有硫胺素代謝環(huán)節(jié)均出現(xiàn)異常？(3)補充水溶性硫胺素為什么并不能阻止AD的發(fā)生和發(fā)展呢？上述問題顯然難以用單純的飲食缺乏硫胺素來解釋。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是確定一種用于阿爾茨海默病診斷和治療的有效耙標，提供一種檢測其在血液中含量的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)定AD患者體內(nèi)可能存在硫胺素拮抗性物質(zhì)抑制了機體硫胺素吸收和代謝功能。硫胺素拮抗性物質(zhì)競爭性地抑制了機體硫胺素吸收和代謝功能。由于硫胺素在體內(nèi)依靠硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白主動轉(zhuǎn)運，競爭結(jié)合力強的拮抗性物質(zhì)存在可能抑制機體對硫胺素的吸收和代謝，導(dǎo)致并無飲食缺乏或限制硫胺素的AD患者機體內(nèi)硫胺素代謝全面異常，即使補充超大劑量(如2克/日)結(jié)合力較弱的硫胺素也無法改變AD患者硫胺素缺乏的狀態(tài)。基于上述假設(shè)，本發(fā)明進行了探索性的預(yù)實驗研究并在AD患者血中發(fā)現(xiàn)了作用超強的硫胺素拮抗性物質(zhì)并確定其為吡啶硫胺素，其分子式C14H2。N40;分子量約為260，分子結(jié)構(gòu)如下:隨后，本發(fā)明又建立了重復(fù)性、靈敏性、精確性和特異性良好的高效液相色譜(HPLC)方法，在AD患者、帕金森病患者和健康對照人群中研究了此種硫胺素拮抗性物質(zhì)對于AD患者的特異性，結(jié)果表明約2/3AD患者血中存在高濃度的硫胺素拮抗性物質(zhì)，而帕金森病5患者和健康對照人群并未發(fā)現(xiàn)。此種硫胺素拮抗物的發(fā)現(xiàn)為重新認識AD體內(nèi)硫胺素機能低下導(dǎo)致細胞糖代謝和能量代謝障礙奠定了基礎(chǔ)，為AD的早期診斷、病理損害機制和防治研究指出了新的方向。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種高效液相色譜檢測血液中吡啶硫胺素的方法，其特征在于，具體步驟為第一步:將血液在-80。C保存;將鐵氰化鉀加入到150g/L氫氧化鈉溶液中配制0.25g/L鐵氰化鉀溶液；將吡啶硫胺素加入到O.IM鹽酸溶液中配制O.lmM吡啶硫胺素溶液，4'C避光冷藏，測定當日用重量濃度為20%的甲醇溶液稀釋配制吡啶硫胺素標準溶液，其濃度為Cs;將磷酸氫二鈉加入到重量濃度為1(F。的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸氫二鈉溶液；將磷酸二氫鈉加入到重量濃度為70%的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸二氫鈉溶液；第二步將第一步所得吡啶硫胺素溶液與鐵氰化鉀溶液以體積比25:3混合，以0.2um孔徑過濾膜過濾得到標準溶液，高效液相色譜檢測得到吡啶硫胺素的流出時間及其對應(yīng)的峰面積As，色譜條件為使用十八垸基硅烷鍵合硅膠色譜柱，分別以第一步所得磷酸氫二鈉溶液和磷酸二氫鈉溶液為第一流動相和第二流動相，以流速1.0raL/min梯度洗脫，熒光檢測激發(fā)波長為385nm、發(fā)射波長為460nm;第三步將血液樣本避光解凍后，預(yù)處理除去蛋白質(zhì)，以體積比25:3與第一步所得鐵氰化鉀溶液混合，以0.2um孔徑過濾膜過濾得到樣品溶液，采用與第二步相同的色譜條件檢測樣品溶液，得到與吡啶硫胺素的流出時間對應(yīng)的峰面積Ai，按下式計算血液中吡啶硫胺素的濃度Ci:Ci=Cs(Ai/As)。所述第二步中梯度洗脫流程為流出時間為Omin時全部為第一流動相，逐漸增加第二流動相的比例，流出時間為1.5min時第一流動相和第二流動相的體積比為7:1，流出時間為4min時第一流動相和第二流動相的體積比為1:1，流出時間為6min時全部為第二流動相。所述第三步中將血液預(yù)處理除去蛋白質(zhì)的具體步驟為在血液樣本中加入等體積的乙腈，振蕩15s，以轉(zhuǎn)速15000rpm離心15min，取上清液以轉(zhuǎn)速15000rpm再次離心15rain，取上清液常溫旋轉(zhuǎn)蒸干，用重量濃度為20%的甲醇溶液滴定至血液樣本相同體積。所述第三步中將血液預(yù)處理除去蛋白質(zhì)的具體步驟為在血液樣本中加入等體積的重量濃度為10%的三氯乙酸溶液，振蕩15s，以轉(zhuǎn)速13000rptn離心5min，取上清液以轉(zhuǎn)速13000rpm再次離心5min，取上清液加入水飽和甲基叔丁基醚洗滌，取下層溶液，重復(fù)洗滌一次，取下層溶液。本發(fā)明的優(yōu)點在于能夠通過簡單的方法檢測出血液中的吡啶硫胺素的含量。具體實施例方式下面結(jié)合實施例來具體說明本發(fā)明。實施例1一種高效液相色譜檢測血中吡啶硫胺素含量的方法第一步:將血液在-8(TC保存;將鐵氰化鉀加入到150g/L氫氧化鈉溶液中配制0.25g/L鐵氰化鉀溶液；將吡啶硫胺素加入到0.1M鹽酸溶液中配制0.lmM吡啶硫胺素溶液，4'C避光冷藏，測定當日用重量濃度為20%的甲醇溶液稀釋配制100nM吡啶硫胺素溶液，設(shè)其濃度為Cs;將磷酸氫二鈉加入到重量濃度為10%的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸氫二鈉溶液；將磷酸二氫鈉加入到重量濃度為7(F。的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸二氫鈉溶液；第二步將第一步所得吡啶硫胺素溶液與鐵氰化鉀溶液以體積比25:3混合，以0.2um孔徑過濾膜過濾得到標準溶液，采用高效液相色譜檢測得到吡啶硫胺素的流出時間為5.3min和峰面積As為59.979，其中，色譜條件為使用Kromasil(:18色譜柱((|)4.6X150咖，5ura,DikmaTechnologies),進樣量20uL，以第一步所得磷酸氫二鈉溶液和磷酸二氫鈉溶液分別為第一流動相和第二流動相，熒光檢測激發(fā)波長為385nm、發(fā)射波長為460nm，以流速1.0mL/min梯度洗脫，所述梯度洗脫流程為<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>第三步將血液樣本避光解凍后，在血液樣本中加入等體積的乙腈，振蕩15s，以轉(zhuǎn)速15000rpm離心15min，取上清液以轉(zhuǎn)速15000rpm再次離心15min，取上清液常溫旋轉(zhuǎn)蒸干，用重量濃度為20%的甲醇溶液滴定至血液樣本相同體積。以體積比25:3與第一步所得鐵氰化鉀溶液混合，以0.2um孔徑過濾膜過濾得到樣品溶液，采用與第二步相同的色譜條件檢測樣品溶液，得到與吡啶硫胺素的流出時間對應(yīng)的峰面積Ai為23.648，按下式計算血液中吡啶硫胺素的濃度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>實施例2另一種高效液相色譜檢測血液中吡啶硫胺素含量的方法第一步:將血液在-8(TC保存;將鐵氰化鉀加入到150g/L氫氧化鈉溶液中配制0.25g/L鐵氰化鉀溶液；將吡啶硫胺素加入到O.IM鹽酸溶液中配制O.lraM吡啶硫胺素溶液，4'C避光冷藏，測定當日用重量濃度為20%的甲醇溶液稀釋配制lOOnM吡啶硫胺素溶液，設(shè)其濃度為Cs;將磷酸氫二鈉加入到重量濃度為10%的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸氫二鈉溶液；將磷酸二氫鈉加入到重量濃度為70%的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸二氫鈉溶液；第二步將第一步所得吡啶硫胺素溶液與鐵氰化鉀溶液以體積比25:3混合，以0.2ura孔徑過濾膜過濾得到標準溶液，采用高效液相色譜檢測得到吡啶硫胺素的流出時間和峰面積As為24.778，其中，色譜條件為使用KromasilU色譜柱(小4.6X150mm，5um，DikmaTechnologies),進樣量20uL，以第一步所得磷酸氫二鈉溶液和磷酸二氫鈉溶液分別為第一流動相和第二流動相，熒光檢測激發(fā)波長為385nm、發(fā)射波長為460nm，以流速1.0mL/min梯度洗脫，所述梯度洗脫流程為<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第三步將血液樣本避光解凍后，在血液樣本中加入等體積的重量濃度為10%的三氯乙酸溶液，振蕩15s，以轉(zhuǎn)速13000rpm離心5min，取上清液以轉(zhuǎn)速13000rpm再次離心5min，取上清液加入水飽和甲基叔丁基醚洗滌，取下層溶液，重復(fù)洗滌一次，取下層溶液以體積比25:3與第一步所得鐵氰化鉀溶液混合，以0.2um孔徑過濾膜過濾得到樣品溶液，采用與第二步相同的色譜條件檢測樣品溶液，得到與吡啶硫胺素的流出時間對應(yīng)的峰面積Ai為9.347，按下式計算血液中吡徒硫胺素的濃度6i:Ci=Cs(Ai/As)二37.72nM權(quán)利要求1、一種高效液相色譜檢測血液中吡啶硫胺素的方法，其特征在于，具體步驟為第一步將血液在-80℃保存；將鐵氰化鉀加入到150g/L氫氧化鈉溶液中配制0.25g/L鐵氰化鉀溶液；將吡啶硫胺素加入到0.1M鹽酸溶液中配制0.1mM吡啶硫胺素溶液，4℃避光冷藏，測定當日用重量濃度為20％的甲醇溶液稀釋配制吡啶硫胺素標準溶液，其濃度為Cs；將磷酸氫二鈉加入到重量濃度為10％的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸氫二鈉溶液；將磷酸二氫鈉加入到重量濃度為70％的甲醇溶液中配制25mmol/L磷酸二氫鈉溶液；第二步將第一步所得吡啶硫胺素溶液與鐵氰化鉀溶液以體積比25∶3混合，以0.2um孔徑過濾膜過濾得到標準溶液，高效液相色譜檢測得到吡啶硫胺素的流出時間及其對應(yīng)的峰面積As，色譜條件為使用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，分別以第一步所得磷酸氫二鈉溶液和磷酸二氫鈉溶液為第一流動相和第二流動相，以流速1.0mL/min梯度洗脫，熒光檢測激發(fā)波長為385nm、發(fā)射波長為460nm；第三步將血液樣本避光解凍后，預(yù)處理除去蛋白質(zhì)，以體積比25∶3與第一步所得鐵氰化鉀溶液混合，以0.2um孔徑過濾膜過濾得到樣品溶液，采用與第二步相同的色譜條件檢測樣品溶液，得到與吡啶硫胺素的流出時間對應(yīng)的峰面積As，按下式計算血液中吡啶硫胺素的濃度CiCi＝Cs·(Ai/As)。2、如權(quán)利要求1所述的檢測血液中吡啶硫胺素的方法，其特征在于，所述第二步中梯度洗脫流程為流出時間為Omin時全部為第一流動相，逐漸增加第二流動相的比例，流出時間為1.5min時第一流動相和第二流動相的體積比為7:1，流出時間為4min時第一流動相和第二流動相的體積比為1:1，流出時間為6min時全部為第二流動相。3、如權(quán)利要求1所述的檢測血液中吡啶硫胺素的方法，其特征在于，所述第三步中將血液預(yù)處理除去蛋白質(zhì)的具體步驟為在血液樣本中加入等體積的乙腈，振蕩15s，以轉(zhuǎn)速15000rptn離心15min，取上清液以轉(zhuǎn)速15000rpm再次離心15min，取上清液常溫旋轉(zhuǎn)蒸干，用重量濃度為20%的甲醇溶液滴定至血液樣本相同體積。4、如權(quán)利要求1所述的檢測血液中吡啶硫胺素的方法，其特征在于，所述第三步中將血液預(yù)處理除去蛋白質(zhì)的具體步驟為在血液樣本中加入等體積的重量濃度為10%的三氯乙酸溶液，振蕩15s，以轉(zhuǎn)速B000rpm離心5min，取上清液以轉(zhuǎn)速13000rpm再次離心5min，取上清液加入水飽和甲基叔丁基醚洗滌，取下層溶液，重復(fù)洗滌一次，取下層溶液。全文摘要本發(fā)明提供了一種高效液相色譜檢測血液中吡啶硫胺素含量的方法，其特征在于，具體步驟為取全血除去蛋白質(zhì)后采用高效液相色譜檢測，其中，色譜條件為使用C<sub>18</sub>色譜柱，以第一步所得磷酸氫二鈉溶液和磷酸二氫鈉溶液分別為第一流動相和第二流動相，以流速1.0mL/min梯度洗脫，熒光檢測激發(fā)波長為385nm、發(fā)射波長為460nm。本發(fā)明的優(yōu)點在于能夠通過簡單的方法檢測出血液中吡啶硫胺素的含量。文檔編號G01N30/36GK101532992SQ200910049828公開日2009年9月16日申請日期2009年4月23日優(yōu)先權(quán)日2009年4月23日發(fā)明者費國強,鐘春玖申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院