專利名稱：：釩酸鹽氧化法檢測總膽紅素試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物試劑技術。具體涉及一種釩酸鹽氧化法檢測總膽紅素試劑盒。
背景技術：
：膽紅素(bilirubin)是血紅素的代謝產物，主要在肝臟內經結合作用轉化、排泄；它在血清中可以三種形式存在未結合膽紅素(BU，即游離膽紅素)、結合膽紅素(Be:單葡萄糖醛酸Bcm和雙葡萄糖醛酸膽紅素Bcc之和)以及膽紅素(白蛋白共價連接膽紅素)。膽紅素為一種有效的抗氧化劑，具有捕獲氧自由基的能力，能保護脂類和脂蛋白不被氧化。它與人體內其它抗氧化防御系統協同作用，與白蛋白結合后存在于心室的肌細胞部位，阻止該部位產生氧自由基，可調節心肌細胞的膽紅素抗氧化活性，保護心室肌細胞不受氧自由基的損害。因此，當膽紅素濃度降低時，冠心病的危險增加。膽紅素是臨床上判定黃疸的重要依據，也是肝功能的重要指標。如果膽紅素總量增高、間接膽紅素增高，就意味著可能有下列癥狀溶血性貧血，血型不合輸血，惡性疾病和新生兒黃疸等。如果直接與間接膽紅素均增高，可能有下列癥狀急性黃疸型肝炎，慢性活動性肝炎和肝硬變等。而膽紅素總量和直接膽紅素增高，則表明可能為肝內及肝外阻塞性黃疸，胰腺癌，毛細膽管型肝炎及其他膽汁瘀滯綜合癥。中毒性肝炎會導致膽紅素總量增高、直接與間接膽紅素均增高。正常血清總膽紅素濃度為1.717.1iimol/L，其中直接膽紅素低于3.4ymol/L。當總膽紅素達34iimol/L時，臨床上即可發現黃疸；如血清總膽紅素超過正常范圍，而肉眼看不出黃疸時，則稱為隱性黃疸，黃疸最常見于肝膽疾病，但其他系統疾病也可能出現。目前，總膽紅素測定的方法主要有重氮法、釩酸鹽氧化法和酶氧化法。重氮試劑法歷史最久，至今仍應用最廣。通常有J-G法和M-E法。前者是在膽紅素與重氮試劑反應后產生的重氮膽紅素使之在堿性條件下由紅色變成綠色。光譜的轉移增加了反應的靈敏度和特異性，在綠色環境中基本不干擾，但是這一改變增加了自動化的難度。因此采用該方法往往只能手工操作。M-E法是在重氮膽紅素生成后直接比色(紅色)，手續簡單，易于自動化是優點，但特異性差，溶血樣品的結果嚴重受擾。由于重氮法歷史悠久，醫學上有關膽紅素的各種論述均以此法為基礎。但是它存在缺陷其一是重氮試劑不穩定，它必須由亞硝酸鈉和氨基苯磺酸臨時生成，生成后最多只能用2天(一般6小時)；其二是重氮試劑與間膽和總膽的反應特異性不佳，在一定條件下測總膽，一部分間膽會參與反應，如果反應時間延長，參與的更多，導致測值的不準確，而且該方法的操作繁復、試劑不穩定、反應不專一。針對上述問題，人們作過無數的改良，但至今仍無滿意的結果。氧化酶法，特異性好，但是酶的穩定性較差，價格偏高，成本高，不可能大面積普及。化學氧化法，使用化學氧化法測膽紅素的淵源很早，70年代就采用鐵氰化鉀除滴定法測鈣時的膽紅素干擾，以后也曾有報道用鐵氰化鉀法測總膽。但也都停留在方法學的探討上，而沒有實際應用價值。1993年日本學者To-kuda發表釩酸鹽氧化法測血清中膽紅素。但該方法必須保證反應的專一性，還要防止氧化反應的早、中、晚期可能出現的干擾和副反應。這類化合物除釩酸和亞硝酸鈉外還有過苯甲酸鈉、過硫酸鈉、乙酸錳(ni)、硫酸銅、硫酸鐵等。從上述的比較來看，釩酸鹽氧化法測定膽紅素具有簡單、特異的特點。目前釩酸鹽氧化法測膽紅素技術雖然已能進入臨床應用.但還不完善，在總膽紅素的測量過程中存在偏釩酸難于溶解的問題，在溶液中呈膠體狀，使得試劑本底升高。特別是在酸性條件下溶解度會大大降低，偏釩酸根離子迅速析出，使溶液的本底升高，嚴重影響反應。如果降低濃度，會使反應不完全，測量結果降低！而升高試劑反應的pH值，會增加很多副反應，特別是抗壞血酸對試劑的干擾特別嚴重，嚴重影響檢測結果。但是，釩酸完全溶解需要較高的溫度，而自動生化儀上的溫度一般是4-8度，釩酸在此溫度下在一般的緩沖液中會立刻析出，導致檢測不能進行。
發明內容本發明所要解決的技術問題在于克服上述不足之處，提供一種促進釩酸完全溶解，提高試劑抗干擾性的釩酸鹽氧化法檢測總膽紅素的試劑盒。本發明基于下列原理(1)選用有效的物質來消除抗壞血酸干擾的反應。其中釩酸氧化的抗干擾劑為或TrionX-100(表面活性劑)；(2)增加增強釩酸的溶解，確保反應的完全。選用了碳酸鹽和乙醇胺。實驗表明復合物能明顯增強偏釩酸根的溶解性。本發明提供了一種釩酸鹽氧化法檢效2以3:1比例混合組成試劑1:緩沖液10-300mmol/LFeCl25-100踐ol/LTritonx-1000.01_40ml/L兩性表面活性劑0.l-40ml/L試劑2:總膽紅素試劑盒，該試劑盒由下列試劑1和碳酸鹽乙醇胺釩酸鹽NaCl10-300mmol/L10-300mmol/L0.5-10,1/L10-500mmol/L0.01-0.9g/L制備方法1先取兩個容器，每個容器加入為總量80%的去離子水；2.在容器一中依次加入緩沖物、FeCl2和Tritonx-100兩性表面活性劑；3.在容器二中依次加入碳酸鹽、乙醇胺、釩酸鹽、NaCl和疊氮鈉溶液進行充分的4.向每個容器再分別加入剩余的20%的水。本發明的試劑盒檢測效果如下(1)碳酸鹽和乙醇胺對釩酸鹽溶解的影響混合物對反應的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)抗干擾劑對反應的影響FeCl2去除抗壞血酸對反應的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述檢測結果表明本發明的試劑盒能很好的溶解釩酸鹽，能夠很好的去除抗壞血酸對總膽紅素的干擾作用。本發明的試劑盒通過加入復合物，解決了釩酸鹽低溫下難溶于水的難題，增加了釩酸的溶解度，反應過程中不會析出，在酸性條件下溶解度也不會降低，從而加速了總膽紅素的反應。加入了抗干擾物，提高了反應過程中抗壞血酸干擾反應的能力，使測試的結果與重氮鹽法有很好的臨床相關性，本發明的試劑盒有較好的臨床應用前景。圖1為用于臨床的相關比較。縱座標為重氮法，橫座標為釩酸鹽氧化法。具體實施例方式實施例11.先取兩個一升容器，每個容器加入0.8L的去離子水；2.容器一中加入試劑1的物質擰檬酸鈉29.4g、乳酸30g、FeC120.OOlg、Tritonx_1005ml、吐溫5ml疊氮鈉0.5g;3.容器二中加入試劑2的物質Na2C0320g、乙醇胺13.6g、偏釩酸銨0.5g、NaCl1.2g、疊氮鈉0.5g;4.溶液進行充分的攪拌5.最后在兩個容器中加入剩余的0.2L的水6.試劑在20度常溫下放置1天后放入4度冰箱里保存。在奧林巴斯400檢測儀器上檢測，其參數為兩點終點法，主波長450，副波長540，樣本量為10微升，試劑一為280微升，試劑二為70微升。本實例試劑盒作了臨床相關性比較取按本方法(釩酸氧化法)30例不同濃度的臨床樣本用3種方法平行進行檢測，結果如下3種方法試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>8910111213141516171819202122232425262759.38.542.147.383.132.148.642.145.432.145.213.264.649.037.8415.410.217.46.567.8720.48.5958,38.552.167.393.112.138.652.165.452.155.213.274.679.057.8215.210.317.66.587.8820.58.5653.18.922.247.103.292.198.292.015,262.175.293.584.398.257.6114.99.216.56.327.2220.97.327262.252.13305.795.765.26本方法與重氮法相比的臨床相關性R2=0.998，與氧化酶法的R2為0.999實施例2試劑11.先取兩個一升容器，每個容器加入0.8L的去離子水；2.容器一中加入試劑1的物質甘氨酸7.5g、鹽酸5ml、FeC12500.002、Tritonx_1005ml、吐溫5ml、疊氮鈉0.5g;3.容器二中加入試劑2的物質Na2C0318g、乙醇胺14g、偏釩酸銨0.5g、NaCl1.3g、疊氮鈉0.5g;4.溶液進行充分的攪拌5.最后在兩個容器中加入剩余的0.2L的水6.試劑在20度常溫下放置1天后放入4度冰箱里保存。實施例31.先取兩個一升容器，每個容器加入0.8L的去離子水；2.容器一中加入試劑1的物質鄰苯二甲酸15g、乳酸28g、FeC120.010g、Tritonx_1005ml、吐溫5ml、疊氮鈉0.5g;3.容器二中加入試劑2的物質NaHC0315g、乙醇胺14g、偏釩酸鋰0.6g、NaCl1.3g、疊氮鈉0.5g;4.溶液進行充分的攪拌5.最后在兩個容器中加入剩余的0.2L的水6.試劑在20度常溫下放置1天后放入4度冰箱里保存。實施例41.先取兩個一升容器，每個容器加入0.8L的去離子水；2.容器一中加入試劑1的物質乙酸5ml、乙酸鈉10.8g、FeC120.001g、Tritonx_1005ml、吐溫5ml、疊氮鈉0.5g;3.容器二中加入試劑2的物質Na2C0315g、乙醇胺14g、偏釩酸銨0.6g、NaCl1.5g、疊氮鈉0.5g;4.溶液進行充分的攪拌5.最后在兩個容器中加入剩余的0.2L的水6.試劑在20度常溫下放置1天后放入4度冰箱里保存。實施例51.先取兩個一升容器，每個容器加入0.8L的去離子水；2.容器一中加入試劑1的物質8乙酸5ml、乙酸鈉10.2g、FeC120.003g、Tritonx_1005ml、吐溫5ml、疊氮鈉0.5g;3.容器二中加入試劑2的物質K2C0318.3g、乙醇胺14.5g、偏釩酸銨0.6g、NaCl1.2g、疊氮鈉0.5g;4.溶液進行充分的攪拌5.最后在兩個容器中加入剩余的0.2L的水6.試劑在20度常溫下放置1天后放入4度冰箱里保存。權利要求一種釩酸鹽氧化法檢測總膽紅素試劑盒，其特征在于該試劑盒由下列試劑1和試劑2以3∶1的混合比例組成試劑1緩沖液10-200mmol/LFeCl210-100μmol/LTritonx-1000.01-20ml/L兩性表面活性劑0.1-10ml/L試劑2碳酸鹽10-200mmol/L乙醇胺10-200mmol/L釩酸鹽0.5-8mmol/LNaCl10-500mmol/L疊氮鈉0.01-0.8g/L。2.根據權利要求1所述的一種釩酸鹽氧化法檢測總膽紅素試劑盒，其特征在于其中所述試劑1中的緩沖液為檸檬酸鈉-乳酸緩沖液、甘氨酸-鹽酸緩沖液、乙酸_乙酸鈉緩沖液或鄰苯二甲酸_鹽酸緩沖液。3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑1中的表面活性劑為吐溫80或吐溫20。4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑2中的釩酸鹽為偏釩酸銨、偏釩酸鈉或偏釩酸鋰。5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑2中的碳酸鹽為碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸氫銨或碳酸鉀。試劑1:緩沖液兩性表面活性劑試劑2:碳酸鹽乙醇胺釩酸鹽NaCl全文摘要本發明公開了一種釩酸鹽氧化法檢測總膽紅素試劑盒。本發明的試劑盒由試劑1和試劑2以3∶1的混合比例組成。本發明通過加入復合物，增加了釩酸的溶解度，在酸性條件下溶解度也不會降低，從而加速了總膽紅素的反應。另外，在試劑盒中，加入抗干擾物，提高反應過程中抗壞血酸干擾反應的能力，使得測試的結果與重氮鹽法有很好的臨床相關性，本發明的試劑盒有較好的臨床應用前景。文檔編號G01N33/72GK101776692SQ200910045128公開日2010年7月14日申請日期2009年1月9日優先權日2009年1月9日發明者張躍建,景晟申請人:上海復星醫藥(集團)股份有限公司;上海復星長征醫學科學有限公司