專利名稱：：用于體外檢測生物人工肝功能性的組合物及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物人工肝檢測用醫學試驗配制品，具體涉及一種用于體外檢測生物人工肝功能性的組合物。本發明還涉及上述組合物的制備方法。
背景技術：
：我國是重型肝炎、肝衰竭的高發國家，每年有數萬例患者會發生該病，平均死亡率為3040%，晚期患者死亡率更高達7080%。因為病情進展很快，多數患者黃膽迅速加深，并出現出血、昏迷、腹水等嚴重并發癥，而內科藥物治療效果差，預后不良。肝衰竭內科保守治療效果較差，而肝移植目前受到供體嚴重短缺等因素的制約，因此非內科藥物治療成為當前研究的熱點。人工肝支持系統已被國內外學者證明具有良好的臨床治療效果。人工肝支持系統可以分為非生物人工肝支持系統和生物人工肝支持系統。由于技術不斷成熟和完善，療效確切，非生物人工肝支持系統逐漸成為治療肝衰竭的常規手段。隨著新型材料的不斷開發和技術的不斷進步，非生物人工肝支持系統的血液凈化效果不斷提高，已成為體外人工肝支持的重要手段，.但非生物人工肝也存在著自身難以克服的缺陷，如血漿置換雖對肝衰竭具有較好的治療作用，但存在諸如過敏反應、低血壓等副作用，以及輸血感染的風險；分子吸附再循環系統(MARS)系統價格昂貴，國內大多數肝功能衰竭病人為此而未能得到MARS的救治；非生物人工肝支持系統主要的功能是解毒，并不能改變患者的預后，即不能完成肝臟合成代謝后的轉化的功能。隨著肝細胞分離、培養和克隆技術以及生物反應器的日趨成熟，新一代以培養肝細胞為基礎的現代生物人工肝被認為是目前治療肝衰竭最有前途的手段。生物人工肝的研究過程中需要對其功能性(如有效性和安全性)進行體外評估，現有的做法是使用肝衰竭模型動物的血漿來模擬人類患者的血漿進行檢測和評估。然而，形成動物肝衰竭模型的方法差異以及動物的個體差異，會使得肝衰竭血漿成分變化的不一致性，即使是使用的是人類患者的血漿，也會因發病地區、發病機制、患者個體和治療方法的不同而使得血漿成分有所不同。因此，導致體外檢測結果不準確，生物人工肝難以大規模使用。另外，作為檢測用的血槳還必須對人工生物肝的生物反應器部分無不良反應，且無外源性污染和疾病傳播的風險。所以有必要提供一種可模擬肝衰竭血漿并在同一基線水平檢測生物人工肝的有效性和安全性的組合物。該組合物還應滿足對反應器部分無不良反應且無外源性污染和疾病傳播的風險的要求。而且，為可廣泛應用，該組合物應可大規模制備。
發明內容本發明的目的之一在于提供一種用于體外檢測生物人工肝的功能性的組合物，其包含濃度為171-342pmol/L的未結合膽紅素或膽紅素二鈉、濃度為100-200^mol/L膽汁酸、濃度為240-400pmol/L的氨和細胞培養基。在本發明的一個實施方式中，細胞培養基可以為無血清培養基或者人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM;優選為人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。在本發明的另一個實施方式中，膽汁酸為鵝去氧膽酸和膽酸，其中鵝去氧膽酸濃度為80-160pmol/L，膽酸濃度為20-40pmol/L。在本發明的另一個實施方式中，該組合物中的氨來源于非氧化性酸的銨鹽，例如NH4Cl、NH4Br或(NH4)3P04，優選為氯化銨(NH4Cl)。本發明的另一個巨的在于提供上述組合物的制備方法，其包括(a)提供細胞培養基；(b)將未結合膽紅素或膽紅素二鈉加入所述細胞培養基，使得組合物中膽紅素的濃度為171-342pmol/L;(c)將膽汁酸加入所述細胞培養基，使得組合物中膽汁酸的濃度為腸-200拜ol/L;(d)將銨鹽加入所述細胞培養基，使得組合物中氨的濃度為240-400jimol/L。在本發明方法的一個實施方式中，上述步驟(b)和步驟(c)的順序顛在本發明方法的另一個實施方式中，步驟(a)中所述細胞培養基為無血清培養基，或者是人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM;優選為人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。在本發明方法的另一個實施方式中，步驟(c)中所述膽汁酸為鵝去氧膽酸和膽酸。在本發明方法的另一個實施方式中，步驟(d)中所述銨鹽為非氧化性酸的銨鹽，例如NH4Cl、NH4Br或(NH4)3P04，優選為氯化銨。本發明提供的能夠體外檢測生物人工肝功能性的組合物，其是在以往對肝臟的生理功能和肝衰竭患者的血漿成分的變化的研究基礎上研發出來的，該組合物能夠很好地反映肝臟衰竭患者的肝臟代謝功能、分泌功能和合成功能的損害。將該組合物通過生物人工肝的生物反應器部分，通過檢測混合液中可反映肝臟代謝、分泌和合成功能物質濃度的變化來檢測生物人工肝的體外功能性(有效性和安全性)。本發明提供的組合物中反映肝衰竭的物質的濃度可以穩定在一個水平，不會具有因動物的個體差異和不同方法致動物肝衰竭模型時肝衰竭血漿成分變化水平的不一致性，其能夠很好地在同一基線水平檢測生物人工肝功能，而且本發明幾乎對生物反應器部分無不良反應，更無外源性污染和疾病傳播問題。本發明組合物所含的各組分來源豐富、成本低，且本發明組合物的制備方法簡單，因此可以大規模制備。具體實施方式為更好地理解本發明，以下通過具體實施方式來進一步詳細描述本發明。本發明所用試劑未結合膽紅素、二甲基亞砜、RPMI1640培養基、鵝去氧膽酸、膽酸、銨鹽均購于天津Alfa公司。濃度為20%的人血白蛋白購于上海萊仕血制品公司。儀器杜邦AR型全自動生化分析儀(購自美國杜邦公司)；血氨的測定試劑盒(購自長春匯力生物技術有限公司)。實施例1①將O.lg未結合膽紅素在5(TC溶于10ml的二甲基亞砜，備用；②25ml的濃度為20%的人血白蛋白加入965mlRPMI1640培養基，邊加白蛋白邊振蕩，使其濃度均勻；③溶解在二甲基亞砜中的未結合膽紅素逐滴加入含人血白蛋白的RPMI1640培養基，邊加邊振蕩；④將32mg的鵝去氧膽酸和10mg膽酸加入步驟③所得的混合物中，均勻振蕩使其溶解。⑤在混合物溫度降至室溫時，將13mg氯化銨加入步驟④所得的混合物中，均勻振蕩使其溶解。統計學處理采用Mean士SDSPSS13.0進行統計學分析。P<0.05表示差異顯著。將配制好的組合物分別置于4t:和37'C的環境中，并在O、12和24小時時取樣，每次取三個標本，用杜邦AR型全自動生化分析儀，血氨的測定試劑盒檢測各時間點組合物所包含的各物質的濃度。結果發現在O、12和24小時的時間內，各物質濃度的變化無顯著性差異(P>0.05，檢測值見表l和表2)。表l——4'C時組合物中各物質的濃度變化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2^37i:時組合物中各物質的濃度變化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上表可看出，在4。C和37-C時，以上述各物質濃度配制而成的組合物是可以穩定存在的。實施例2①將0.2g未結合膽紅素在50'C溶于20ml的二甲基亞砜，備用；②將50ml的20%的人血白蛋白加入930mlRPMI1640培養基，邊加白蛋白邊振蕩，使其濃度均勻；③將溶解在二甲基亞砜中的未結合膽紅素逐滴加入含人血白蛋白RPMI1640培養基，邊加邊振蕩；將60mg的鵝去氧膽酸和20mg膽酸加入步驟③所得混合物中，均勻振蕩使其溶解；⑤在混合物溫度降至室溫時，將20mg氯化銨加入步驟④所得混合物中，均勻振蕩使其溶解。統計學處理采用Mean士SD檢驗，用SPSS13.0軟件進行統計學分析。P〈0.05表示差異顯著。將配制好的組合物分別置于4'C和37"C的環境中，并在0、12和24小時取樣，每次取三個標本用杜邦AR型全自動生化分析儀，血氨的測定試劑盒檢測各時間點組合物所包含的各物質的濃度。結果發現在0、12和24小時的時間內，各物質濃度的變化無顯著性差異(P>0.05，檢測值見表3和表4)。表3^4。C時組合物中各物質的濃度變化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>0.827結果說明在4T:和37"C時，以上述的各物質濃度配制而成的組合物是可以穩定存在的。實施例3①將32mg的鵝去氧膽酸和10mg膽酸加入1000ml無血清培養基中，均勻振蕩使其溶解；②將0.11g膽紅素二鈉加入上述混合液中，邊加邊振蕩；③將24mg溴化銨加入步驟②的混合液中，均勻振蕩使其溶解。統計學處理采用Mean士SDSPSS13.0進行統計學分析。P<0.05表示差異顯著。將配制好的組合物分別置于4'C和37。C的環境中，并在O、12和24小時時取樣，每次取三個標本，用杜邦AR型全自動生化分析儀，血氨的測定試劑盒檢測各時間點組合物所包含的各物質的濃度。結果發現在O、12和24小時的時間內，各物質濃度的變化無顯著性差異(P>0.05，檢測值見表5和表6)。表5——4'C時組合物中各物質的濃度變化(Mean土SD)時間項目O小時12小時24小時P值未結合膽紅素Ounol/L)174.50±0.36174.2±0.40174.4±0.350.722氨(pmol/L)243.33±1.53242.3±1.15242.6土2.080.889鵝去氧膽酸(Hmol/L)80.77±0.3880.53±0.2180.43±0.120.483膽酸(Hmol/L)21.17±0.1521.20±0.2021.23±0.150.679表6——37^時組合物中各物質的濃度變化(Mean士SD)時間項目o小時12小時24小時P值未結合膽紅素(Hmol/L)174.1±0.35174.7±0.29174.6±0.170.207氨(拜ol/L)242.0±1.73243.0±2.00242.3±1.530.787鵝去氧膽酸(Hmol/L)81.20±0.3680.80±0.1080.73±0.060.079膽酸(拜ol/L)22.80±0.5022.33±0.2122.63±0.060.261實施例4①將60mg的鵝去氧膽酸和20mg膽酸加入1000ml無血清培養基中，均勻振蕩使其溶解；②將0.23g膽紅素二鈉加入上述混合液中，邊加邊振蕩；③將48mg溴化銨加入步驟②的混合液中，均勻振蕩使其溶解。統計學處理采用Mean土SDSPSS13.0進行統計學分析。P<0.05表示差異顯著。將配制好的組合物分別置于4'C和37匸的環境中，并在0、12和24小時時取樣，每次取三個標本，用杜邦AR型全自動生化分析儀，血氨的測定試劑盒檢測各時間點組合物所包含的各物質的濃度。結果發現在0、12和24小時的時間內，各物質濃度的變化無顯著性差異(P>0.05，檢測值見表7和表8)。表7~~4-C時組合物中各物質的濃度變化(Mean士SD)時間項目O小時12小時24小時P值未結合膽紅素(Hmol/L)341.3±0.25340.9±0.35341.7±0.490.298氨(Hmol/L)398.0±1.53398.3±2.05398.7±1.670.557鵝去氧膽酸(啤ol/L)80.77±0.3880.53±0.2180.43±0.120.336膽酸(Hmol/L)21.17±0.1521.20±0.202L23土0.150.893表8——37'C時組合物中各物質的濃度變化(Mean士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例3和實施例4中的膽紅素二鈉可如以下方法制備將未結合膽紅素(UCB)溶于氯仿中，逐滴加入甲醇和乙醇鈉的混合液中(乙醇鈉:甲醇=1:6(V:V))，乙醇鈉與UCB的摩爾比為1.95:1。將混合液在5(TC真空中蒸發，得到的棕色粉末以氯仿洗兩次，以去除未與乙醇鈉反應的UCB，真空中去除氯仿，最后得到的膽紅素二鈉貯存于棕色瓶中備用。或者，實施例3和實施例4中的膽紅素二鈉可從生產商購買得到。本發明的組合物中膽紅素的最低濃度約為正常人膽紅素濃度高限的10倍左右，而組合中氨的最低濃度約為正常人血氨濃度高限的4倍左右，可以很好地模擬人肝衰竭患者的血清。所述的用于檢測生物人工肝體外功能的組合物可以特異性地反映肝衰竭患者血漿成分的變化，并且各種試劑容易購得，經濟便宜，且可大量制備。本發明所述的組合物在4'C和37X:時，未結合膽紅素、鵝去氧膽酸、膽酸和氨按上述比例溶解在細胞培養基中，各物質之間可以穩定存在，各成分濃度都穩定地維持在固定的范圍內。當用于檢測生物人工肝的體外功能，可以很好地在同一基線水平檢測生物人工肝的體外功能。雖然本發明已經參考具體的實施方式進行描述，但是本領域技術人員通過閱讀上述描述后，將可以對本發明做出顯而易見的修改和修飾，而不違背本發明的意圖和本質。本發明有意將這些修改和修飾包括在權利要求的范圍內。權利要求1.一種用于體外檢測生物人工肝的功能性的組合物，其包含濃度為171-342μmol/L的未結合膽紅素或膽紅素二鈉、濃度為100-200μmol/L膽汁酸、濃度為240-400μmol/L的氨和細胞培養基。2.權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述細胞培養基為無血清培養基或者人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。3.權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述膽汁酸為鵝去氧膽酸和膽酸，其中鵝去氧膽酸濃度為80-160nmol/L，膽酸濃度為20-40|iimol/L。4.權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述氨來源于非氧化性酸的銨鹽。5.權利要求4所述的組合物，其特征在于，所述非氧化性酸的銨鹽選自NH4C1，NH4B,(NH4)3P04。6.權利要求l所述的組合物，其特征在于，所述氨來源于NH4C1。7.權利要求1所述的組合物的制備方法，其包括(a)提供細胞培養基；(b)將未結合膽紅素或膽紅素二鈉加入所述細胞培養基，使得組合物中膽紅素的濃度為171-342|nmol/L;(c)將膽汁酸加入所述細胞培養基，使得組合物中膽汁酸的濃度為100-200拜ol/L;(d)將銨鹽加入所述細胞培養基，使得組合物中氨的濃度為240-400Hmol/L。8.權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(b)和步驟(c)的順序顛倒。9.權利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(a)中所述細胞培養基為無血清培養基或者人血白蛋白濃度范圍為5-10g/L的RPMI-1640或DMEM。10.權利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(c)中所述膽汁酸為鵝去氧膽酸和膽酸，其中鵝去氧膽酸濃度為80-160pmol/L，膽酸濃度為20-40拜ol/L。11.權利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(d)中所述銨鹽為非氧化性酸的銨鹽。12.權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(d)中所述銨鹽為NH4C1。全文摘要本發明提供的組合物含有濃度為171-342μmol/L的膽紅素或其衍生物、濃度為100-200μmol/L膽汁酸、濃度為240-400μmol/L的氨和細胞培養基。組合物中反映肝衰竭的物質的濃度可以穩定在一個水平，不會具有因動物的個體差異和不同方法致動物肝衰竭模型時肝衰竭血漿成分變化水平的不一致性，其能夠很好地在同一基線水平檢測生物人工肝體外功能，而且本發明幾乎對生物反應器部分無不良反應，更無外源性污染和疾病傳播問題。本發明組合物所含的各組分來源豐富、成本低，且本發明組合物的制備方法簡單，因此可以大規模制備。文檔編號G01N33/72GK101556275SQ20091003958公開日2009年10月14日申請日期2009年5月19日優先權日2009年5月19日發明者蔣澤生,穎郭,森高,毅高申請人:南方醫科大學珠江醫院