專利名稱：：檢測二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的酶聯免疫試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明屬于免疫學
技術領域：
，具體涉及一種檢測二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的酶聯免疫試劑盒及使用所述試劑盒檢測農藥殘留的方法。
背景技術：
：有機磷類農藥由于高效，廉價而在農業和種植業上廣泛使用，但是有機磷農藥，作為神經毒物，會引起神經功能紊亂、震顫、精神錯亂、語言失常等癥狀。在2002年中華人民共和國公布的第199號公告上明令禁止在蔬菜、果樹、茶葉、中草藥材上不得使用和限制使用的農藥共有19種，其中有機磷農藥占了17種，而含二乙氧基硫代磷酸酯共有結構的農藥就有8種。目前國內外的農藥殘留免疫檢測研究，基本上都集中于單組分特異性檢測及相應試劑盒的研制，但是實際生產中，食物中殘留的農藥種類較多，單組分試劑盒很難實現快速高通量的檢測，雖然儀器多殘留檢測已經可以實現越來越多組分的多殘留檢測，但所需儀器復雜昂貴，而且樣品前處理繁瑣費時，操作需專業人員、檢測費用高，很難適應許多場合快速檢測的需要。因此，實現農藥多殘留快速檢測，已經是國內外殘留分析的一種新趨勢。目前農藥多殘留免疫檢測國內研究成果比較少，國外僅有少量用多克隆抗體和單克隆抗體進行有機磷農藥多殘留免疫檢測的理論研究報道，未提供實際樣品的檢測方法和具有經濟效益檢測產品，現有的單組分試劑盒很難實現高通量快速的檢測，為了實現農藥的高通量、快速、靈敏檢測要求，開發新的有機磷多殘留檢測試劑盒十分迫切。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體，是一種多克隆抗體，具有廣譜特異性，實際應用性強。本發明的另一個目的是提供所述抗體的制備方法。本發明還有一個目的是提供所述抗體在有機磷農藥多殘留ELISA檢測方法中的應用。本發明的技術方案是提供一種二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的酶聯免疫分析試劑盒，包括盒體、固體載體、特異性抗體溶液、二抗溶液、標準溶液、濃縮提取液、底物液、底物緩沖液、濃縮洗滌液和終止液，所述酶標板包被了二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗原；所述特異性抗體溶液為抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的抗體溶液；所述二抗溶液為辣根過氧化酶標二抗溶液；所述標準溶液為有機磷農藥標準溶液。本發明所指的一類有機磷農藥共有結構是二乙氧基硫代磷酸酯。本發明所述的一類有機磷農藥指含有二乙氧基硫代磷酸酯共有結構的有機磷農藥，尤其是對硫磷、蠅毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫磷、除線磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷、治螟磷及它們的混合物。所述固體載體是聚苯乙烯96孔或40孔酶標板。包被了二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗原的酶標板在制作過程中，所用的包被原是將二乙氧基硫代磷酰氯與氨基己酸親和取代后制得的半抗原，與卵清蛋白(OVA)偶聯制備得到的包被原。所用的包被液是pH9.6，0.05M碳酸鹽緩沖液，封閉液是3.0~5.0%脫脂奶粉。酶標板材質可以為聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、纖維素、玻璃等。所述二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗原是用二乙氧基硫代磷酰氯與氨基己酸親核取代合成半抗原，再采用活潑酯法將半抗原與載體蛋白進行偶聯制備得到。所述抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體是單克隆抗體。具體指鼠單克隆抗體。制備過程中，免疫原是將二乙氧基硫代磷酰氯和對羥基肉桂酸親核取代后得到的半抗原與牛血清蛋白(BSA)采用活潑酯法進行偶聯得到的。所用的抗體稀釋液是pH7.4，0.010.05mol/L的磷酸鹽緩沖液，所用抗體的濃度為0.060.24(ag/mL。所述抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體的制備方法包括以下步驟(1)二乙氧基硫代磷酰氯與對羥基肉桂酸反應合成免疫半抗原；(2)半抗原偶聯載體蛋白得到免疫原；(3)免疫原免疫Balb/c小鼠制備脾細胞，通過細胞融合，篩選分泌目標抗體的雜交瘤細胞，采用Balb/c小鼠體內誘生法制備腹水，純化腹水得到抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥單克隆抗體本發明所述試劑盒的底物液為過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液；所述底物緩沖液為含有3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB)或鄰苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液；所述終止液為510%硫酸、鹽酸或氫氧化鈉溶液；所述濃縮洗滌液為含有0.51.0%吐溫20的磷酸鹽緩沖液，所述的辣根過氧化酶二抗是羊抗小鼠IgGHRP，所述的濃縮提取液為含有20%甲醇的磷酸鹽緩沖液，底物顯色液為含0.200.25mg/mL四甲基聯苯胺(TMB)的檸檬酸緩沖液。作為優選，所述底物液為57%過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液；所述底物緩沖液為含有3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB)或鄰苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液；所述終止液為10%硫酸溶液；所述濃縮洗滌液為含有1.0%吐溫20和0.1mol/L磷酸鹽緩沖液。所述標準品溶液的濃度為06553.6ng/mL，可選擇為Ong/mL、0.2ng/mL、0.8ng/mL、12.8ng/mL、204.8ng/mL、1638.4ng/mL禾口6553.6ng/mL。本發明提供了一種使用所述試劑盒檢測樣品中二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥殘留的方法，包括下列步驟(1)樣品前處理；(2)向權利要求1所述試劑盒的酶標板微孔中加入標準品溶液或農藥樣品溶液；加入二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體，溫育后洗滌拍干，加入酶標二抗，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光值；(3)檢測結果分析。步驟(1)所述樣品包括水、土壤、蔬果、血液、洗胃液和嘔吐液等，樣品前處理的方法分別為a.水樣過濾后即可取樣進行ELISA分析。b.土壤取10g土壤用2040mL甲醇提取3次，合并提取液，濃縮，然后用PBST稀釋定容至10mL，取樣進行ELISA分析。c.蔬果樣品取蔬果樣品粉碎機絞碎后稱取10g，用2040mL甲醇提取3次，合并提取液，濃縮，用PBST定容至10mL，取樣進行ELISA分析。d.血液取人體血液，加抗凝素后直接用ELISA法進行分析。e.洗胃液(2%碳酸氫鈉溶液)取5mL洗胃液，用稀HCl調pH值到中性后即可用ELISA法進行分析。f.嘔吐液取樣品研碎，離心取上清用ELISA法進行分析。步驟(2)以對硫磷為例，農藥樣品檢測過程為對硫磷標準溶液或經前處理的樣品溶液50pL加入酶標板微孔中，再加入50pL抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體，溫育后洗板拍干，再加入100pL辣根過氧化酶表二抗，溫育后洗板拍干，顯色、終止，用酶表儀測定吸光值。以對硫磷為例，步驟(3)所述檢測結果分析方法為以所獲樣品吸光值的平均值計算抑制率，抑制率計算公式為抑制率(0/0)=d-D-(4-《in)x100(0/o)其中，Am^為不加農藥時的吸光值，Ax為農藥濃度為X時的吸光值，A^,為空白對照孔的吸光值。以抑制率為縱坐標，對硫磷標準品濃度的半對數為橫坐標，對應樣品濃度可從校正曲線讀出，也可根據標樣的濃度與抑制率求出線性方程，然后求出對應樣品的濃度。其它農藥含量可根據交叉反應率計算實際含量。交叉反應率公式如下交叉反應率(％)=，,,Xl00(%)i^^50(待測農藥)其中ICso是抗體達到半抑制的藥物中濃度。本發明的酶聯免疫試劑盒依據如下檢測原理首先將二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥包被抗原包被于固體載體上，然后加入人工制備的抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體和待測農藥，包被抗原和待測農藥競爭抗體，待測農藥含量高時，則結合在包被原的抗體就少，反之結合在包被原的抗體就多，反應后洗板拍干，加入酶標二抗反應一段時間，洗板拍干，再加入底物進行顯色加以測定，當抗體量一定時，加入的待測農藥量越多，與包被原結合的抗體就越少，發色反應減弱，抑制率增高，反之，則發色反應增強，抑制率降低，因而根據已知量的對硫磷標準曲線和待檢測樣品的抑制率，再根據抑制率與對硫磷濃度之間的半對數關系作圖即得標準曲線，并推算出待測對硫磷的濃度，其它農藥及其混合物根據它們與對硫磷的交叉反應率推算實際濃度。本發明的有益效果是(1)本發明試劑盒采用高效價并具有廣譜特異性的抗體，提高了檢測的靈敏度、精密度和準確度。(2)本發明試劑盒能廣泛應用于水、土壤、蔬果、血液、洗胃液和嘔吐液等多種樣品中有機磷農藥的檢測，樣品前處理過程較簡單，耗時少(檢測過程只需1.5h左右)，能高通量檢測樣品，檢測成本遠比傳統方法低。(3)本發明試劑盒的保存期長，至少6個月以上；使用簡單方便，適用于目前使用最為廣泛的一類有機磷農藥殘留現場高通量快速篩選，具有重要的現實意義。圖1對硫磷標準曲線圖具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步詳細說明本發明。實施例l試劑盒組分制備1、包被抗原制備包被半抗原合成稱取1.68g(0.018moL)KOH溶于無水甲醇中，稱取l.OOg(O.OlmoL)氨基丁酸，0。C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴加1.5g(O駕moL)二乙氧基硫代磷酰氯，O"C反應12h。反應結束旋干，用氯仿洗，過濾，上清濃縮后過(氯仿甲醇=3:1)硅膠柱，得1.14g，產率56.0%。ESI-MSanalysis(negative)m/z254[M-H]-;1H-NMR(400MHz,CDC13andTMS):S1.27(t,/=7.0Hz,6H,CH3);1.77(p,J二6.9Hz,2H,CH2);2.39(t,/=7.3Hz,2H,CH2);2.98(td,J產6.8Hz，《/2=6.8Hz，J^6.8Hz，《/4=ll.lHz,2H,CH2);4.01(ddd,J產1.4Hz，/2=7.3Hz,/3=15,9Hz,4H,CH2)。包被原制備取半抗原0.12mmol溶于2mlDMF中，攪拌加入DCC和NHS。fC下磁力攪拌反應過夜，離心后上清液為A液；稱取0.004molOVA，4。C下緩慢溶于10ml濃度為O.lmol/L的PBS(PH8.0)中，攪拌溶解制備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4"C下反應12h。離心后，取上清夜，4。C下用生理鹽水透析3天，每天更換3次透析液。得到的包被原分裝于0.5ml離心管中。凍存于-2(TC冰箱中，供包被酶標板用。2、包被酶標板制備包被抗原用pH9.6，0.05M的碳酸鹽緩沖液稀釋成0.14)ig/mL，在酶標板微孔中每孔加lOOpL,4'C包被過夜或37'C包被3h，傾去包被液，用PBST洗滌35次，拍干，每孔加入200^3.05.0%脫脂奶粉，37"溫育l3h，用PBST洗滌35次，拍干后干燥保存于鋁箔袋中。3、二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥單克隆抗體制備免疫半抗原合成稱取0.7(0.0125moL)KOH溶于無水甲醇中，稱取0.821g(0.005moL)對羥基肉桂酸，0。C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴加1.415g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，(TC反應過夜。反應結束，過濾，上清液旋轉蒸發濃縮，用乙酸乙酯溶解，過濾，濾液選裝蒸發濃縮，加入適量飽和碳酸氫鈉溶液，攪拌25min，用乙酸乙酯萃取，有機相濃縮析出結晶，用石油醚洗，得到產物0.75g，產率為11.9%。ESI國MSanalysis(negative)m/z315[M-H]-;1H-NMR(400MHz,CDC13andTMS):5L36(t,J產7.0Hz,^-7.0Hz,6H，CH3);4.23(qd,J產7.1Hz,Jf7.1Hz，/3=7.1Hz,/4=9.6Hz，4H,CH2);6.37(d,聲16.0Hz,1H，CH=CH);7.21(d,8.4Hz，2H,ArH);7.52(d，風5Hz,2HArH);7.74(d,/=16.0Hz,1H,CH=CH)。免疫原制備取半抗原0.12mmol溶于2mlDMF中，攪拌加入DCC和NHS。fC下磁力攪拌反應過夜，離心后上清液為A液；稱取0.002mo舊SA，4。C下緩慢溶于10ml濃度為O.lmol/L的PBS(PH8.0)中，攪拌溶解制備B液；磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4'C下反應12h。離心后，取上清夜，4'C下用生理鹽水透析3天，每天更換3次透析液。得到的免疫原以lmg/ml或2mg/ml的濃度分裝于0.5ml離心管中。凍存于-2(TC冰箱中，供免疫用。動物免疫方案采用56周齡Balb/c小鼠作為免疫動物，用上述免疫原進行免疫，劑量為每只IOO昭。首次免疫時將免疫原與等量弗氏完全佐劑混合乳化后，腹腔和足墊注射。以后每隔2周取相同劑量的免疫原與弗氏不完全佐劑混合乳化后，加強免疫一次。第二免后IO天取尾部血清用ELISA檢測抗血清效價。待效價穩定后，取200嗎免疫原加強免疫，3天后取脾細胞融合。細胞融合和克隆化取上述脾細胞，按8:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用ELISA檢測細胞培養液，篩選陽性細胞。采用有限稀釋法對陽性細胞進行克隆化，直到得到能穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。單克隆抗體的制備與純化單克隆抗體采用體內誘生法制備。取9周齡Balb/c小鼠腹腔注射石蠟，劑量為每只0.40.5mL，10天后腹腔注射上述雜交瘤細胞，劑量為每只lxl(^個。IO天后采集腹水，用辛酸-硫酸銨法進行純化，用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液透析2天，用PEG濃縮后分裝于小管，-2(TC凍存。實施例2試劑盒的建立本實施例提供一種適用于二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥殘留分析的酶聯免疫分析試劑盒，它基于免疫反應和酶促反應，能檢測水、土壤、蔬果樣品中二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的殘留。試劑盒包括盒體、設在盒體內的96孔/40孔酶標板，抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體；辣根過氧化酶標二抗；對硫磷標準品溶液和試劑，其特征在于，在酶標板微孔中，用包被液包被二乙氧基硫代磷酸酯有機磷農藥抗原，并用3.0~5.0%脫脂奶粉進行封閉，烘干并保存于鋁箔袋；盒內試劑包括抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體，辣根過氧化酶標記羊抗小鼠抗體，對硫磷標準品溶液，濃縮洗滌液，底物液，底物顯色液，反應終止液，其中(1)二乙氧基硫代磷酸酯有機磷農藥抗原是與卵清蛋白偶聯的人工抗原，用pH9.6，0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋成0.14嗎/mL;(2)抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體是高效價、廣譜特異性單克隆抗體；(3)標準品溶液是20%甲醇PBST稀釋一定梯度的溶液。(4)濃縮洗滌液，50mL/瓶，內含磷酸氫二鈉2.9g，磷酸二氫鉀0.2g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.5g，土溫-200.5mL，雙蒸水，為正常使用濃度的20倍。(5)底物液為過氧化氫，15mL/瓶；(6)底物顯色液，20mL/瓶，檸檬酸0.09g，磷酸氫二鈉0.14g，3,3,5,5-四甲基聯苯胺(TMB)0據5g;(7)反應終止液，10mL/瓶，10%硫酸。本試劑盒廣譜特異性好，能同時檢測對硫磷、蠅毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫磷、除線磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷、治螟磷及它們的混合物，最低檢測限為lng/g，線性檢測范圍為3ng/mL1500ng/mL。試劑盒在4"C或保存期內至少可保存6個月以上。實施例3使用本發明試劑盒進行農藥檢測1、檢測樣品前處理水樣過濾后即可取樣進行ELISA分析。土壤取10g土壤用2040rnL甲醇提取3次，合并提取液，濃縮，然后用PBST稀釋定容至10mL，取樣進行ELISA分析。蔬菜樣品取蔬菜樣品粉碎機絞碎后稱取10g，用2040mL甲醇提取3次，合并提取液，濃縮，用PBST定容至10mL，取樣進行ELISA分析。血液取人體血液，加抗凝素后直接用ELISA法進行分析。洗胃液(2%碳酸氫鈉溶液)取5mL洗胃液，用稀HCl調pH值到中性后即可用ELISA法進行分析。嘔吐液取樣品研碎，離心取上清用ELISA法進行分析。2、檢測方法操作過程如下取出一塊包被有二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗原的酶標板，恢復到室溫后備用；加入50(iL—系列濃度的標準品和50pL二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體，37'C溫育45min，洗板，拍干，加入100pL辣根過氧化酶標記抗體，37"C溫育30min，洗板，拍干，TMB37"避光顯色10min，硫酸終止，酶標儀450nm測定吸光值。以所獲樣品吸光值的平均值計算抑制率，抑制率計算公式為抑制率(％)=d-D-(4-4nin)x!00(%)4nax—^min其中，Am^為不加農藥時的吸光值，Ax為農藥濃度為X時的吸光值，Ami。為空白對照孔的吸光值。以抑制率為縱坐標，農藥標準品濃度的半對數為橫坐標，對應樣品濃度可從校正曲線讀出，也可根據標樣的濃度與抑制率求出線性方程，制作數據分析系統。此法便于樣品的高通量快速篩選，整個檢測過程只需1.5h，最低檢測限為lng/g。本實施例以對硫磷為例，標準曲線如附圖1所示。實施例3試劑盒特異性試驗本發明所述試劑盒特異性用藥物之間的交叉反應率表示，是指檢測其它農藥時對比檢測對硫磷的交叉反應率。本發明用蠅毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫磷、除線磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷、治螟磷及它們的混合物(混合物1和混合物2)代替對硫磷，測定其標準曲線，計算抑制中濃度IQ。，并計算交叉反應率。交叉反應率(％)=^1Lxi00(%)i。50(待測農藥)其中IC^是抗體達到半抑制的藥物中濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>其中混合物l為對硫磷蠅毒磷喹硫磷三唑磷辛硫磷除線磷=1:1:32:32:4:4(質量比)；混合物2為對硫磷蠅毒磷喹硫磷三唑磷辛硫磷除線磷毒死蜱乙基溴硫磷氯唑磷二嗪磷治螟磷=1:1:32:32:4:4:64:64:64:64:64(質量比)。在實際樣品檢測時，由對硫磷標準曲線計算含有對硫磷當量，根據上表交叉反應率，計算其它農藥的實際含量或可能含有農藥混合物的總量。實施例4試劑盒準確度和精密度試驗取3個濃度的對硫磷標準液，對樣品進行添加回收試驗，每個添加濃度設計4個平行，分別計算回收率。表2添加回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>生菜0.4880.629±0.014128.82.30.2440.234±0.02396.19.70.1220.118±0.01096.48.3水樣0.3130.296±0.01394.73.90.1570.138±0遍87.61.50.0790.091±0.016115.72.5由表2可知，生菜樣品中添加回收率為96.1128.8%，變異系數為2.39.7%;水中添加回收率為87.6115.7%，變異系數為1.53.9%，說明試劑盒的檢測實際樣品的準確度和精密度都比較好。權利要求1、一種檢測二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的酶聯免疫試劑盒，包括盒體、固體載體、特異性抗體溶液、二抗溶液、標準溶液、濃縮提取液、底物液、底物緩沖液、濃縮洗滌液和終止液，其特征在于所述酶標板包被了二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗原；所述特異性抗體溶液為抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的抗體溶液；所述二抗溶液為辣根過氧化酶標二抗溶液；所述標準溶液為有機磷農藥標準溶液。2、根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述有機磷農藥含有二乙氧基硫代磷酸酯共有結構；優選對硫磷、蠅毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫磷、除線磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷或治螟磷的任意一種或者兩種以上的混合物。3、根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述固體載體是聚苯乙烯96孔或40孔酶標板。4、根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗原是用二乙氧基硫代磷酰氯與氨基己酸親核取代合成半抗原，再采用活潑酯法將半抗原與載體蛋白進行偶聯制備得到。5、根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體是單克隆抗體。6、根據權利要求1或5所述的試劑盒，其特征在于所述抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體的制備方法包括以下步驟(1)二乙氧基硫代磷酰氯與對羥基肉桂酸反應合成免疫半抗原;(2)半抗原偶聯載體蛋白得到免疫原；(3)免疫原免疫Balb/c小鼠制備脾細胞，通過細胞融合，篩選分泌目標抗體的雜交瘤細胞，采用Balb/c小鼠體內誘生法制備腹水，純化腹水得到抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥單克隆抗體。7、根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述底物液為過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液；所述底物緩沖液為含有3,3,5，5-四甲基聯苯胺(TMB)或鄰苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液；所述終止液為510%硫酸、鹽酸或氫氧化鈉溶液；所述濃縮洗滌液為含有0.51.0%吐溫20的磷酸鹽緩沖液。8、根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述底物液為57%過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液；所述底物緩沖液為含有3,3,5，5-四甲基聯苯胺(TMB)或鄰苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液；所述終止液為10%硫酸溶液；所述濃縮洗滌液為含有1.0%吐溫20和O.lmol/L磷酸鹽緩沖液。9、根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述標準品溶液的、濃度分別為Ong/mL、0.2ng/mL、0.8ng/mL、12.8ng/mL、204.8ng/mL、1638.4ng/mL和6553.6ng/mL。10、一種使用權利要求1所述試劑盒檢測樣品中二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥殘留的方法，其特征在于包括下列步驟(1)樣品前處理；(2)向權利要求1所述試劑盒的酶標板微孔中加入標準品溶液或樣品溶液；加入二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體，溫育后洗滌拍干，加入酶標二抗，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標儀測定吸光值；(3)檢測結果分析。全文摘要本發明公開了一種檢測二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的酶聯免疫試劑盒，包括盒體、包被了二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗原酶標板、抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥的抗體溶液、二抗溶液、標準溶液、濃縮提取液、底物液、底物緩沖液、濃縮洗滌液和終止液。本發明所述有機磷農藥指含有二乙氧基硫代磷酸酯共有結構的有機磷農藥，尤其是對硫磷、蠅毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫磷、除線磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷、治螟磷及它們的混合物。本發明提供的酶聯免疫試劑盒可用于檢測蔬果、土壤和水體中有機磷農藥殘留，操作簡便、靈敏度高、價格低廉，適合現場監控的高通量篩選。文檔編號G01N33/543GK101477123SQ20091003661公開日2009年7月8日申請日期2009年1月13日優先權日2009年1月13日發明者孫遠明,徐振林,楊金易,沈玉棟,弘王,謝桂勉,雷紅濤申請人:華南農業大學