專利名稱：乳糖診斷/測定試劑(盒)及乳糖濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種乳糖診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定乳糖濃度的方
法，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。
背景技術：
乳糖是嬰幼兒主要的能量來源，進入體內后經小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半 乳糖，半乳糖是嬰幼兒腦發育的必需物質，與嬰幼兒大腦的迅速成長有密切聯系。為防止乳 清粉中摻加用其他還原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的檢測十分必要。 牛奶是一種營養豐富的食品，但如飲用不當，也會給健康帶來不良影B向。很多人在 飲奶后出現腹部不適、腹脹、多屁、腹痛甚至腹瀉等癥狀，這種現象在醫學上稱為乳糖不耐 受癥，其原因是這些人小腸缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖進入結腸后，經結腸 中的細菌發酵，產生大量氣體、醋酸等物質所致。大量研究證實，患有乳糖不耐受的人還有 大部分沒有任何癥狀、只有人體生化指標改變的隱性不耐受者，醫學上稱為乳糖吸收不良 或乳糖酶缺乏。 據統計，全世界都存在乳糖不耐受的問題，其中亞洲人發生率最高，為 95%-100%。據中國疾病控制中心調查，我國北京、上海、廣州等地3_13歲兒童乳糖不耐受 癥和乳糖吸收不良的發生率約為80%。乳糖不耐受除引起消化道癥狀外，還可造成人體營 養吸收不良。據國外研究，乳糖不耐受可減少鈣的攝入、減少峰值骨量、增加骨丟失從而引 發骨質疏松癥，乳糖不耐受可影響鐵和鋅的吸收，造成鐵缺乏和鋅缺乏，并可影響小兒的腦 發育，對人體健康危害很大。 在食品分析領域中，酶分析法是廣為使用并倍受諸如ISO等國際標準機構推薦的 一種方法。酶析法理論發展成熟并且已為實驗室普遍接受。使用高質量經純化的酶可以實 現對復雜物質中特定成份的檢測。該方法可以檢測的目標代謝物有糖類、酸類及其鹽類、醇 類和其他物質等。由此，各種食品樣品均可被快速檢測并獲得良好的結果。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，計量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定乳糖濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現 該方法的乳糖診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行乳糖濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推 廣應用。 本發明乳糖濃度測定方法如下 乳糖+水半乳糖苷酶半乳糖+葡萄糖 半乳糖+氧半乳糖氧化酶半乳糖己糖雙醛糖+過氧化氫 過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+2水[OCrn] 這種方法應用半乳糖苷酶(Galactosidase ;EC 3. 2. 1. 23)酶(偶)聯半乳糖氧化 酶(Galatose Oxidase ;EC 1. 1. 3. 9) 、NADH過氧化物酶(NADH peroxidase ;ECl. 11. 1. 1 ;EC 1. 11. 1. 2)酶促反應比色終點法。半乳糖苷酶酶解乳糖反應產生半乳糖，再通過(偶)聯合 半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為 還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程 度，通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算乳糖的濃度大小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明乳糖診斷/測定試劑(盒)較為理想
100,1/L 500,1/L 3mmol/L 半乳糖苷酶 10000U/L 半乳糖氧化酶 12000U/L NADH過氧化物酶 12000U/L 本發明的乳糖診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩定劑、輔酶、半乳糖苷酶、半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶。 試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
試劑1 緩沖液、穩定劑、輔酶。
試劑2 緩沖液、穩定劑、半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶。
試劑3 緩沖液、穩定劑、半乳糖苷酶。 輔酶、半乳糖苷酶、半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶在試劑1、試劑2或試劑3中的 位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定乳糖濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩定劑、輔酶。 試劑2
緩沖液、穩定劑、半乳糖苷酶、半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶。 輔酶、半乳糖苷酶、半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶在試劑1或試劑2中的位置可 試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
液劑
沖定酶
緩穩輔
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的乳糖診斷/測定試劑為單試劑，包括 [O(HO] 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 500mmol/L
輔酶 3,1/L
半乳糖苷酶 10000U/L
半乳糖氧化酶 12000U/L
NADH過氧化物酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為
正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。 實施例二 本實施例的乳糖診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 50mmol/L 半乳糖苷酶 10000U/L 半乳糖氧化酶 12000U/L NADH過氧化物酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，
反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。 實施例三 本實施例的乳糖診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑
輔酶
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩定劑
半乳糖氧化酶 NADH過氧化物酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩定劑 半乳糖苷酶
50mmol/L 3mmol/L
100,1/L 500,1/L 12000U/L 12000U/L
100,1/L 500,1/L 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定乳糖濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始
吸光度《0. 1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乳糖樣品與試劑1、試劑2、試劑3 的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測 時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。 申請人:經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本發明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0008 ;吸光度時間反應曲線應呈上 升曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達15mmol/L ;試劑測試的不準確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達O. 0024±0. 0012AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩定一年；—— 本發明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
一種酶比色法及酶聯法的乳糖的濃度測定方法，其方法如下乳糖+水 半乳糖苷酶 半乳糖+葡萄糖半乳糖+氧 半乳糖氧化酶 半乳糖己糖雙醛糖+過氧化氫過氧化氫+還原型輔酶 NADH過氧化物酶 輔酶+2水將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出乳糖的濃度大小測定結果。
1. 一種酶比色法及酶聯法的乳糖的濃度測定方法，其方法如下 乳糖+水半璃'糖苷酶半乳糖+葡萄糖半乳糖+氧半乳糖氣化酶半乳糖己糖雙醛糖+過氧化氫 過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+2水將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm 吸光度上升的程度，測算出乳糖的濃度大小測定結果。
2. —種乳糖診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 20-500mmol/L穩定劑 1-4000mmol/L輔酶 1-6mmol/L1000-80000U/L1000-80000U/L1000-80000U/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、半乳糖苷酶、半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、半乳糖苷酶、半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、半乳糖苷酶、半乳糖氧化 酶、NADH過氧化物酶組成。輔酶、半乳糖苷酶、半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶在試劑1或 試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、半乳糖苷酶、半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、半乳糖氧化酶、NADH過氧化 物酶組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、半乳糖苷酶組成。輔酶、半乳糖苷酶、半乳糖氧化酶、 NADH過氧化物酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述乳糖診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩定劑 l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一 種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的乳糖診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定乳糖濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、半乳糖苷酶、半乳糖氧化酶、NADH過氧化物酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出乳糖的濃度大小。
文檔編號G01N35/00GK101793805SQ20091002857
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優先權日2009年2月4日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司