專利名稱：異檸檬酸測定試劑(盒)及異檸檬酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種異檸檬酸測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定異檸檬酸濃度
的方法，屬于食品檢驗測定技術領域。
背景技術：
異擰檬酸isocitric acid是擰檬酸的異構體，雖然量少，但廣泛存在于生物界。 在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別多，生物能夠利用的是D 型。是三羧酸循環中的一個成分。檸檬酸在鳥頭酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥 頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC 1. 1. 1.41 ;EC 1. 1. 1.42)的作用下變成a-酮戊二酸，在異 檸檬酸裂合酶(isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。
中華人民共和國國家標準，GB T16771-1997，規定了橙、柑、桔汁及其飲料中D_異 檸檬酸的測定方法_紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、柑、桔濃縮汁和果汁，以及果 汁含量不低于2. 5%的橙、柑、桔汁飲料的總D-異檸檬酸的測定。其測定原理異檸檬酸脫 氫酶isocitrate dehydrogenase有兩種類型以NAD為輔酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP 為輔酶的酶(EC1. 1. 1.42)，兩者催化同一反應。
異檸檬酸+NAD(P)+i^ a-酮戊二酸+0)2 + 1^( )11 + 1^ 在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP作用，生成NADH 或NADPH的含量，相當于D-異檸檬酸鹽的量。在波長340nm處測定吸光度，確定樣品中總 D-異檸檬酸的含量。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出 一 種利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法 (CoupleReaction)技術，計量/連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處 吸光度的變化，得以測定異檸檬酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的異 檸檬酸測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析 儀上進行異檸檬酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明異檸檬酸濃度測定方法如下 異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氡酶二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶 二氧化碳+丙酰輔酶A+還原型鐵氧還蛋白2-氧代丁酰合成酶 2-氧代丁酸+輔酶A+氧化型鐵氧還蛋白 2輔酶A+輔酶輔酶A-二硫還原酶輔酶A- 二硫+還原型輔酶這種方法應用異擰檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase ;EC 1.1.1.41;
EC1. 1. 1. 42)酶(偶)聯2-氧代丁酰合成酶(2-oxobutyrate synthase ;EC 1. 2. 7. 2)、輔
酶A-二硫還原酶(CoA-disulfide reductase ;EC 1.8. 1. 14)酶促反應比色終點法。異檸檬酸脫氫酶酶解異檸檬酸反應產生二氧化碳，再通過(偶)聯合2-氧代丁酰合成酶、輔酶 A-二硫還原酶的作用，最終二次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶 (在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測 量340nm處吸光度上升的程度，可以測算異檸檬酸的濃度大小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明異檸檬酸測定試劑(盒)較為理想緩沖液100,1/L穩定劑500,1/L輔酶3mmol/L異檸檬酸脫氫酶10000U/L2_氧代丁酰合成酶12000U/L輔酶A- 二硫還原酶12000U/L丙酰輔酶A7mmol/L還原型鐵氧還蛋白12mmol/L本發明的異檸檬酸測定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、2_氧代丁酰合成酶、輔酶A-二硫還原酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白。 試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩定劑、輔酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白。
試劑2 緩沖液、穩定劑、異檸檬酸脫氫酶、2-氧代丁酰合成酶、輔酶A-二硫還原酶。
輔酶、異檸檬酸脫氫酶、2-氧代丁酰合成酶、輔酶A-二硫還原酶、丙酰輔酶A、還原 型鐵氧還蛋白在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩定劑、輔酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白。
試劑2 緩沖液、穩定劑、2-氧代丁酰合成酶、輔酶A-二硫還原酶。
試劑3 緩沖液、穩定劑、異檸檬酸脫氫酶。 輔酶、異檸檬酸脫氫酶、2-氧代丁酰合成酶、輔酶A-二硫還原酶、丙酰輔酶A、還原 型鐵氧還蛋白在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定異檸檬酸濃度的方法，其輔酶可以是 NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。100,1/L 500,1/L 3mmol/L 10000U/L
12000U/L
12000U/L
7mmol/L 12mmol/L
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的異檸檬酸測定試劑為單試劑，包括 [OO43] 三(羧甲基)氨基甲烷_鹽酸緩沖液
穩定劑
輔酶
異檸檬酸脫氫酶
2_氧代丁酰合成酶
輔酶A- 二硫還原酶
丙酰輔酶A
還原型鐵氧還蛋白
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方
向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。 實施例二 本實施例的異檸檬酸測定試劑為雙試劑，包括
試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷_鹽酸緩沖液
穩定劑
輔酶
丙酰輔酶A
還原型鐵氧還蛋白
試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷_鹽酸緩沖液
穩定劑
異檸檬酸脫氫酶
2_氧代丁酰合成酶
輔酶A- 二硫還原酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. 1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為 2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
100,1/L 50mmol/L 3mmol/L 7mmol/L 12mmol/L
100,1/L 50mmol/L 10000U/L
12000U/L
12000U/L主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
實施例三 本實施例的異檸檬酸測定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩定劑 50mmol/L
輔酶 3,1/L
丙酰輔酶A 7mmol/L
還原型鐵氧還蛋白 12mmol/L
試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩定劑 500mmol/L
2-氧代丁酰合成酶 12000U/L
輔酶A-二硫還原酶 12000U/L
試劑3 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩定劑 500mmol/L
異檸檬酸脫氫酶 10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定異檸檬酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘， 起始吸光度《0. 1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑 2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左 右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。 申請人:經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本發明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0009 ;吸光度時間反應曲線應呈上 升曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達20mmol/L ;試劑測試的不準確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達O. 024±0. 012 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩定一年；——本 發明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
一種酶倍增法、酶比色法及酶聯法的異檸檬酸的濃度測定方法，其方法如下異檸檬酸+輔酶 異檸檬酸脫氫酶 二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶二氧化碳+丙酰輔酶A+還原型鐵氧還蛋白 2-氧代丁酰合成酶 2-氧代丁酸+輔酶A+氧化型鐵氧還蛋白2輔酶A+輔酶輔酶A-二硫還原酶輔酶A-二硫+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出異檸檬酸的濃度大小測定結果。
2. —種異檸檬酸測定試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、2_氧代丁酰合成酶、輔酶A-二硫還原酶、丙 酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、2_氧代丁酰合成酶、輔酶A-二硫還原酶、丙 酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶、丙酰輔酶A、還 原型鐵氧還蛋白組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、異檸檬酸脫氫酶、2-氧代丁酰合成酶、輔 酶A-二硫還原酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、2-氧代丁酰合成酶、輔酶A-二硫還原酶、丙 酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、2_氧代丁酰合成酶、輔酶A- 二硫還原酶、丙 酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、輔酶、丙酰輔酶A、還 原型鐵氧還蛋白組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、2-氧代丁酰合成酶、輔酶A-二硫還原酶組 成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、異檸檬酸脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、2-氧代丁酰合 成酶、輔酶A-二硫還原酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白在試劑1、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。
6. 根據權利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩定劑l-4000mmo1/ L或O. 1% _100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇 (Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。2_氧代丁酸+輔酶A+氧化型鐵氧還蛋白緩沖液 穩定劑 輔酶異檸檬酸脫氫酶 2_氧代丁酰合成酶 輔酶A- 二硫還原酶 丙酰輔酶A 還原型鐵氧還蛋白
全文摘要
本發明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯法技術的異檸檬酸測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、丙酰輔酶A、還原型鐵氧還蛋白、異檸檬酸脫氫酶、2-氧代丁酰合成酶、輔酶A-二硫還原酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
文檔編號G01N35/00GK101793765SQ200910028530
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優先權日2009年2月4日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司