專利名稱：：化妝品抗氧化能力的綜合評價方法
技術領域：
：本發明涉及對護膚品、護理品等化妝品的性能評價，尤其涉及化妝品抗氧化(抗衰老)能力的綜合評價方法。
背景技術：
：通常，活性氧(ROS)和活性氮(NOS)包括氧離子、自由基、過氧化物等有機物和無機物，這些粒子由于含有未成對的電子，極不穩定，具有很強的活性。環境中主要存在的ROS/NOS包括過氧化自由基、羥基自由基、超氧化物、單線態氧及過氧亞硝基。由于人的皮膚經常暴露在環境中，容易受到各種自由基的侵害，對皮膚造成有害的影響。ROS/NOS的清除劑(抗氧化物)能夠提供配對電子，穩定那些處于活躍狀態的自由基。通過消除ROS/NOS，抗氧化物能有效防御環境中的活性氧/活性氮，對人體皮膚起到保護作用。因此，生產商開始在化妝品(如護膚品、防曬油、防曬霜等)當中添加抗氧化物質，以抵抗環境中廣泛存在的活性氧/活性氮等。鑒于此，化妝品制造商及廣大消費者都希望通過某種技術方法了解所生產或使用的化妝品的抗氧化能力。同時，由于化妝品具有特有的化學配方并且直接涂抹在皮膚上，他們都希望了解化妝品在直接涂抹于皮膚狀態時所具備的抗氧化能力。傳統的評價化妝品抗氧化能力的方法，如US專利7，132，296，是將其溶解在一定的化學試劑中，或加入增溶劑、提取液等。這些方法破壞了化妝品原有的化學配方，不能評價其保持原有狀態并直接涂抹到皮膚時的抗氧化能力。而且，傳統的評價方法主要針對某一種ROS/NOS而使用單一的檢測劑，只能評價化妝品針對某一種自由基的抗氧化能力。衰老理論指出，皮膚衰老主要是皮膚細胞中各種活性自由基長期積累造成的，因此，需要有一系列的方法來評價化妝品對各種活性氧/活性氮的抗氧化能力，各方法抗氧化能力的總和稱為抗衰老系數APF。據申請人所知，目前尚無APF的綜合評價方法。
發明內容本發明的目的是克服現有技術存在的不足，提供一種化妝品抗氧化能力的綜合評價方法。為實現本發明的目的，化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，依次采用以下步驟進行配置乳液狀基質，將化妝品樣品溶解在不同的基質中并混勻，加入針對不同自由基的檢測劑以及對應的活性氧/活性氮產生劑，在樣品存在時、標準品存在時和空白狀態下，分別檢測溶液當中檢測劑的熒光強度隨時間的變化值，計算各種檢測劑被氧化的初始反應速率，得出化妝品針對各種自由基的抗氧化能力，上述幾個數值相加，得出化妝品的抗氧化系數APF值。進一步地，上述的化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其中，所述APF值由ORAC、HORAC、NORAC、SORAC、SOAC中的一個或多個值相加得到。更進一步地，上述的化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其中，所述標準品溶液包含檢測劑、已知抗氧化能力的標準品和基質，所述空白溶液包含檢測劑和基質；所述基質包含油、水及表面活性劑。更進一步地，上述的化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其中，所述表面活性劑為十二烷基硫酸鈉、甲基溴化銨或十二烷基銨。更進一步地，上述的化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其中，所述檢測劑為針對過氧化自由基和羥基自由基的DHR-6G，針對過氧亞硝基的DHR-123，針對超氧陰離子及單線態氧的HE。再進一步地，上述的化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其中，所述活性氧/活性氮產生劑包括產生過氧化自由基的AAPH，產生羥基自由基的CoF2/Pa/H202，產生過氧化亞硝基的SIN-3，產生超氧陰離子的Xanthine/Xanthineoxidase,產生單線態氧的LithiumMolybate/sodiumhydroxide/hydrogenperoxide。采用本發明技術方案，能夠在保持化妝品原有配方和狀態的前提下，評價化妝品針對各種自由基的抗氧化能力，通過抗氧化(抗衰老)系數APF表示其總抗氧化能力的高低。其準確性和綜合性，是現有技術所無法比擬的，可廣泛應用于各種護膚品和護理品，如防曬油、防曬霜、清潔霜、面膜、洗發液、護發素，等化妝品的抗氧化能力的綜合評價，其具體應用形式包括但不限于試劑盒、試紙、試劑棒等。圖1是初始階段熒光強度隨時間變化的斜率，即初始反應速率(圖中，橫坐標時間，分；縱坐標熒光強度；InitialRate:初始速率)；圖2是標準品的Vl/V2隨其濃度變化的線性圖3是針對過氧自由基，分別在樣品存在時、標準品存在時及空白狀態下，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線；圖4是針對羥基自由基，分別在樣品存在時、標準品存在時及空白狀態下，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線；圖5是針對過氧亞硝基，分別在樣品存在時、標準品存在時及空白狀態下，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線；圖6是針對超氧陰離子，分別在樣品存在時、標準品存在時及空白狀態下，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線；圖7是針對單線態氧，分別在樣品存在時、標準品存在時及空白狀態下，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明技術方案作進一步說明。這些例子僅是一些應用范例，不能理解為對本發明權利要求保護范圍的一種限制。前面背景部分說過，傳統的檢測化妝品抗氧化能力的方法主要是在待測樣品中加入各種化學物質，增溶劑和提取溶液等。然而，這些方法改變或破壞了化妝品原有的化學配方。因此，傳統的檢測方法不能用于檢測化妝品樣品。并且，傳統的方法只使用針對一種活性氧或活性氮敏感的檢測劑，不能綜合評價化妝品的抗氧化能力。相比之下，本發明建立一種綜合評價化妝品抗氧化能力的方法，同時又保持了化妝品原有配方，并且包括了生產商及消費者關心的環境中主要的活性氧/活性氮。該方法使用針對各種自由基的一系列檢測劑，然后選用對應的自由基產生劑。該技術方法包括配置各種基質，分別溶解樣品，加入對應的檢測劑，活性氧/活性氮產生劑，檢測在樣品存在時，標準品存在時及空白狀態下各自熒光強度隨時間變化的情況。計算各檢測劑被氧化的初始反應速率，得出樣品在各檢測劑下針對各種自由基的抗氧化值。最后，匯總得出抗衰老系數(APF)。此APF值由下列一個或多個值相加得到ORAC(抗過氧化自由基的值)，HORAC(抗羥基自由基的值)，NORAC(抗過氧亞硝基的值)，SORAC(抗超氧陰離子的值)，SOAC(抗單線態氧的值)。檢測劑不含蛋白質，可提供氫原子，包括Dihydrorhodamine-6G(DHR畫6G)，Dihydrorhodamine-123(DHR-123)，hydroethidine(HE)。依據活性氧/活性氮的不同種類選擇相應的檢測劑檢測劑DHR-6G針對過氧化自由基和羥基自由基；DHR-123針對過氧亞硝基；HE針對超氧陰離子及單線態氧。活性氧/活性氮產生劑用來產生活性氧/活性氮。2,2-Azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride(AAPH)產生過氧^f七自由基，cobaltfiiloride/picolinicacid/hydrogenperoxide(CoF2/Pa/H202)產生羥基自由基，3-morpholinosyndnoniminehydrochloride(SIN-3)產生過氧化亞石肖基，Xanthine/Xanthineoxidase產生超氧陰離子，LithiumMolybate/sodi腿hydroxide/hydrogenperoxide產生單線態氧。樣品溶解在每種基質中，用混合器或乳化器混勻。每一種基質都由油、水及表面活性劑組成。標準品(包括VE)具有已知的抗氧化能力。標準品溶液包含檢測劑、己知抗氧化能力的標準品和基質；空白溶液包含檢測劑和基質。本發明提供評價化妝品針對環境中幾種主要的ROS/NOS的抗氧化能力的一系列方法。這里用抗氧化系數(APF)表示。表1是本發明評價方法所使用的幾種檢測劑和自由基產生劑。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>此方法評價化妝品的抗氧化能力，其過程包括以下步驟配置基質，樣品通過混合器或乳化器均勻溶解在基質中。基質由油(如亞油酸甲酯)、水及表面活性劑(如Tween20)組成。該乳液狀基質不會改變或破壞化妝品原有的配方。也可以使用其它不改變或不破壞化妝品原有配方的基質，如油、水及十二烷基硫酸鈉；油、水及甲基溴化銨；油、水及十二垸基銨等。加入檢測劑。理想的檢測劑不含蛋白質，最好能夠提供氫原子。針對環境中不同的ROS/NOS選擇不同的檢測劑，如上表1所示，也可以使用其它非蛋白檢測劑。加入活性氧/活性氮產生劑，用來產生針對以上不同檢測劑的自由基。在樣品存在時、標準品存在時和空白狀態下，分別檢測檢測劑的熒光強度隨時間的變化值。標準品溶液包括檢測劑、標準品和基質，標準品具有己知的抗氧化能力(如VE)。空白溶液由檢測劑和基質組成。計算檢測劑被氧化的初始反應速率。例如，圖1中初始速率V-120指的是初始階段熒光強度變化的斜率。假設自由基產生劑不斷地產生ROS/NOS，ROS/NOS的生成速率恒定并假設為0，生成的ROS/NOS與檢測劑反應或被樣品或標準品清除。檢測劑和活性氧/活性氮反應生成檢測劑的氧化產物。活性氧/活性氮與抗氧化劑反應生成抗氧化劑的氧化產物。假設ROS/NOS的濃度穩定，那么在沒有抗氧化物存在的情況下ROS/NOS的消耗速率方程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>抗氧化劑存在下的ROS/NOS消耗速率方程如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>因為ROS/NOS的消耗速率只由其產生劑決定，得到如下公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>另一方面，在不含抗氧化劑(VI)和含抗氧化劑(V2)時，熒光強度的增加公式分別如方程(4)與(5):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>從上述方程可得出R=V。"—e]2[廳/薦]2+U顛W,[廳/薦]2…(6)因此，熒光強度在不含抗氧化劑(VI)和含有抗氧化劑(V2)時的增長率V1和V2的關系如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>..........................................(7)Vl/V2對抗氧化劑濃度在(0,1)得到線性曲線和截距，以及斜率kanti。xidant/kpr。be[pr0be]2。圖2給出一標準品的Vl/V2隨其濃度變化的圖形121。斜率k反應了樣品的抗氧化能力。斜率越大，抗氧化能力越強。樣品的抗氧化能力計算方程如下Antioxidantcapacity=kSample/kstandard...........................(8)圖3舉例說明針對過氧自由基的ORAC方法中樣品的抗氧化能力。檢測劑和自由基產生劑見表1。樣品存在時，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如122，標準品存在時，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如124。該例中，標準品為370pMVE。空白狀態下，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如126。樣品存在時，標準品存在時，空白狀態下，檢測劑被氧化的初始反應速率分別如曲線128，130，132。用上述(1)到(8)方程計算化妝品樣品的抗氧化能力。圖4舉例說明針對羥基自由基的HORAC方法中樣品的抗氧化能力。檢測劑和自由基產生劑見表1。樣品存在時，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如134，標準品存在時，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如136。該例中，標準品為18.60mMVE。空白狀態下，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如138。樣品存在時，標準品存在時，空白狀態下，檢測劑被氧化的初始反應速率分別如曲線140、142、144。用上述(1)到(8)方程計算化妝品樣品的抗氧化能力。圖5舉例說明針對過氧亞硝基自由基的NORAC方法中樣品的抗氧化能力。檢測劑和自由基產生劑見表1。樣品存在時，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如146,標準品存在時，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如148。該例中，標準品為464|iMVE。空白狀態下，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如150。樣品存在時，標準品存在時，空白狀態下，檢測劑被氧化的初始反應速率分別如曲線152、154、156。用上述(1)到(8)方程計算化妝品樣品的抗氧化能力。圖6舉例說明針對超氧陰離子的SORAC方法中樣品的抗氧化能力。檢測劑和自由基產生劑見表1。樣品存在時，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如158，標準品存在時，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如160。該例中，標準品為2pMVE。空白狀態下，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如162。樣品存在時，標準品存在時，空白狀態下，檢測劑被氧化的初始反應速率分別如曲線164、166、168。用上述(1)到(8)方程計算化妝品樣品的抗氧化能力。圖7舉例說明針對單線態氧的SOAC方法中樣品的抗氧化能力。檢測劑和自由基產生劑見表1。樣品存在時，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如170，標準品存在時，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如172。該例中，標準品為18.60nMVE。空白狀態下，檢測劑熒光強度隨時間的變化曲線如174。樣品存在時，標準品存在時，空白狀態下，檢測劑被氧化的初始反應速率分別如曲線176、178、180。用上述(1)到(8)方程計算化妝品樣品的抗氧化能力。本發明評價化妝品抗氧化能力的方法不需添加其它化學物質，如增溶劑，提取液等。因此，該方法沒有改變或破壞化妝品的原有配方，并且提供了產品使用于皮膚原始狀態下抗氧化能力的評價方法。另外，該方法能夠評價對環境中幾種主要的自由基的抗氧化能力。針對環境中幾種主要的自由基，本發明能夠提供較為全面的抗氧化能力綜合評價方法，得出化妝品的抗氧化系數(APF)。具體包括配置一系列基質，將樣品溶解在不同的基質中混勻，加入針對不同自由基的檢測劑以及針對不同檢測劑的自由基產生劑(見表O，分別檢測樣品存在時、標準品存在時以及空白狀態下，各檢測劑熒光強度隨時間的變化，計算每種檢測劑的初始反應速率(見方程l-8)，得出化妝品針對每種自由基的抗氧化能力，幾種值相加得到APF值。根據本發明一具體實例，某化妝品樣品的APF值由下列幾種方法的抗氧化值相加得到ORAC，HORAC，NORAC，SORAC，SOAC。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>當然，APF值不局限于上述幾種方法值的和，也包含其它類似的抗氧化值。綜上所述，可以得出以下結論本發明能夠針對環境中存在的幾種自由基綜合評價化妝品的抗氧化能力，并得出總抗氧化系數(APF值)。該方法評價結果準確、客觀，可廣泛應用于各類護膚護理用品，其具體應用形式包括但不限于試劑盒、試紙、試劑棒等。權利要求1.化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其特征在于依次包括以下步驟配置乳液狀基質，將化妝品樣品溶解在不同的基質中并混勻，加入針對不同自由基的檢測劑以及對應的活性氧/活性氮產生劑，在樣品存在時、標準品存在時和空白狀態下，分別檢測溶液當中檢測劑的熒光強度隨時間的變化值，計算各種檢測劑被氧化的初始反應速率，得出化妝品針對各種自由基的抗氧化能力，上述幾個數值相加，得出化妝品的抗氧化系數APF值。2.根據權利要求1所述的化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其特征在于所述APF值由ORAC、HORAC、NORAC、SORAC、SOAC中的一個或多個值相加得到。3.根據權利要求1或2所述的化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其特征在于所述標準品溶液包含檢測劑、己知抗氧化能力的標準品和基質，所述空白溶液包含檢測劑和基質；所述基質包含油、水及表面活性劑。4.根據權利要求1或2所述的化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其特征在于所述表面活性劑為十二垸基硫酸鈉、甲基溴化銨或十二垸基銨。5.根據權利要求1或2所述的化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其特征在于所述檢測劑為針對過氧化自由基和羥基自由基的DHR-6G，針對過氧亞硝基的DHR-123，針對超氧陰離子及單線態氧的HE。6.根據權利要求1或2所述的化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，其特征在于所述活性氧/活性氮產生劑包括產生過氧化自由基的AAPH，產生羥基自由基的CoF2/Pa/H202，產生過氧化亞硝基的SIN-3，產生超氧陰離子的Xanthine/Xanthineoxidase,產生單線態氧的LithiumMolybate/sodiumhydroxide/hydrogenperoxide。全文摘要本發明涉及化妝品抗氧化能力的綜合評價方法，通過配置一系列乳液狀基質，將化妝品樣品溶解在不同的基質中并混勻，加入針對不同自由基的檢測劑以及對應的活性氧/活性氮產生劑，分別檢測在樣品存在時、標準品存在時和空白狀態下檢測劑的熒光強度隨時間的變化值，從而計算各種檢測劑被氧化的初始反應速率，從而得出化妝品針對各種自由基的抗氧化能力，進而得到化妝品的抗氧化系數APF值。該方法能夠在保持化妝品原有配方和狀態的前提下，評價化妝品針對各種自由基的抗氧化能力，所得APF值較好地表示了化妝品的綜合抗氧化能力，適用于以試劑盒、試紙、試劑棒等多種形式去評價各類護膚品和護理品。文檔編號G01N21/76GK101672787SQ20091002596公開日2010年3月17日申請日期2009年3月16日優先權日2009年3月16日發明者季紅平,艷寇,張利良,歐博信,近藤美和子申請人:蘇州博思維科生物科技研發中心有限公司