一種檢測樣品或制品中游離聚乙二醇含量的方法

專利名稱：一種檢測樣品或制品中游離聚乙二醇含量的方法
技術領域：
本發明屬于一項利用反相高效液相色譜方法檢測樣品或制品中聚乙二醇殘留的新 方法，也同樣適用于聚乙二醇修飾的樣品或制品的修飾度的檢測。該方法可應用于添加 或修飾有聚乙二醇的生物制品、藥品、食品、化妝品、保健品等的含量分析與檢測。
背景技術：
聚乙二醇是由很多重復的氧乙烷基(-CH2-CH2-0-)結構單元組成的線形或帶支鏈 的中性惰性大分子聚合物，其CAS登記號為25322-68-3。聚乙二醇分子無毒，無免疫 原性和抗原性，其在醫藥工業中的應用不斷擴大，目前已被關國食品與藥物管理局批準 用于醫藥、食品、保健品和化妝品等多個領域。
其中聚乙二醇在醫藥及生物制品中的應用主要包括以下三個方面 (1)聚乙二醇作為一種常用的藥用輔料如應用于眼藥水和栓劑中，以輔助有效藥 物順暢進入體內。在一些固體藥物制劑如藥片中添加適量分子量較大的聚乙二醇可增加 藥物的流動性，并提高藥物有效成分在胃的溶解度從而提高其生物利用度。(2)聚乙二 醇還可應用于生物制品的生產過程，如作為蛋白質純化過程中的添加劑，可以有效提高 蛋白質的回收率，保持蛋白質的生物學活性。聚乙二醇還可以作為包涵體復性的保護劑， 從而避免蛋白質復性中間體的聚集，從而提高蛋白質的復性效率。(3)聚乙二醇對制品 的修飾，也稱長效化，即將活化的聚乙二醇通過化學手段偶聯到蛋白質、多肽、小分子 藥物及脂質體上。修飾后的藥物與母體藥物相比較，在藥物代謝動力學、藥效學方面得 到顯著提升與改善。但對這些制品，尤其是藥品中聚乙二醇含量要進行嚴格的質量控制。 這也就面臨建立樣品或者制品中聚乙二醇含量分析的有效方法問題。目甜國內比較通用 的聚乙二醇含量檢測方法是《中國藥典》(2005版，三部，附錄VIG)規定的分光光度 法，主要是依據聚乙二醇與鋇離子形成復合物進行比色測定。其聚乙二醇含量的檢測限 為微克每毫升。但該方法易受很多因素干擾，不適于一些復雜樣品的分析。且當被分析 的樣品或制品為含有修飾有聚乙二醇的產品時，則此方法不適用。

發明內容
針對上述不足，我們設計了一種利用紫外檢測器聯合蒸發光檢測器，或者二極管陣 列檢測器聯合蒸發光檢測器，利用聚乙二醇與其它成分包括聚乙二醇修飾產物之間極性 的差別，及游離聚乙二醇與非聚乙二醇在上述2種檢測器上信號的不同，優化色譜方法 使之在高效液相色譜上實現分離，甄別出游離聚乙二醇的信號峰，通過外標法回歸，從 而很好的解決了藥典中比色方法測定聚乙二醇含量的方法限制。
本發明的目的在于克服現有技術中對《中國藥典》(2005版，三部，附錄VIG)規 定的分光光度法有干擾體系或者聚乙二醇修飾產品體系。本發明所要解決的技術問題是 利用色譜方法，充分利用聚乙二醇無紫外吸收及聚乙二醇與制品尤其是聚乙二醇修飾制 品間非極性的微弱差別，優化檢測條件，對游離的聚乙二醇和樣品或制品中其它成分進 行鑒別和分離，利用外標法，計算游離聚乙二醇的含量。
本發明所述的檢測樣品或制品中游離聚乙二醇含量的方法，其特征在于采用紫外檢 測器聯合蒸發光檢測器，或者二極管陣列檢測器聯合蒸發光檢測器信號對比，甄別出游 離聚乙二醇信號峰，然后利用外標法對其定量。
上述的檢測方法，其特征在于使用十八垸基硅垸鍵合硅膠為填充劑的反相色譜柱， 分別以含三氟乙酸的乙腈和三氟乙酸的超純水為流動相，釆用210-380納米的紫外進行 波長檢測并與蒸發光檢測信號相對比。
上述的流動相優選采用含體積百分比為0.1 %三氟乙酸的10% 90%乙腈和含體積百 分比為0.1%三氟乙酸的超純水。
上述的紫外檢測器或二極管陣列檢測器的特征檢測波長優選280納米。
上述蒸發光檢測器檢測到樣品或制品中的最大信號峰的吸收值位于儀器檢測范圍 之內。
上述的檢測方法，其特征在于比較樣品或制品在蒸發光檢測器和紫外檢測器，或在 蒸發光檢測器和二極管陣列檢測器的信號的差別，區分聚乙二醇的信號和非聚乙二醇的 信號；利用紫外檢測器或二極管陣列檢測器檢測非聚乙二醇物質的吸收，利用蒸發光檢 測器檢測聚乙二醇的信號。
上述外標法的外標物為聚乙二醇，所用外標聚乙二醇的分子量及多分散度與樣品或 制品中所使用的聚乙二醇相同或相似。
上述的檢測方法在檢測樣品或制品中聚乙二醇含量，或聚乙二醇殘留量或聚乙二醇 修飾度方面的應用，所述樣品或制品選自生物制品、藥品、食品、化妝品或保健品。以下提供本發明的主要分析步驟 1樣品預處理
樣品為水溶液，過0.22^m濾膜；同時估測其中聚乙二醇含量，若高于10mg/ml， 則應用超純水提前稀釋至低于5 mg/ml;若為固體，則應用超純水或者20%的乙腈溶液 溶解且經0.22 ^mi濾膜過濾。 2色譜條件
(1) 色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相色譜柱；當所用聚乙二醇
的分子量為5000道爾頓以下時可用C8柱，當所用聚乙二醇的分子量為5000道爾頓以 上時用C4柱；
(2) 檢測器紫外檢測器與蒸發光檢測器聯用，或二極管陣列檢測器與蒸發光檢 測器聯用；
(3) 檢測波長在210-380納米間掃描優選樣品或制品有效成分的吸收波長；
(4) 流動相以含0.1% (體積百分比)三氟乙酸的乙腈和含0.1% (體積百分比) 三氟乙酸的超純水為流動相；
(5) 柱溫10~60°C。 3濃度計算方法
用與樣品或制品中使用的聚乙二醇分子量與多分散度一致或盡可能相近的聚乙二
醇標準品配制成一定梯度濃度的標準液，20 W體積上樣，按外標法，以蒸發光信號的
峰面積-聚乙二醇進樣濃度做線性回歸，得出線性方程，利用該方程和樣品中聚乙二醇 信號峰面積計算游離聚乙二醇含量。
由于某些樣品或制品中成分比較復雜，所做的樣品反相高效液相色譜圖的紫外信號 峰和蒸發光檢測器信號峰應分別與聚乙二醇標準品的反相高效液相色譜圖及不含游離 聚乙二醇的樣品反相高效液相色譜圖做比對，從而鑒別游離聚乙二醇的蒸發光信號峰
(聚乙二醇在21(T380納米間無紫外吸收或紫外吸收很低)。
本發明的分析方法靈敏度高，重復性、選擇性好，快捷、高效、簡便，適用于成分 較復雜的、對藥典提供的聚乙二醇-鋇離復合物比色法測定受干擾的樣品，尤其是對于 聚乙二醇修飾的樣品或制品非常適用。有效的擴大了聚乙二醇檢測的應用范圍。
本發明的有益效果
該方法主要的優點(l)通過優化色譜洗脫條件，借助紫外檢測器和蒸發光檢測器， 或者二極管陣列檢測器和蒸發光檢測器，對游離的聚乙二醇進行專屬性檢測；最大程度的避免了其它雜質的干擾；(2)該方法能適用于聚乙二醇修飾樣品或聚乙二醇修飾制品 中游離聚乙二醇含量的檢測，這一點是藥典中所述的分光廣度法所不能實現的；(3)該 方法還能從光譜學角度去證明樣品或制品中聚乙二醇殘留去除的是否徹底；為聚乙二醇 在樣品或制品、及在制品的制備工藝中添加的質量控制起到極好的作用；(4)該發明另 一個擴展性益處在于可以通過該方法對多聚乙二醇修飾的大分子量生物制品的聚乙二 醇修飾度進行測定。當分子量較大，在本發明中指分子量大于50000道爾頓的制品，且 經多聚乙二醇修飾時，在本發明中指每個分子修飾高于3條聚乙二醇鏈時，整個制品的 修飾度較難準確測定。該發明可以通過計算加入的活化的聚乙二醇摩爾量，減去檢測的 游離聚乙二醇摩爾量，兩者之差除以大分子母體的摩爾量，從而得出樣品或制品的聚乙 二醇的修飾度，即每個大分子修飾多少條聚乙二醇鏈。


圖1高摩爾倍數聚乙二醇修飾精氨酸酶的反應混合物的譜圖
圖2純化的聚乙二醇修飾的精氮酸酶產品的譜圖
圖3聚乙二醇標準品的濃度-信號峰面積線性回歸圖
圖4低摩爾倍數聚乙二醇修飾精氨酸酶的反應混合物的譜圖
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但不限制本發明 實施例1
檢測樣品為40倍摩爾量的琥珀酰亞胺丙酸活化的單甲氧基聚乙二醇修飾的重組人
精氨酸酶(EC3.5.3.1)，反應在室溫下進行，然后用0.2摩爾/升的檸檬酸調節反應混合 物的pH為4.0。樣品混合物的主要組分為未修飾的重組人精氨酸酶、修飾的重組人精 氨酸酶及水解后的單甲氧基聚乙二醇丙酸。用超純水稀釋反應混合物至單甲氧基聚乙二 醇衍生物的濃度約10-15毫克/毫升。
儀器為安捷倫1200色譜系統Vydac 214TP54 (250x4.6 mm, 5剛，300A)色譜柱， DAD二極管陣列檢測器配合SEDEX75蒸發光檢測器，自動進樣器，四元泵，柱溫箱， 及工作站。
流動相為色譜級的乙腈、三氟乙酸及超純水。
單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸及單甲氧基聚乙二醇(分子量均為20000道爾頓)購自NEKTAR公司。 色譜條件
運行緩沖液含體積百分比為0.1%三氟乙酸的超純水，在本發明中成為緩沖液A;
含體積百分比為0.1%三氟乙酸的乙腈，在本發明中成為緩沖液B;
流速0.5 ml/min
二極管陣列的檢測波長280納米 上樣體積20 Pl
梯度設置0-5 min, 40%緩沖液B; 5-50 min, 40%-55%緩沖液B; 50-55 min, 55%-100%緩沖液B。 柱溫40 °C
記錄色譜圖，見附圖1,定性檢測說明在該體系中有很多聚乙二醇并未實現有效修飾 到精氨酸酶上，即聚乙二醇修飾劑的量遠高于其所需要的量。
實施例2
檢測樣品為用本技術領域內熟知的經凝膠排阻色譜純化的聚乙二醇修飾的重組人 精氨酸酶樣品。儀器為安捷倫1200色譜系統Vydac 214TP54 (250x4.6 mm， 5 wn， 300A) 色譜柱，DAD二極管陣列檢測器配合SEDEX75蒸發光檢測器，3動進樣器，四元泵， 柱溫箱，及工作站。
流動相為色譜級的乙腈、三氟乙酸及超純水。
單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸及單甲氧基聚乙二醇(分子量均為20000道爾 頓)購自NEKTAR公司。
色譜條件-
運行緩沖液含體積百分比為0.1%三氟乙酸的超純水，在本發明中成為緩沖液A;
含體積百分比為0.1%三氟乙酸的乙腈，在本發明中成為緩沖液B;
流速0.5 ml/min
二極管陣列的檢測波長280納米 上樣體積20 14
梯度設置0-5 min, 40%緩沖液B; 5-50 min, 40%-55%緩沖液B; 50-55min, 55%-100%
7緩沖液B。
柱溫40 °C
記錄色譜圖，見附圖2。從圖2中蒸發光檢測器未能檢測出游離聚乙二醇的信號峰， 因此該制品為不含游離聚乙二醇的精氨酸酶聚乙二醇修飾產物。該目標產物，及聚乙二 醇修飾的精氨酸酶的純化方法有效，制品純凈。但如果利用要點法規定的比色法，由于 目標蛋白精氨酸酶上修飾有聚乙二醇，因此也能與鋇離子反應，從而不能判斷是否純化 的樣品中含有游離的聚乙二醇。
實施例3
利用該發明檢測反應混合物中游離聚乙二醇的含量。
標準樣品為購自NEKTAR公司的單甲氧基聚乙二醇，分子量為20000道爾頓。待分 析樣品如實施例1中所制備的反應混合物，只是聚乙二醇琥珀酰亞胺丙酸/蛋白質的摩爾 比為10: 1，聚乙二醇濃度為12mg/ml。所有樣品均經0.45 nm濾膜過濾，計算待分析 樣品中游離聚乙二醇濃度(加入的聚乙二醇摩爾量除以反應液體積)，用超純水稀釋聚 乙二醇的濃度低于5毫克/毫升。同樣，配5236系列稀釋濃度的單甲氧基聚乙二醇標準 溶液，依下述色譜條件進行分析，并記錄色譜圖，利用安捷倫化學工作站對目標譜圖積 分計算。
色譜條件-
運行緩沖液含體積百分比為0.1%三氟乙酸的超純水，在本發明中成為緩沖液A;
含體積百分比為0.1%三氟乙酸的乙腈，在本發明中成為緩沖液B; 流速0,5 ml/min
二極管陣列的檢測波長280納米 上樣體積20 W
梯度設置0-5 min， 40%緩沖液B; 5-50 min, 40%-55%緩沖液B; 50-55 min, 55%-100%緩沖液B。 柱溫40 。C
不同濃度單甲氧基聚乙二醇(分子量20000道爾頓)對相應蒸發光信號面積的歸一 化圖見圖3，反應混合物的圖譜見圖4。聚乙二醇標準的線性回歸方程為Y=62830*x-76766， R=0.998
Y為聚乙二醇在蒸發光檢測器信號峰面積，X為聚乙二醇濃度，單位為毫克/毫升， R為相關系數。
將圖4中標識的水解單甲氧基聚乙二醇丙酸的峰面積利用安捷倫化學工作站積分， 然后對比標準曲線計算游離甲氧基聚乙二醇丙酸的濃度。 計算公式如下
C游離-[ (Y+76766) *Z]/62830
C ,,:樣品或制品中有力的聚乙二醇濃度；Y:游離聚乙二醇在蒸發光檢測器上的信 號峰面積；Z:稀釋因子
在本例，聚乙二醇的起始濃度為12mg/ml (6*l(T7mol/l)，計算出反應混合物中游離 的聚乙二醇濃度為3mg/ml (1.5*l(T7mol/l)，可知體系中有4.5*1(T7 mol/1的活化的聚乙 二醇修飾到4."l(y8niol/l的精氨酸酶上，由聚乙二醇摩爾量與精氨酸酶摩爾量比，即可 得出蛋白的修飾度為ll，即每個精氨酸酶分子修飾11條聚乙二醇鏈。由于精氨酸酶的 分子量約為105000道爾頓，再修飾有11條分子量為20000道爾頓的聚乙二醇分子，是 一個非常龐大的分子。因此很難通過電泳技術、飛行時間質譜技術檢測，因此該發明有 效的解決了大分子修飾度的問題。
其具體數據見表l。
起始聚 乙二醇 濃度游離聚乙二 醇的信號峰 面積樣品的 稀釋倍 數z游離的聚 乙二醇濃 度修飾上的聚 乙二醇摩爾 濃度精氨酸酶 的摩爾濃 度精氨酸酶 的修飾度
12 (mg/ml)1752023 (mg/ml)4.5-7 mol/14." mol/111
表1
9
權利要求
1、一種檢測樣品或制品中游離聚乙二醇含量的方法，其特征在于采用紫外檢測器聯合蒸發光檢測器，或者二極管陣列檢測器聯合蒸發光檢測器，對比兩者信號差異，甄別出游離聚乙二醇信號峰，然后利用外標法對其定量。
2、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑 的反相色譜柱，分別以含三氟乙酸的乙腈和三氟乙酸的超純水為流動相，采用 210-380納米的紫外進行波長檢測并與蒸發光檢測信號相對比。
3、 根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于流動相采用含體積百分比為O.P/。三氟 乙酸的10% 90%乙腈和含體積百分比為0.1%三氟乙酸的超純水。
4、 根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述的紫外檢測器或二極管陣列檢測 器的特征檢測波長為280納米。
5、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于蒸發光檢測器檢測到樣品或制品中的 最大信號峰的吸收值位于儀器檢測范圍之內。
6、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于比較樣品或制品在蒸發光檢測器和紫 外檢測器，或在蒸發光檢測器和二極管陣列檢測器的信號的差別，區分聚乙二醇的 信號和非聚乙二醇的信號；利用紫外檢測器或二極管陣列檢測器檢測非聚乙二醇物 質的吸收，利用蒸發光檢測器檢測聚乙二醇的信號。
7、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述外標法的外標物為聚乙二醇，所 用外標聚乙二醇的分子量及多分散度與樣品或制品中所使用的聚乙二醇相同或相 似。
8、 權利要求1~7中任一項所述的檢測方法在檢測樣品中聚乙二醇含量，或聚乙二醇殘 留量或聚乙二醇修飾度方面的應用。
9、 權利要求8所述的用途，其特征在于所述樣品為生物制品、藥品、食品、化妝品或 保健品。
全文摘要
本發明公開了一種反相高效液相色譜測定樣品或制品中游離聚乙二醇含量的方法，其特征在于利用聚乙二醇與其它物質在反相色譜柱上非極性的差別，采用紫外檢測器聯合蒸發光檢測器，或者二極管陣列檢測器聯合蒸發光檢測器信號對比，甄別出游離聚乙二醇信號峰，然后利用外標法對其定量。基于此方法，本發明的應用還可擴展到檢測聚乙二醇修飾產物的純度及修飾產物的修飾程度。本發明的分析方法靈敏度高，重復性、選擇性好，快捷、高效、簡便，適用于成分較復雜的、對藥典提供的聚乙二醇-鋇離復合物比色法測定受干擾的樣品，尤其是對于聚乙二醇修飾的樣品或制品非常適用。
文檔編號G01N30/74GK101493446SQ20091002500
公開日2009年7月29日 申請日期2009年2月16日 優先權日2009年2月16日
發明者于鵬展, 秦國宏, 丹 覃 申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司