專利名稱：：一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法，屬于生物檢測
技術領域：
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背景技術：
：蛋白質芯片，又稱蛋白質微陣列，是繼基因芯片之后發展起來的以蛋白質為研究對象的生物檢測技術，它為研究生命活動開辟了更為廣闊的前景，提供了新型有效的研究手段。相比DNA，蛋白質的化學成分、結構和功能更為復雜多變，固定在微陣列載體表面的蛋白質容易變性失活，因此尋找合適的載體和表面修飾方法以使單位面積上固定足夠量的蛋白質并保持其天然構象是制備高質量蛋白質芯片的關鍵問題。目前制作蛋白芯片的載體有很多種，如玻璃片、硅片、金片、聚丙烯酰胺膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等(《.r,/加權Kt/柳'，朋c///JW/2W-260A其中玻璃片由于具有廉價、表面光滑、熒光背景低、性能穩定等諸多優點，成為制備蛋白質芯片的首選。但玻璃片的表面修飾使之具有高的蛋白固定量并保持原有功能的結構狀態一直是人們要解決的首要問題。玻璃片的修飾方法有很多，如戊二醛修飾法、聚賴氨酸修飾法、巰基修飾法、多糖修飾法等，按其在玻片表面形成的結構可分為兩大類第一類是醛基、氨基、環氧基、羧基等形成的二維修飾表面，這類大多是通過共價鍵或特殊分子間的高親合力把蛋白固定在其表面，蛋白質結合牢固。此法制作簡單，成本較低，點樣均一，目前應用比較廣泛，但其蛋白質的固定量不理想，敏感度較低，最低檢測限較高。第二類是聚丙烯酰胺、瓊脂糖、硝化纖維等在玻片表面包被一層凝膠或樹突狀多聚物，然后再在這些基質上引入活性基團，從而在玻片表面形成三維立體結構。此類載體由于具有三維多孔結構，載體表面和蛋白質探針的接觸面積大大增加，因此蛋白的固定量比二維平面載體大得多，但這類載體主要依靠物理吸附固定蛋白，由于與蛋白間缺少強的鍵合導致蛋白質在反復沖洗過程中易流失。因此引入新的思路與方法對蛋白質芯片表面進行處理，使之具有蛋白固定量大、活性高、工藝簡單、成本低、易推廣等特點仍是蛋白質芯片領域亟待解決的重要問題。發明目的和內容本發明的目的在于克服上述現有技術的缺點，提供一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法。本發明采用LB法或簡單的提拉法在玻片表面鍍上聚苯乙烯微球膜以增大玻片的比表面積，再用有機硅垸對其進行進一步的修飾，利用氨基、巰基與蛋白質間的共價鍵作用實現與蛋白質的牢固結合，具有蛋白質固定量大、活性高、成本低等特點。本發明制備方法的技術方案如下本發明蛋白質芯片玻璃載體的制備方法，具體工藝為玻璃載體經預處理后，首先采用LB法(Langmuir-Blodgett法)或簡單的提拉法在其表面鋪上聚苯乙烯微球單層膜；然后，用有機硅烷對其進行進一步的修飾；最后，干燥即可。上述玻璃載體預處理工藝將玻璃載體在重鉻酸鉀洗液中浸泡424h，用超純水沖洗干凈后干燥備用。所述聚苯乙烯微球的粒徑為200-400nm，采用以下工藝制備-將SDS(十二烷基硫酸鈉)與KPS(過硫酸鉀)以摩爾比0.20.9:1溶解于140mL醇水混合溶液中(醇水體積比為0-l:1)，在N2保護下攪拌30min;然后將該體系置入7(TC水浴中，加熱攪拌10min后，加入610mL苯乙烯(St)單體，反應10h后，收取產物乳液，過濾，干燥，即可獲得聚苯乙烯微球。所述在玻璃載體上鋪設聚苯乙烯微球單層膜的LB方法，其具體工藝為將上述制備的聚苯乙烯微球分散至體積比為1:1的水-乙醇溶液中，然后量取一定量的溶液將其均勻分散在水T超純水)—面上，待乙醇溶劑蒸發后，控制表面壓值達到10~35mN/m時，將玻璃載體固定在垂直升降的提拉結構上開始拉膜，提拉速度1-10mm/min;膜層成型后干燥即可獲得聚苯乙烯微球單層膜。所述在玻璃載體上鋪設聚苯乙烯微球單層膜的普通提拉法，其具體工藝為將上述制備的聚苯乙烯微球分散至體積比為1:1的水-乙醇溶液中，將玻璃載體浸入該溶液中，以l-10mm/min的速度向上提拉；膜層成型后干燥即可獲得聚苯乙烯微球單層膜。玻璃載體用聚苯乙烯微球單層膜修飾后，再用有機硅垸對其進行進一步的修飾。具體工藝為將已覆蓋聚苯乙烯微球單層膜的玻璃載體放入有機硅垸溶液中，浸泡310分鐘后干燥即可。上述有機硅烷溶液是體積濃度為0.5~10%的氨基硅烷醇類溶液、體積濃度為0.5~10%的巰基硅烷醇類溶液的混合溶液或其中之一。按本發明方法制備的蛋白質芯片玻璃載體與現有制備技術相比，具有以下優點(1)蛋白質固定率高，在優化條件下，蛋白質的固定率可達96%。(2)所得的蛋白質芯片的信噪比高，最高可達2.98。(3)所得的芯片能與蛋白質實現較強的結合。^圖1-一本發明所得的聚苯乙烯微球的掃描電鏡照片圖2—LB法制備的聚苯乙烯微球單層膜的模壓曲線圖3—LB法制備的聚苯乙烯微球單層膜的原子力顯微鏡照片圖4--無聚苯乙烯微球單層膜修飾的玻片固定巰基硅烷的原子力顯微鏡照片圖5--用聚苯乙烯微球單層膜修飾的玻片固定巰基硅烷的原子力顯微鏡照片圖6--氨基硅烷修飾聚苯乙烯微球膜的玻片洗滌前熒光圖像圖7--氨基硅垸修飾聚苯乙烯微球膜的玻片洗滌后熒光圖像圖8--氨基硅垸修飾聚苯乙烯微球膜的玻片的熒光強度具體實施例方式實施例1:(1)載玻片的預處理將載玻片浸入重鉻酸鉀洗液中浸泡24h,用超純水沖洗干凈后，烘干備用。(2)聚苯乙烯球的制備將0.075gSDS，0.2gKPS，溶解于140mL醇水混合溶液(醇水體積比為2:5)中，在N2保護下攪拌30min，然后將該體系置入70'C水浴中，攪拌10min后加入7mL苯乙烯(St)單體，反應10h，收取產物乳液，抽濾，干燥后備用。所得產物見附圖1。從附圖1中可以看出本發明制備的聚苯乙烯微球分散性好，粒徑均勻，大約在200nm左右，球體完整無明顯的破損，無團聚。(3)聚苯乙烯微球單層膜的制備(LB法)0.5g干燥的聚苯乙烯微球分散至lOmL體積比為1:1的水-乙醇溶液中，然后用微量注射器量取一定量的溶液將其均勻分散在水面(超純水)上，待溶劑蒸發后，啟動LB拉膜儀的滑障使其緩慢移向中間位置，并測定表面壓(見附圖2)。由附圖2可以看出，PS微球可以在水面上鋪展形成單層膜，而且成膜效果較好。當表面壓為15mN/m時滑障達到安全閥位置，膜壓停止上升。將預處理后的載玻片固定在垂直升降的提拉結構上開始拉膜，提拉速度2mm/min。膜層成型后干燥即可獲得聚苯乙烯微球單層膜(見附圖3)。從附圖3中可清晰看到玻片表面有一層PS球，它們呈六方密堆積排列，球的尺寸約200nm，與圖1掃描電鏡的結果相符。(4)聚苯乙烯微球單層膜的進一步修飾將按上述工藝修飾后的玻片置入1%的氨基硅烷乙醇溶液中，浸泡10分鐘。烘干后得到本發明所述的蛋白質芯片載體。通過附圖4-5的AFM(原子力顯微鏡)照片可以發現鋪有PS膜的玻片經巰基硅烷修飾后，玻片表面更加凹凸不平，玻片比表面積顯著增大，單位面積內固定的巰基硅烷明顯增多，巰基硅烷多分布在PS球的周圍。(5)芯片的固定率及反應性將Cy3標記的山羊抗兔IgG(lmg/mL)按2000倍的比例稀釋，點樣于玻片形成陣列，然后置于37'C孵育lh，用Ecoscan熒光掃描儀獲取熒光圖像，測定并取其平均灰度值(A!)。再將玻片取出后，用含0.2%PBST振蕩洗滌，除去未結合抗體，晾干，再用Ecoscan熒光掃描儀獲取熒光圖像，測定其顯色強度并取其均值(A2)。固定率二A2/AiX1000/0。用氨基硅垸修飾200nm聚苯乙烯微球膜的玻片洗滌前后熒光圖如附圖6-7所示。由附圖可見，該玻片點樣點圓潤、清晰，無明顯拖尾現象，熒光背底也不是很強，即使洗滌以后，點樣點形狀依舊保持得很好。這表明修飾后的玻片對蛋白有著很強的固定性。經計算氨基硅烷修飾的200nm聚苯乙烯球膜的玻片固定率能夠達到96.8%。將空白兔血清按10000倍的比例稀釋后，點樣于玻片表面，37'C孵育lh，ffl0.2%PBST振蕩洗滌，晾干。玻片上加1%小牛血清蛋白，以封閉未反應的醛基，孵育1h后用含0.2%PBST振蕩洗滌玻片。加入1:1000倍稀釋的Cy3標記的羊抗兔IgG(lmg/mL)，37'C孵育1h，洗滌玻片，方法同上。掃描并測定其顯色強度。氨基硅烷修飾200nm聚苯乙烯微球膜的玻片的熒光強度見附圖8。由附圖可知，該玻片在測試中熒光背底比較低，點樣點熒光強度高，可以推斷該反應蛋白活性較高并且反應具有良好的信噪比。經計算，氨基硅烷修飾的200nm聚苯乙烯球膜的玻片的熒光強度為68.7，信噪比高達2.08。實施例2:(1)載玻片的預處理將載玻片浸入重鉻酸鉀洗液中浸泡10h，用超純水沖洗干凈后，烘干備用。(2)聚苯乙烯球的制備將0.15gSDS，0.25gKPS，溶解于140mL醇水混合溶液(醇水體積比為2:5)溶液中，在N2保護下攪拌30min,然后將該體系置入7(TC水浴中，攪拌10min后加入5mL苯乙烯(St)單體，反應10h，收取產物乳液，抽濾，干燥后備用。(3)聚苯乙烯微球單層膜的制備(普通提拉法)0.5g干燥的聚苯乙烯微球分散至10mL體積比為1:1的水-乙醇溶液中，將預處理后的載玻片浸入該溶液中，以3mm/min的速度向上提拉。膜層成型后干燥即可獲得聚苯乙烯微球單層膜。(4)聚苯乙烯微球單層膜的進一步修飾將按上述工藝修飾后的玻片置入1°/。的氨基硅烷乙醇溶液中，浸泡10分鐘。烘干后得到本發明所述的蛋白質芯片載體。—(5)芯片的固定率及反應性將Cy3標記的山羊抗兔IgG(lmg/mL)按2000倍的比例稀釋，點樣于玻片形成陣列，然后置于37'C孵育4h，測其固定率可達91.63%。將空白兔血清按10000倍的比例稀釋后，點樣于玻片表面，37'C孵育4h，用0.2%PBST振蕩洗滌，晾干。玻片上加1。/。小牛血清蛋白，以封閉未反應的醛基，孵育4h后用含0.2%PBST振蕩洗滌玻片。加入1:1000倍稀釋的Cy3標記的羊抗兔IgG(lmg/mL)，37。C孵育4h，測其熒光強度為56.7，信噪比為2.98。其它實施例如下制備工藝同實施例1和2，其工藝技術參數如下表所示。制備工藝3456載玻片的預處理重鉻酸鉀洗液浸泡時間(h)481220聚苯乙烯球的制備SDS:KPS(mol)0.230.60.70.9醇水混合溶液醇水體積比0:10,2:10.6:10.8:1苯乙烯單體的體積(mL)68910法表面壓值18202530提拉速度1345聚苯乙烯微球單層膜的進一步修飾有機硅烷溶液氨基硅烷醇類溶液體積濃度(％)23巰基硅烷醇類溶液-體積濃度(％)0.51.523浸泡時間(分鐘)3568制備.r.藝78910載玻片的預處理重鉻酸鉀洗液浸泡時間(h)481220聚苯乙烯球的制備SDS:KPS(mol)0.230.60.70.9醇水混合溶液醇水體積比0:10.2:10.6:10.8:1苯乙烯單體的體積(mL)68910普通提拉法聚苯乙烯微球的濃度(g/mL)51310提拉速度(mm/min)4568<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求1、一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法，其特征在于玻璃載體經預處理后，以LB法(Langmuir-Blodgett法)或簡單的提拉法在其表面鋪上聚苯乙烯微球單層膜；然后，用有機硅烷對其進行進一步的修飾；最后，干燥即可。2、如權利要求1所述的一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法，其特征在于所述玻璃載體預處理工藝將玻璃載體在重鉻酸鉀洗液中浸泡424h，用超純水沖洗干凈后干燥即可。3、如權利要求l所述的一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法，其特征在于所述的聚苯乙烯微球粒徑為200~400nm，采用以下工藝制備-將SDS(十二烷基硫酸鈉)與KPS(過硫酸鉀)以摩爾比0.20.9:1溶解于140mL醇水混合溶液中(醇水體積比為01:1)，在N2保護下攪拌30min;然后將該體系置入70'C水浴中，加熱攪拌10min后，加入610mL苯乙烯(St)單體，反應10h后，收取產物乳液，過濾，干燥，即可獲得聚苯乙烯微球。4、如權利要求l所述的一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法，其特征在于所述在玻璃載體上鋪設聚苯乙烯微球單層膜的LB方法，其具體工藝為將聚苯乙烯微球分散至體積比為1:1的水-乙醇溶液中，然后量取一定量的溶液將其均勻分散在水(超純水)面上，待乙醇溶劑蒸發后，控制表面壓值達到10~35mN/m時，將玻璃載體周定在垂直升降的提拉結構上開始拉膜，提拉速度1-10mm/min;膜層成型后干燥即可獲得聚苯乙烯微球單層膜。5、如權利要求l所述的一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法，其特征在于所述在玻璃載體上鋪設聚苯乙烯微球單層膜的普通提拉法，其具體工藝為將聚苯乙烯微球分散至體積比為1:1的水-乙醇溶液中，將玻璃載體浸入該溶液中，以l-10mm/min的速度向上提拉；膜層成型后干燥即可獲得聚苯乙烯微球單層膜。6、如權利要求l所述的一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法，其特征在于所述玻璃載體用聚苯乙烯微球單層膜修飾后，再用有機硅垸對其進行進一步的修飾，即將已覆蓋聚苯乙烯微球單層膜的玻璃載體放入有機硅烷溶液中，浸泡3一0分鐘后干燥即可。7、如權利要求6所述的一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法，其特征在于所述有機硅烷溶液是體積濃度為0.5~10°/。的氨基硅烷醇類溶液、體積濃度為0.5~10%的巰基硅垸醇類溶液的混合溶液或其中之一。全文摘要本發明涉及一種蛋白質芯片玻璃載體的制備方法，屬于生物檢測
技術領域：
。本發明制備方法首先以LB法或簡單提拉法在預處理后的玻片表面鋪上聚苯乙烯微球單層膜，再用有機硅烷對其進行進一步的修飾，干燥后即可獲得蛋白質芯片玻璃載體。本發明利用氨基、巰基與蛋白質間的共價鍵作用實現與蛋白質的牢固結合。本發明制備的蛋白質芯片玻璃載體蛋白質固定率高，可達96％；信噪比高，可達2.98；芯片與蛋白質結合牢固。文檔編號G01N33/551GK101672847SQ200910019530公開日2010年3月17日申請日期2009年9月30日優先權日2009年9月30日發明者娜于,妍單,陳克正申請人:青島科技大學