專利名稱：一種沙丁胺醇酶聯免疫檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于檢測動物組織、飭沐斗^M液中的沙丁胺,物殘留量的,免疫檢測試劑盒，屬于獸藥殘留的檢測分析技術領域。
背景技術：
沙丁胺醇是一種e—興奮劑類藥物，迄今為止，人們已經合成了克倫特羅
(clenbuterol)、卡布特羅(carbuterol)、萊克多巴胺(ractopamine)、沙丁胺醇(salbut譜l)等十余種e —條劑。P —絲劑影響營##/質在動物體內的流向和分配，具有^Wl肉組織生長，斷邸同體脂肪含量，提高瘦肉率以及增加瘦肉產量的作用，
因此在歐美地區曾經^nas用。但是，P —^^劑具有類似腎上腺素的化學結構及作
用機理，能與細lfi^面的0-受體結合而引起心悸、頭疼、目眩、惡心、嘔吐、麟、神鄉S1敏、血管擴張、心率加快等生理反應，而J^人與動物的肝聘內臟器官具有毒副作用。現在歐美各國均禁止雜畜^^上的卿，美國規定只倉^于禾浙if，我國有
關部門也將e —^^劑類藥物列入了《食品動物禁用的獸藥及其他化^tr凊單》。但是
^^濟利益的驅動，在畜牧^中^^#在違規{頓1^，導致部分動物產品的禁用藥物殘留S1高，難以超lj發達國家的要求，損害了我國畜禽產品的聲譽，制約了^h產業的繊賺。為了實現畜Wk的^^M，維護人們的 ，我國正不斷加大i^15物的檢測力度，制定更為嚴格的法辦嫩范措施。目前，對于P —X^劑藥物的殘留檢測方法主魏高效液相色譜法、氣相色譜法、液相—質譜糊體。這些雄的特點是準確、穩定、可靠，但缺點同樣明顯，即儀激去所用儀器設備往往價格昂貴，結構錢,需要專門的操作人員，戶萬以乂OT于S&t湯操作，而且儀微去所需的各種^瞎易造，境污染。
發明內容
本發明的目的^f共一種沙丁胺醇,免疫檢測WFU^:其i^，它能劃艮現有技術的J:M缺點。
一種沙丁胺醇W^免疫檢測淑U盒，有^^體，辦征在于盒體內駭(l)包被有沙丁胺醇包l皿原的,示板、(2)酶iH己的,體、(3)沙丁胺||#異性多克隆抗體、(4)沙丁S安醇標準品溶液、(5) M^冼滌液、(6)，復溶液、(7)底物顯色液A、 (8)底物顯色液B、 (9)終止液。±^沙丁胺醇 ^免疫檢測試劑盒在于檢測動物組織、飼料&^液中沙丁胺M留 量中的應用。
本發明結構簡單、價格低廉，易于攜帶，^ffi,單',，便于現場操作。
附圖為本發明沙丁胺醇酶聯免疫檢測試劑盒的標準曲線圖。
具體實施例方式
本發明沙丁胺醇酉1^免疫銜則 瞼有~^:體，^#征在"？^:體內 : (i)包被 有沙丁胺醇包1 原的 ^板、(2)^ti己的^c體、(3)沙丁胺,異性多克隆抗體、
(4)沙丁月安Ht示準品^^、 (5)M^fe滌液、(6)M復、溶液、(7)底物顯色液A、 (8) 底物顯色液B液、(9)終止液。
本發明中所述的沙丁胺醇包被抗原為采用重氮化法將鹽酸克你待羅半抗原與載體 卵清蛋白進行偶聯得到的，所述的酶標板優選96孔,示板。
制備包被有沙丁胺醇包， 原的1斜示板時
(1) 用復溶工作液(0.015mol/L pH=9.5)將沙丁胺醇半抗原與載體蛋白(卵清 蛋白離牛血清蛋白)的偶MW成包被液(偶微濃度為2.5ug/mL 20ug/mL)，其 中載體蛋白雌卵清蛋白，偶微工作液濃度雌10ug/mL;
(2) 向96孑L^if舨的射L中力口入100uL包Wt原工作液，置37。C環境下溫育2 4h，或者置于4。C環境下靜ibl夜，傾魏被液，用洗滌工作液洗滌2 4次，每次3 5min，拍干；
(3) 向酶標板的每孔中加入150 250uL封閉液，其中封閉働Q入量優選250mL，置 37。C環境下溫育2-4h，赫置于4。C環境下靜ita夜，傾去封閉液，用洗滌工作液洗滌 2 4次，每次3 5min，拍干，千燥后用鋁Mi寸閉4醮(4'C)保存。
戶;M,新己iw體為辣^a氧化物斷斜己的羊抗Mt體，羊抗皿體為以兔源抗體
為免疫原力無病原山羊進行免疫得到的，謝斜己方法為過碘,法將辣^31氧化物酶與 羊抗爐體進行偶聯。
所述的沙丁胺醇標準品溶液為具有8個濃度梯度的沙丁胺醇溶液，濃度分別為 Oug/L、 1.0ug/L、 2.0ug/L、 5.0ug/L、 10.0ug/L、 20.0ug/L、 50.0ug/L、 100.0ug/L。 戶腿的沙丁胺,異性多克隆抗體為兔源多克隆抗體，經復溶工作液1000 2000倍稀 釋，免;S^;^9)W^苯甲酸法將沙丁胺醇半艦與載體蛋白偶聯得到的，其中載體 蛋白 牛血清蛋白，,倍數雌1000倍。沙丁胺醇特異性多克隆抗體M如下步驟制備
(1) 細新西，隹性大白兔作為feg動物，將免疫原(即沙丁胺醇半^J^與載體蛋
白偶聯得至啲偶,)與mf只福氏完全佐劑混合并制戯L化劑，采用背部皮下多點注 射方式對大白^S行首次免疫；
(2) 首次免疫后10 25天^J^免^J^與等^f只福氏不完全佐劑混合并制戯L化 劑，以相同方法進行二次免疫，以后每間隔10 25 ^i4行一次免疫，第五次免疫后7 lO天心JKWb收細清，—20。C保存。
臓的賺冼滌液為含有O. 5% 1. 5% (V/V)土溫20的磷麟緩沖液(O. lmol/L)， 1頓日 # 10倍(0.01mol/L， PH=7.4);戶脫的鄉復溶液為含有0. 5% 1. 5% (V/V) 土溫20的磷m^緩沖液(0.1raol/L)，使用日^tW 10倍即為復溶工作液(0.01mol/L， PH=7.4)。本發明戶腿的底物顯色液A為過氧化氫7K溶液，底物顯色液B為鄰苯二胺的 M離緩沖液，終止液為1 3mol/L的硫酸或者鹽酸溶液。
本翻盒錢于抗原抗體反應和敝學反應麗發的，艦化學方法將半抗原與載
體蛋白偶聯以得到沙丁胺醇包W[原，將此包im原吸附于固相載體上，加入待測樣品
或者沙丁胺llfe準品，然后加入沙丁胺麟異ffifc體，待測樣品中殘留的沙丁胺醇和酶 標fch的沙丁胺醇包m^競爭性地與沙丁胺,異性抗體結合，再依飾入繊己抗 抗體皿tia行顯色反應，顯色后用終止液終lhM色反應，測定樣品的吸光值，iM與 樣品中沙丁胺醇殘留量呈負相關，與標準曲線對比即可計算出待測樣品中沙丁胺醇的殘 留濃度。
本發明沙丁胺醇 免疫檢測試劑盒在檢測動物組織、飼料&^液中沙丁胺醇殘留 量中的應用
本發明的試劑細于檢測動物組織、飼料艦液中沙丁胺醇殘留量時，鵬卩下步 驟實施樣品預處理、用本發明所述試劑盒進行檢測、分析結果。 (1)樣品預處理 動物組織樣品的處理
稱艱5.0g動物組織樣品，充分研磨粉碎以后置于刻度試管中，加50mmol/L鹽酸溶 液定容至25ml，振蕩15min后，以3000rpm離心20min^O:清液，用10mol/L的NaOH 水溶液調節pH《ISl1,再加入30ml異丁醇，^H蕩15min，定量吸取異丁醇，水浴蒸 干，再加入復溶工作液(PBS， 0.01mol/L， pH7.4)溶解析出物，待測。
動物組織樣品的稱取范圍為3.0g 5.0g，振蕩時間范圍為10min 20min，離心時間范圍為20 30min,,范圍為3000rpm 4000rpm。
動物飼料樣品的處理
稱取2,0g飼料樣品，充分研碎，力口入2mllmol/L的鹽酸溶液溶解，再用復溶工作液 (PBS, 0.01mol/L， pH 7.4)定容至20ml，充分振蕩20min后，以3000ipm 4000rpm 離心20min， ^Lt清液9ml，用lmol/L的NaOH水溶液調pH，6.5 7.5，用復溶工 作液(PBS, 0.01mol/L， pH 7.4)定容至10ml，再以3000rpm 4000ipm離心20min 30min社清液，用復溶工作液(PBS， 0.01mol/L， pH7.4)進行20倍繊即f薪測的 樣品溶液。
'飼料樣品的稱取范圍為1.0 3.0g，震蕩時間為20min 30min,離心時間為20min 30min，轉速范圍為3000rpm 4000rpm，,倍數為10倍 20倍。 動物尿液樣品的處理
尿樣不用處理，鵬量凊亮尿樣直接測定，如有混濁雜質可以3000rpm 4000rpm 離心至清亮，并取上清液S^定。
(2) 用本發明試劑盒進行檢測Jd^各樣品中沙丁胺醇殘留量 向包被有沙丁胺醇包鵬原的Slt矛浙微孔中，分另咖入50ul沙丁胺^t示準品溶液和
50ul樣品溶液，再加入50ul抗體工作液，37。C下溫育60min后，每孔加300ul洗滌^ffi 療冼滌拍干，然后加入100ul IKti己的繊體，37。C下溫育50min后，銜L加300ul洗 滌M療冼滌拍干，加1編底物顯色液A、 B的混合溶ma行顯色，加100ul終止液終 ihM色，用,示儀測定492nm處的吸光值，對比待測樣品與標準品的吸光駄小，定量 或者定性分析待測樣品中的沙丁胺醇的殘留量。
力口入沙丁胺llt示準品溶液和樣品溶^溫育時的皿范圍為3(TC 37"C，溫育時間 為60min~90min，加A^^ia^體后溫育時的M范圍為30°C 37°C，溫育時間為 40min 60min。
(3) 分析結果 定性檢測法
若樣品孔的吸收值小于標準孔的吸收值，即A艦〈A繊，艦限量值，為陽性。 ^iW L的吸收歡于標準孔的吸收值，即A離l〉A繊l，則小于戶微P艮量值，為陰性。 定量檢測法
標準曲線的會魏lj:橫坐標為標準液濃度的lg值，即lg(C)，幼^^標為各標準液孔的 吸光值與標準浪為0ng/ml的A值的比值(A^WA(0ngtap)，即抑制率，曲線在0.lMg/L 62.5ng/L范圍內應當成線性。計算樣品孔A值與A^叫(AWA(ongM))，査標準線，可得 至湘應樣品##濃度(c)的常用對數值i^:，對其求^Jft可求得樣品 液的濃度 C。試樣中沙丁胺醇的含量X值以微克每千克(^ig/kg)表示，按下式計算-
式中C~~^標準曲線上査得相對應樣品 液中沙丁胺1 ^度，單位為微克每 升 )； n~~ ,倍數。
權利要求
1、一種丁胺醇酶聯免疫檢測試劑盒，有一盒體，其特征在于盒體內裝有(1)包被有沙丁胺醇包被抗原的酶標板、(2)酶標記的抗抗體、(3)沙丁胺醇特多克隆異性多克隆抗體、(4)沙丁胺醇標準品溶液、(5)濃縮洗滌液、(6)濃縮復溶液、(7)底物顯色液A、(8)底物顯色液B液、(9)終止液。
2、 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的沙丁胺醇包被抗原是將 鹽酸克倫特羅半抗原與載體蛋白偶聯得到的，該載體蛋白為卵清蛋白或牛 血清蛋白；所述的沙丁胺醇包被抗原的濃度為2.5ug/ml 20.0ug/ml。
3、 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的酶標記的抗抗體是采用 過碘酸鈉將過氧化物酶與羊抗兔抗體進行偶聯得到的。
4、 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的沙丁胺醇特異性抗體是 采用沙丁胺醇人工抗原免疫新西蘭大白兔得到的，該抗體稀釋1000倍 2000倍，該沙丁胺醇人工抗原是采用對氨基苯甲酸將沙丁胺醇半抗原與載 體蛋白偶聯得到的，該載體蛋白為卵清蛋白或者牛血清蛋白。
5、 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的沙丁胺醇標準品溶液的 濃度依次為0ug/L、 1.0ug/L、 2.0ug/L、 5.0 ug/L、 10.0 ug/L、 20.0 ug/L、 50.0ug/L、 100.0 ug/L。
6、 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的濃縮洗滌液為pH7.0 8.0、含有0.5% 1.5%土溫20的磷酸鹽緩沖液；所述的濃縮復溶液為 pH7.0 8.0、含有0.5% 1.5%土溫20的磷酸鹽緩沖液；所述的底物顯色 液A液為過氧化氫水溶液；所述的底物顯色液B液為pH5.0 6.0、濃度為 0.1-0.2mol/L的檸檬酸緩沖液，且含有0.5mg/ml lmg/ml的鄰苯二胺；所 述的終止液為1 3mol/L的硫酸溶液。
7、權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒在檢測動物組織、詞料及尿液中 沙丁胺醇殘留量中的應用。
全文摘要
一種沙丁胺醇酶聯免疫檢測試劑盒，有一盒體，其特征在于盒體內裝有(1)包被有沙丁胺醇包被抗原的酶標板、(2)酶標記的抗抗體、(3)沙丁胺醇特異性多克隆抗體、(4)沙丁胺醇標準品溶液、(5)濃縮洗滌液、(6)濃縮復溶液、(7)底物顯色液A、(8)底物顯色液B液、(9)終止液。上述酶聯免疫試劑盒可用于檢測動物組織、飼料及尿液中沙丁胺醇殘留量。本發明結構簡單、價格低廉，易于攜帶，使用時簡單快捷，便于現場操作。
文檔編號G01N21/31GK101592658SQ20091001696
公開日2009年12月2日 申請日期2009年6月26日 優先權日2009年6月26日
發明者凌紅麗, 孫海新, 郗日沫 申請人:青島康地恩藥業有限公司