專利名稱:消除熒光測定中內濾效應的新裝置及測試新方法
技術領域:
本發明屬于分析科學技術領域,涉及一種基于特殊設計的樣品池和相應測試的新方法, 來消除熒光測定過程中內濾效應,尤其涉及一種消除熒光測定中的內濾效應的光路系統新裝 置及其測試新方法。
背景技術:
某些物質吸收了與它自身特征頻率相同的光子后,其原子中的電子被激發到較高的能級, 從而產生吸收光譜。有些物質當用光照射時,它吸收了某種特定波長的光后還會發出各種不 同顏色和強度的光;當停止照射后,這種光也隨之消失,這種光被稱之為熒光(fluorescence)。 發出熒光的波長要比所吸收特定光的波長要長。由于物質分子的結構不同,吸光和發射光的 波長也不同。被這些物質吸收的光稱為激發光,產生的發射光即為熒光。熒光物質的激發光 譜和發射光譜與其分子結構密切相關,據此可用熒光光譜進行物質的定性鑒定和定量測定。 熒光的激發光譜、發射光譜、量子產率和熒光壽命等參數不僅和分子內熒光發色基團的本身 結構有關,而且還強烈地依賴于發色團周圍的環境,即對周圍環境十分敏感。據此,可根據 上述相關熒光參數的變化來研究熒光發色團所在部位微環境的特征及其變化。
由于熒光的這些特性,通常用熒光技術來研究兩種物質之間的相互作用,來判斷它們之 間的作用類型、動力學參數以及作用機理。例如,通過測定蛋白與不同濃度有毒污染物相互 作用時熒光的變化,來研究污染物與生物分子的毒性作用機理。但是這種方法也存在一些問 題,其中比較突出的就是內濾效應。內濾效應(inner filter effect, INF),指激發光和發 射光被非熒光物質吸收而引起的熒光強度降低的現象。這種現象在非熒光物質濃度較低的情 況下可以忽略,但是濃度高時會產生嚴重的影響。為了消除這種影響,通常采用經驗公式計 算的辦法來消除,但是結果常常偏離真實情況并且可以應用的濃度范圍有限。
發明內容
本發明就是為了克服這些弊端,提供一種消除熒光測定中的內濾效應的光路系統新裝置 及其測試新方法,它通過實驗來測定內濾效應實際的影響程度,從而消除其影響,該方法操 作簡單便捷、經濟適用、結果可靠、可以解決以前方法中所存在的問題。
為實現上述目的,本發明采用如下技術方案-
一種消除熒光測定中的內濾效應的光路系統新裝置,它包括由樣品池和吸收池構成的熒 光分光光度計用光路裝置,所述該光路裝置中吸收池為L型,樣品池為正方型,L型吸收池 半包圍樣品池,且樣品池的寬度為吸收池寬度的兩倍。一種消除熒光測定中的內濾效應的光路系統新裝置,它包括樣品池支架和吸收池支架, 所述樣品池支架為正方形,在其相鄰兩邊上設有吸收池支架,三者組成L型;其中樣品池支 架的寬度為吸收池支架寬度的兩倍。
所述吸收池和樣品池均為石英材質。
一種采用消除熒光測定中的內濾效應的光路系統新裝置的測試新方法,其步驟為-
1) 配制樣品溶液a為與熒光物質發生作用的物質,對激發光、發射光有吸收;b為熒 光物質;C為溶劑;其中a、 b均為以C為溶劑的溶液、懸濁液或乳濁液;
2) 在樣品池內加入b,吸收池內加入溶劑C,進行掃描得到曲線a;
3) 然后在樣品池內加入b,吸收池內加入a,掃描得到曲線e;
4) 最后在樣品池內加入a和b的混合溶液,吸收池內加入溶劑c, a、 b的濃度與前兩步 驟的濃度相同,掃描得到曲線Y;
5) 設F。、 FB、 FY為所得曲線特定波長處的熒光強度,FeX(l+X)=F。,那么X就為內濾 效應對吸光度影響的程度,F,' :F,X(1+X)為消除內濾效應影響后a與b作用的熒光強度的 真實值。
在測試過程中保持被測熒光物質的濃度穩定,并且測定時溫度恒定。 本發明提供的技術方案是用特殊設計的"L"形吸收池或者改進的樣品池支架對原來的 熒光分光光度計進行改造,使儀器滿足測試的要求。采用特定的樣品測試順序和適宜的掃描 參數對樣品進行測定,來得到熒光光譜,通過相應的數據處理來消除內濾效應對熒光光譜的 影響。
上述"L"形吸收池和改進的樣品池支架內的吸收池都為石英材質,滿足紫外區測定的需 要。B是橫截面為正方形的樣品池。
樣品溶液配制方法,a為與熒光物質發生作用的物質,對激發光、發射光有吸收;b為熒 光物質;c為純溶劑。a、 b均為以c為溶劑的溶液、懸濁液、乳濁液等。保持被測熒光物質 的濃度穩定,并且測定時溫度恒定。
本發明所提出方法的突出特點是-
1. 該方法是以常規的熒光分光光度計為基礎,硬件上是在光路中加入了吸收池,技術方 便可行,裝置投資小,經濟有效,適用于絕大多數的熒光儀器,應用范圍廣,能夠滿足多領 域的需要。
2. 該方法較傳統方法的使用的范圍更加廣泛,研究的結果更接近真實情況,而非純理論 計算的結果。
3. 能夠切實解決生產和科研中存在的內濾效應對熒光測定的干擾問題,拓寬儀器的使用 范圍,提高科研能力。
44.能夠得出具體、真實的實驗數據,對理論計算的結果進行校正,促進相關理論的進一 步完善與發展。
圖1為本發明的光路系統新裝置的結構示意圖2為本發明的光路系統新裝置的另一種結構示意圖3為測試順序和樣品加入方法圖。
圖4為酸性嫩黃G自身吸收對牛血清白蛋白(BSA)熒光影響的研究圖; 圖5為碳納米管自身吸收對BSA熒光影響的研究圖; 圖6為碳納米管自身吸收對人血清白蛋白(has)熒光影響的研究圖。 其中,l.樣品池,2.吸收池,3.樣品池支架,4,吸收池支架。
具體實施例方式
下面結合附圖與實施例對本發明作進一步說明。 實施例1:
圖1中,本發明的光路系統新裝置由樣品池1和吸收池2構成,其中樣品池1為正方型, 吸收池2為L型并且半包圍樣品池1,且樣品池1的寬度為吸收池2寬度的兩倍。吸收池和 樣品池采用石英材質。
實施例2:
圖2中,本發明的光路系統新裝置由樣品池支架3和吸收池支架4組成,樣品池支架3 為正方形,在其相鄰兩邊上設有吸收池支架4,三者組成L型;其中樣品池支架3的寬度為 吸收池支架4寬度的兩倍。吸收池和樣品池為石英材質,支架材質為吸光能力強且不發射熒 光的堅硬材質。
本發明利用改進的測試裝置與方法來消除熒光測定過程中的內濾效應。針對常規的熒光 分光光度計,設計了新型的樣品池裝置和方法進行改進,在合適的熒光測量條件下,通過一 定的樣品測試的組合順序來得到相應的數據,最終通過數據處理來消除內濾效應的影響。
按上述方法,每個樣品的測試需要三個步驟。首先如圖4各步驟所示,在樣品池內加入 b,吸收池內加入溶劑c,進行掃描得到曲線ci。然后,在樣品池內加入b,吸收池內加入a, 掃描得到曲線e。最后,樣品池內加入a和b的混合溶液,吸收池內加入溶劑c, a、 b的濃 度與前兩步驟的濃度相同,掃描得到曲線Y。
對數據進行處理的依據,在熒光測定中,b發射的熒光要經過樣品池內的溶液才能到達 檢測器,由于熒光在樣品池的橫截面內是均勻產生的,各個點發光的幾率是相同的(因為激 發光強度樣品池截面內沿發射光(em)方向是均勻的,或者說是關于樣品池中線是對稱的),但 是在各個點發出的熒光(在L范圍內均勻產生)所通過溶液的距離是不一樣的,根據朗格-
5比爾定律,我們可以將整個平面內各個點發出的熒光的光程平均為1=172(通過二重積分對整 個橫截面內物質的吸光強度進行計算也得到相同結論)。這個理論同樣適用于激發光(ex)方 向,將激發光通過的光程歸一為L/2。這樣我們就可以把樣品池內的各個吸光點和發光點歸 一到樣品池中心的0點。通過圖3可以看出,步驟(2)和(3)中,激發光和發射光所通過的光 程相同,a物質對激發和發射光吸收的影響相同,只是在(2)中a與b沒有混和而在(3)中這 兩種物質混合發生作用。設F。、 F8、 F,為所得曲線特定波長處的熒光強度,FBX(1+X)=F。。 那么X就為內濾效應對吸光度影響的程度。F,' :FrX(l+X)為消除內濾效應影響后a與b作 用的熒光強度的真實值。也可以將整條曲線Y放大(1+X)倍,得到消除內濾效應后相互作用 的熒光曲線。
下面通過實例,進一步闡明本發明的突出特點和顯著進步,僅在于說明本發明而決不限
制本發明的應用范圍及發展潛力。
應用實例l: BSA與染料溶液(酸性嫩黃G)作用
取分析純的牛血清白蛋白(BSA, lX10^mol/L)和酸性嫩黃G溶液(AY, 4X1(T mol/L), 按圖3所示的方法進行三次掃描,得到的曲線于圖4。在波長為347nra處,純BSA的熒光強 度,F^7464;酸性嫩黃未與BSA混合情況下,AY吸光度對熒光強度的影響,FP=7257; BSA 與AY混合后熒光強度,F,=3636。
FpX(l+X):F。, 7257 X(l+X)=7464, X=0.029
F/ =F,X (1+X)=3636X (1+0. 029) =3741 消除內濾效應影響后的BSA與AY作用后在347nm處的熒光強度F/ =3741。可以看出F/ < F。,說明兩者作用后發生猝滅作用。
應用實例2: BSA與碳納米管懸濁液作用
取分析純牛血清白蛋白(BSA, 0.5g/L)和修飾碳納米管(0.1g/L),按圖3所示的方法進 行三次掃描,得到的曲線于圖5。在波長為347nm處,純BSA的熒光強度,F。=3710;碳納米 管未與BSA混合情況下,熒光強度的Fe =956; BSA與碳納米管混合后熒光強度,FY=406。
FeX(l+X)=F。, 956 X(l+X)=3710, X=2.881
FY, =FYX (1+X) =406X (1+2. 881) =1576 消除內濾效應影響后的HAS與碳納米管作用后在330nm處的熒光強度F,' =1576。可以看出 F/ < Fa,說明兩者作用之后發生了猝滅作用。
應用實例3: HSA與碳納米管懸濁液作用
取分析純人血清白蛋白(HAS, 2g/L)和修飾碳納米管(0.1g/L),按圖3所示的方法進行 三次掃描,得到的曲線于圖6。在波長為330nm處,純HSA的熒光強度,F。=6367;碳納米管 未與BSA混合情況下,熒光強度的Fe =1705; BSA與碳納米管混合后熒光強度,F一2120。
6FeX(l+X)=F。, 1705 X(l+X)=6367, X=2. 734 Fy, =F,X (1+X)=2120X (1+2. 734)=7917
消除內濾效應影響后的HAS與碳納米管作用后在330nm處的熒光強度F/ =7917。可以 看出F/ 〉F。,說明兩者作用之后發生了熒光增強作用。也可以將整條曲線Y放大(1+2 734) 倍,得到消除內濾效應后相互作用的熒光曲線Y'。這與我們直接看到的曲線Y強度遠小 于曲線a結果完全相反,進一步的說明了消除內濾效應的重要性。
權利要求
1.一種消除熒光測定中的內濾效應的光路系統新裝置,它包括由樣品池和吸收池構成的熒光分光光度計用光路裝置,其特征是,所述該光路裝置中吸收池為L型,樣品池為正方型,L型吸收池半包圍樣品池,且樣品池的寬度為吸收池寬度的兩倍。
2. —種消除熒光測定中的內濾效應的光路系統新裝置,它包括由樣品池支架和吸收池支 架構成的熒光分光光度計用光路裝置,其特征是,所述樣品池支架為正方形,在其相鄰兩邊 上設有吸收池支架,三者組成L型;其中樣品池支架的寬度為吸收池支架寬度的兩倍。
3. 如權利要求1或2所述的消除熒光測定中的內濾效應的光路系統新裝置,其特征是, 所述吸收池和樣品池均為石英材質,支架材質為吸光能力強且不發射熒光的堅硬材質。
4. 一種采用權利要求1或2所述消除熒光測定中的內濾效應的光路系統新裝置的測試新 方法,其特征是,它的步驟為1) 配制樣品溶液a為與熒光物質發生作用的物質,對激發光、發射光有吸收;b為熒 光物質;c為溶劑;其中a、 b均為以c為溶劑的溶液或懸濁液或乳濁液;2) 在樣品池內加入b,吸收池內加入溶劑c,進行掃描得到曲線a;3) 然后在樣品池內加入b,吸收池內加入a,掃描得到曲線e;4) 最后在樣品池內加入a和b的混合溶液,吸收池內加入溶劑c, a、 b的濃度與前兩步 驟的濃度相同,掃描得到曲線Y;5) 設F。、 Fe、 Fy為所得曲線特定波長處的熒光強度,FeX(l+X)=Fa,那么X就為內濾 效應對吸光度影響的程度,F/ :F,X(1+X)為消除內濾效應影響后a與b作用的熒光強度的 真實值。
5. 如權利要求4所述的采用消除熒光測定中的內濾效應的光路系統新裝置的測試新方 法,其特征是,在測試過程中保持被測熒光物質的濃度穩定,并且測定時溫度恒定。
全文摘要
本發明公開了一種消除熒光測定中的內濾效應的新裝置及測試的新方法。它通過實驗來測定內濾效應實際的影響程度,從而消除其影響,該方法操作簡單便捷、經濟適用、結果可靠、可以解決以前方法中所存在的問題。其結構為它包括由樣品池和吸收池構成的熒光分光光度計用光路裝置,所述該光路裝置中吸收池為L型,樣品池為正方型,L型吸收池半包圍樣品池,且樣品池的寬度為吸收池寬度的兩倍。
文檔編號G01N21/64GK101581668SQ20091001575
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月4日 優先權日2009年6月4日
發明者劉汝濤, 宗萬松, 池振興, 躍 滕, 潘星任, 秦鵬飛 申請人:山東大學