專利名稱：：一種檢測2-酮基-l-古龍酸中蛋白質含量的方法一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法一、
技術領域：
；本發明涉及一種化學分析方法，特別是一種運用考馬斯亮藍比色法測定2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的分析方法。二、
背景技術：
s維生素C又名L-抗壞血酸，是人體營養必需的維生素，用途非常廣泛，常被用于食品、飼料及化妝品中，在醫藥和臨床上亦有廣泛應用，在國際醫藥貿易中^:期占十分重要的地位。其主要的生產方法是萊氏法和兩步發酵法。兩步發酵法是我國首創，它是以生物氧化過程代替萊氏路線的部分化學合成過程，進而合成維生素C。兩步發酵法是以D-山梨醇為原料，經黑醋菌和假單孢菌兩步發酵得到維生素C的重要中間體2-酮基-L-古龍酸鈉發酵液。發酵液的提取工藝是維生素C生產行業中較為重視的問題，兩步發酵后，發酵液的含量低，且殘留有菌絲體、蛋白質和懸浮微粒等，其中蛋白質的存在對分離提純帶來了困難，并嚴重影響到2-酮基-L-古龍酸干品質量，對后續維生素C轉化工藝也帶來了嚴重影響。過去從來沒有2-酮基-L-古龍酸蛋白質含量的測定方法。生產中除蛋白質的方法有絮凝法、超濾膜、陶瓷膜，但是這些方法截流蛋白如何，由于沒有合適檢測蛋白的方法，一時無法客觀評價，因為沒有2-酮基-L-古龍酸蛋白質含量的測定方法，所以在生產實踐中幾乎只能完全憑借經驗處理。5因此，建立科學、準確、方便、快速的一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，對保證和指導正常生產具有重大的意義。目前常用的幾種經典的蛋白質的定量檢測方法有凱氏定氮法、雙縮脲法和紫外吸收法。凱氏定氮法是目前有機化合物含氮量常用的方法，但此法要求特制玻璃儀器，操作時間長、復雜，產生毒氣；雙縮脲法蛋白檢測迅速，主要缺點靈敏度差；紫外吸收法不適于有色物質的檢測。近年出現了BCA法和考馬斯亮藍比色法，BCA法檢測靈敏度很高，但是受雜質影響大，主要影響雜質包括具有還原性的醇和糖。考馬斯亮藍比色法檢測過程簡單、迅速，適于檢測微量蛋白含量。生產中的2-酮基-L-古龍酸發黃，溶液顏色很難處理掉，蛋白含量微量，干擾物質多，包括含氮物質尿素、還原性的山梨醇、山梨糖，并且2-酮基-L-古龍酸本身也具有還原性。針對2-酮基-L-古龍酸上述特征，選用考馬斯亮藍法檢測2-酮基-L-古龍酸中的蛋白含量，并對檢測條件進行優化。三、
發明內容；本發明提供一種檢測方法，其目的在于解決目前無法對2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量進行檢測方面所存在的問題。一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于具體步驟如下(1)配制磷酸鹽緩沖液(pH7.0):取磷酸二氫鉀加氫氧化鈉溶液配置pH為7.0的磷酸鹽緩沖液，用水稀釋至100m;(2)配制0.1mg/mL牛血清蛋白質標準溶液稱取牛血清蛋白，用少量蒸餾水溶解定容至100mL，得到lmg/mL蛋白質溶液，移取10mL此蛋白溶液定容至100mL容量瓶，加入10ml步驟(1)的磷酸鹽緩沖液，去離子水定容，即得0.1mg/mL蛋白質標準液，冰箱中保存，待用；(3)配制考馬斯亮藍G-250染色劑，O.lg考馬斯亮藍G-250,50ml95%乙醇，100ml85。/。磷酸，用水定容至1L;冰箱中保存，待用；(4)配制0.02、0.04、0.06、0.08.、0.1mg/ml的牛血清蛋白質標準溶液，分別移取lml的牛血清蛋白質標準溶液至5支試管中，加入5ml考馬斯亮藍G-250染色劑，制作595nm處考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后吸光度增加值(^^(595))與蛋白質濃度(c，mg/mL)關系標準曲線；(5)供試品溶液的配制①2-酮基-L-古龍酸干品稱取5g2-酮基-L-古龍酸干品，用去離子水將其溶解至100ml容量瓶，再加入6.5ml20%KOH稀堿溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，調節供試品pH,去離子水定容；②2-酮基-L-古龍酸鈉醪液2000r/min離心20min，移取上清液2ml至試管中，然后加入2ml40%KOH稀堿溶液，沸水中煮30min，去離子水將其洗入100ml容量瓶，再加入4.5ml20X硝酸溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，調節供試品pH，去離子水定容；(6)測定2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量分別移取lml去離子水一份和供試品溶液兩份于三支試管中，前兩支試管加入5ml考馬斯亮藍試劑，第三支試管加入5ml去離子水，120min內分別測定三支試管中的溶液和去離子水在595nm處吸光度；吸光度的增加量AJ(，廣J2-^^3+為，其中A)為去離子水的吸光度，A為lml去離子水和5ml考馬斯亮藍G-250溶液的吸光度，^為lml供試品和5ml考馬斯亮藍G-250溶液的吸光度，為為1ml供試品和5ml去離子水的吸光度；根據吸光度增加值(A^，))與蛋白質濃度(c，mg/mL)標準曲線斜率得出2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量。該檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，適用于2-酮基-L-古龍酸醪液到2-酮基-L-古龍酸干品的整個過程中的產品。在上述步驟(3)所說的考馬斯亮藍G-250染色劑含有乙醇體積百分濃度為4.75%，磷酸體積百分濃度為8.5。/。，考馬斯亮藍G-250質量百分濃度為0.1mg/mL。在上述步驟(4)所說的595nm處吸光度增加值與蛋白質濃度關系標準曲線的繪制，每配制一次考馬斯亮藍G-250染色劑，就需要重新繪制595nm處吸光度增加值與蛋白質濃度關系標準曲線。在上述歩驟(5)稀堿溶液指可溶的氫氧化物類物質；稀堿的配制原則在于配制后的溶液應該是均勻混合物，常溫下長時間存放無溶質析出。在上述步驟(5)供試品溶液配置中，pH調節范圍優化為3.5~7，0<RSD<3%。在上述步驟(6)中所說的595nm處吸光度的測量時間優化為加入考馬斯亮藍染色劑后3060min內完成，0<RSD<3%。RSD為分析過程中的相對標準偏差。本發明的優越性在于1、該發明可應用于檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量；2、本發明包括595nm處吸收度增加值與蛋白量關系標準曲線的繪制和待測樣品檢測兩部分，該過程中所配制的考馬斯亮藍溶液可一次大量配制多次使用，同一批次的考馬斯亮藍溶液可以只做一次595nm處吸光度增加值與蛋白質濃度關系標準曲線，這樣就降低了勞動強度，簡化了工作步驟；3、該發明對計算公式進行了完善，對供試品溶液pH范圍和檢測時間進行了優化；4、克服了其他蛋白質含量檢測方法的缺點，例如數據重現性差，結果誤差大，操作繁瑣，受其他組分影響大等；5、本發明方法簡便、靈敏，酸性范圍廣，時間穩定性好，準確率高，重現性好，對檢測設備要求低，適宜于工業生產上2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的分析檢測。四；圖1、為標準蛋白質含量與吸光度增值關系標準曲線；五具體實施方式；本發明采用優化的考馬斯亮藍法檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量，本發明具體包括以下步驟1、磷酸鹽緩沖液(pH7.0):取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1ml，用水稀釋至lOOml，即得。2、配制牛血清蛋白標準溶液精確稱取牛血清蛋白100mg，用少量蒸餾水溶解定容至100mL，得到lmg/mL蛋白質溶液，移取10mL此蛋白溶液至100mL容量瓶，再加入10mlpH為7的緩沖液，去離子水定容，即得0.1mg/mL蛋白質標準液。冰箱中保存，待用。3、配制考馬斯亮藍G-250染色劑考馬斯亮藍G-250100mg溶于50ml95。/。乙醇中，加入100mlS5。/。磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml。最終試劑中含0.01。/。(W/V)考馬斯亮藍G-250,4.7%(W/V)乙醇。冰箱中保存，待用。4、繪制吸收度增加值與蛋白濃度關系標準曲線分別精密移取0.1mg/mL標準蛋白質溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、l.OmL于六支試管中，分別加去離子水l.O、0.8、0.6、0.4、0.2、O.OmL，加入考馬斯亮藍G-250溶液5mL，混勻，3060min內于595nm處測定吸光度值。建立吸光度增加值(/^4(595))與蛋白濃度(c，mg/mL)關系標準曲線。5、供試品溶液的配制(1)2-酮基-L-古龍酸干品稱取5g2-酮基-L-古龍酸干品，用去離子水將其溶解至100ml容量瓶，再加入6.5ml20%KOH溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，去離子水定容。(2)2-酮基-L-古龍酸鈉醪液2000r/min離心20min，移取上清液2ml至試管中，然后加入2ml40XKOH溶液，水浴加熱30min，去離子水將其洗入100ml容量瓶，再加入4.5ml20^硝酸溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，去離子水定容。6、測定2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量分別移取lmL去離子水一份和供試品溶液兩份于三支試管中，前兩支試管加入5mL考馬斯亮藍試劑，第三支試管加入5mL去離子水，3060min內測定三支試管中的溶液和去離子水在595nm處吸光度。吸光度的增加量^^595產J3+^e，其中A為去離子水的吸光度，4為1mL供試品加入5mL去離子水的吸光度，A為lmL供試品加入5mL考馬斯亮藍G-250溶液在595nm處的吸光度，A為lmL去離子水加入5mL考馬斯亮藍G-250溶液的吸光度。由下面公式計算出2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量。2-酮基-L-古龍酸干品中蛋白質量百分含量為^%^xlOO%2-酮基-L-古龍酸鈉醪液中蛋白濃度為,(;95)—W(mg/mL)其中A^4(s95)——595nm處考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后吸光度增加值;k——吸光度增加值(L/(g.cm》與蛋白濃度(mg/ml)關系標準曲線斜率；b——吸光度增加值(L/(gxm))與蛋白濃度(mg/ml)關系標準曲線截距；m——所稱取的2-酮基-L-古龍酸干品質量，g;下述實施例中所使用方法如無特別說明均為常規方法。實施例一2-酮基-L-古龍酸鈉發酵液中蛋白含量檢測；取生產中的2-酮基-L-古龍酸鈉發酵液2000r/min離心20min，移取上清液2ml至試管中，然后加入2ml40%KOH溶液，沸水中煮30min，去離子水將其洗入100ml容量瓶，再加入4.5ml20。/a肖酸溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，去離子水定容。分別移取lmL去離子水一份和供試品溶液兩份于三支試管中，前兩支試管加入5mL考馬斯亮藍試劑，第三支試管加入5mL去離子水，于595nm處檢測去離子水和試管2吸光度分別為0.037、0.058L/(g.cm)，將試管1吸光度調為0，3060min內檢測試管3的吸光度為0.162L/(g.cm)，通過公式2計算可得2-酮基-L-古龍酸干品屮蛋白含量為1.209mg/ml。實施例二2-酮基-L-古龍酸鈉超濾液中蛋白含量檢測取崗位超濾液20ml至50ml容量瓶中，再加入10mlpH為7的緩沖溶液，去離子水定容。分別移取lmL去離子水一份和供試品溶液兩份于三支試管中，前兩支試管加入5mL考馬斯亮藍試劑，第三支試管加入5mL去離子水，于595nm處檢測去離子水和試管2吸光度分別為0.037、0.046L/(g.cm)，將試管1吸光度調為0，3060min內檢測試管3的吸光度為0.205L/(g.cm)，通過計算可得超濾液中蛋白含量為0.089mg/ml。實施例三2-酮基-L-古龍酸干品中蛋白含量檢測稱取生產中的2-酮基-L-古龍酸干品5g，去離子水溶解后移入100ml容量瓶中，然后加入6.5ml20。/。KOH溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，:去離子水定容。分別移取lmL去離子水一份和供試品溶液兩份于三支試管中，前兩支試管加入5mL考馬斯亮藍試劑，第三支試管加入5mL去離子水，于595nm處檢測去離子水和試管2吸光度分別為0.037、0.039L/(g.cm)，將試管1吸光度調為0,3060min內檢測試管3的吸光度為0.115L/(g.cm)，通過公式1計算可得2-酮基-L-古龍酸干品中蛋白含量為0.036%。實施例四2-酮基-L-古龍酸母干中蛋掃含量檢測稱取生產中的2-酮基-L-古龍酸母干5g，去離子水溶解后移入100ml容量瓶中，然后加入6.5ml20y。KOH溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，去離子水定容。分別移取lmL去離子水一份和供試品溶液兩份于二支試管中，前兩支試管加入5mL考馬斯亮藍試劑，第三支試管加入5mL去離子水，于595nm處檢測去離子水和試管2吸光度分別為0.037、0.052L/(g.cm)，將試管1吸光度調為0，3060min內檢測試管3的吸光度為0.260L/(g.cm)，通過公式1計算可得2-酮基-L-古龍酸母干中蛋白含量為0.092%。實施例五2-酮基-L-古龍酸中蛋白回收率精密移取已配制的2-酮基-L-古龍酸溶液0.5mL，應用本發明所涉的方法測得蛋白質含量為0.0268mg/mL，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4mL蛋白標準溶液(0.1mg/mL)，應用本發明所涉的方法對于2-酮基-L-古龍酸中標準蛋白質回收率及誤差分析結果可見下表12表l2-酮基-L-古龍酸中蛋白質回收率分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權利要求1、一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于具體步驟如下(1)配制磷酸鹽緩沖液(pH7.0)取磷酸二氫鉀加氫氧化鈉溶液配置pH為7.0的磷酸鹽緩沖液，用水稀釋至100ml；(2)配制0.1mg/ml牛血清蛋白質標準溶液稱取牛血清蛋白，用少量蒸餾水溶解定容至100ml，得到1mg/ml蛋白質溶液，移取10mL此蛋白溶液定容至100mL容量瓶，加入10ml步驟(1)的磷酸鹽緩沖液，去離子水定容，即得0.1mg/mL蛋白質標準液，冰箱中保存，待用；(3)配制考馬斯亮藍G-250染色劑，0.1g考馬斯亮藍G-250，50ml95％乙醇，100ml85％磷酸，用水定容至1L；冰箱中保存，待用；(4)配制0.02、0.04、0.06、0.08.、0.1mg/ml的牛血清蛋白質標準溶液，分別移取1ml的牛血清蛋白質標準溶液至5支試管中，加入5ml考馬斯亮藍G-250染色劑，制作595nm處考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合后吸光度增加值(ΔA(595))與蛋白質濃度(c，mg/mL)關系標準曲線；(5)供試品溶液的配制①2-酮基-L-古龍酸干品稱取5g2-酮基-L-古龍酸干品，用去離子水將其溶解至100ml容量瓶，再加入6.5ml20％KOH稀堿溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，調節供試品pH，去離子水定容；②2-酮基-L-古龍酸鈉醪液2000r/min離心20min，移取上清液2ml至試管中，然后加入2ml40％KOH稀堿溶液，沸水中煮30min，去離子水將其洗入100ml容量瓶，再加入4.5ml20％硝酸溶液和10mlpH為7的緩沖溶液，調節供試品pH，去離子水定容；(6)測定2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量分別移取1ml去離子水一份和供試品溶液兩份于三支試管中，前兩支試管加入5ml考馬斯亮藍試劑，第三支試管加入5ml去離子水，120min內分別測定三支試管中的溶液和去離子水在595nm處吸光度；吸光度的增加量ΔA(595)＝A2-A1-A3+A0，其中A0為去離子水的吸光度，A1為1ml去離子水和5ml考馬斯亮藍G-250溶液的吸光度，A2為1ml供試品和5ml考馬斯亮藍G-250溶液的吸光度，A3為1ml供試品和5ml去離子水的吸光度；根據吸光度增加值(ΔA(595))與蛋白質濃度(c，mg/mL)標準曲線斜率得出2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量。2、一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，適用于2-酮基-L-古龍酸醪液到2-酮基-L-古龍酸干品的整個過程中的產品。3、根據權利要求1所說的一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于步驟(3)所說的考馬斯亮藍G-250染色劑含有乙醇體積百分濃度為4.75。/。，磷酸體積百分濃度為8.5%，考馬斯亮藍G-250質量百分濃度為0.1mg/mL。4、根據權利要求1所說的一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于步驟(4)所說的595nm處吸光度增加值與蛋白質濃度關系標準曲線的繪制，每配制一次考馬斯亮藍G-250染色劑，就需要重新繪制595nm處吸光度增加值與蛋白質濃度關系標準曲線。5、根據權利要求1所說的-種2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的分析方法，其特征在于步驟(5)稀堿溶液指可溶的氫氧化物類物質；稀堿的配制原則在于配制后的溶液應該是均勻混合物，常溫下長時間存放無溶質析出。6、根據權利要求1所說的一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于步驟(5)供試品溶液配置中，pH調節范圍優化為3.57，0<RSD<3%。7、根據權利要求1所說的一種檢測2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的方法，其特征在于步驟(6)中所說的595mn處吸光度的測量時間優化為加入考馬斯亮藍染色劑后30~60min內完成，0<RSD<3%。全文摘要本發明涉及一種2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的分析方法，采用優化的考馬斯亮藍定量蛋白法(Bradford法)，通過配制磷酸鹽緩沖液、牛血清蛋白質標準溶液、考馬斯亮藍G-250染色劑，在牛血清蛋白質標準溶液中加入考馬斯亮藍G-250染色劑，根據考馬斯亮藍與蛋白質結合后的吸光度增加值繪制標準曲線，然后取2-酮基-L-古龍酸加入考馬斯亮藍試劑，根據吸光度增加值與蛋白質濃度標準曲線斜率計算出2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量。該分析方法簡便、靈敏，穩定性好，準確率高，重現性好，對檢測設備要求低，非常適宜于工業生產中2-酮基-L-古龍酸中蛋白質含量的分析檢測。對保證和指導正常生產具有重大的意義。文檔編號G01N21/31GK101566575SQ20091001135公開日2009年10月28日申請日期2009年4月29日優先權日2009年4月29日發明者霞于,敖志剛,李春杰,雪王,王鳳杰,王彥春,符艷君,靜董,董淑清,陳宏權申請人:東北制藥總廠