專利名稱：免疫層析測試中信號放大的方法以及使用該方法的免疫層析試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于高靈敏度檢測分析物的免疫層析測試中的信號放大的方法以及使用該方法的免疫層析試劑盒，更具體地，涉及用于高靈敏度檢測分析物的免疫層析測試中的信號放大的方法以及使用該方法的免疫層析試劑盒，其中通過區分夾心實驗方法中第一指示劑的大小與結合在第一指示劑上的第二指示劑的大小來控制指示劑流速實現信號的放大。
背景技術：
免疫層析測試是一種通過利用彼此特異性結合的生物學材料或化學材料的性質在短時間內對分析物進行定性和定量測試的方法。具體地，公知夾心型免疫測試方法是將特異性針對分析物(需測試其存在和濃度)的第一表位的第一抗體固定于固相載體上，并利用特異性針對該分析物的第二表位的第二抗體。免疫層析測試中通常使用的試劑盒是測試條或者免疫測試試劑盒，即將測試條裝在外殼內的一種組件。當含有分析物的流體施加到多孔條的一面時，流體因毛細管現象而流動，測試目標與固定的抗體和包含指示劑的抗體結合，從而完成夾心型測試方法。通常，在免疫層析試劑盒中，抗體被固定在膜上，流體由于毛細管現象能在膜上流動，在膜的上游面設有樣品墊或者偶聯物墊，而膜的下游面連接有吸收墊。樣品墊吸收包含分析物的流體樣品并提供均勻流動，并且連接有能選擇性結合分析物的抗體的指示劑在偶聯物墊上干燥。選擇性結合分析物的固定抗體和能夠與指示劑上固定的抗體相結合的材料被固定在膜上的不同位置以分別形成檢測位點和對照位點。固定在膜上的能夠選擇性結合分析物的抗體和固定在指示劑上的抗體可以用來以夾心型結合分析物。吸收墊由能夠吸收液體樣品的材料形成。在免疫層析試劑盒中，當含有分析物的液體樣品滴加到樣品墊上時， 對分析物有選擇性的指示劑-抗體和固定在膜上的抗體以夾心形式和分析物結合，從而在膜上固定了抗體的位置形成肉眼可見的條帶。相關技術公開的免疫層析信號放大方法將第一偶聯體與抗原結合，此外將第二偶聯體與其結合，結合物最終與固定在膜上的抗體結合。然而，相關技術的免疫層析方法的檢測由于靈敏度低，難以檢測需要更高靈敏度的樣品。因此，本發明人發現免疫層析中，當抗原和第一偶聯體相互結合后與固定抗體在夾心反應中結合，然后將第二偶聯體與其結合時，提高了信號放大的靈敏度這一事實，從而完成了本發明。具體地，本發明通過一次性樣品注入，無需另外的機械控制或人工逐步反應，實現信號放大。
發明內容
技術問題本發明的一個方面提供了在免疫層析測試中放大信號的方法。
本發明的另一方面提供了利用該信號放大方法提高了靈敏度的免疫層析試劑盒。技術方案本發明的一個方面提出了在免疫層析測試中放大信號的方法，包括將具有能特異性結合分析物第一表位的第一抗體、連接體、和與第一抗體和連接體結合的第一指示劑的第一偶聯體與分析物結合；將結合在第一偶聯體上的分析物與能特異性結合分析物第二表位的固定的第二抗體相結合；將具有能特異性結合第一偶聯體的連接體的第三抗體，和連接第三抗體的第二指示劑的第二偶聯體與第一偶聯體的連接體結合，其中第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑的顆粒大于第一指示劑的顆粒，使得第二偶聯體遲于第一偶聯體到達固定的第二抗體。本發明的另一方面提出了在免疫層析測試中放大信號的方法，包括將具有能特異性結合分析物第一表位的第一抗體、和與第一抗體結合的第一指示劑的第一偶聯體與分析物結合；將結合在第一偶聯體上的分析物與能特異性結合分析物第二表位的固定的第二抗體相結合；將具有能特異性結合第一偶聯體的第一抗體的第三抗體和與第三抗體結合的第二指示劑的第二偶聯體與第一偶聯體的第一抗體結合，其中第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑的顆粒大于第一指示劑的顆粒，使得第二偶聯體遲于第一偶聯體到達固定的第二抗體。根據本發明的另一個方面，提供了一種免疫層析試劑盒，其包括樣品墊，含有分析物的液體樣品施加到墊上；偶聯物墊，包括具有特異性結合分析物的第一表位的第一抗體、連接體、與第一抗體和連接體結合的第一指示劑的第一偶聯體、和具有特異性結合第一偶聯體的連接體的第三抗體和與第三抗體結合的第二指示劑的第二偶聯體，其中第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑大于第一指示劑，使得第二偶聯體遲于第一偶聯體到達固定的第二抗體；膜，包括檢測位點，其上固定的第二抗體能特異性結合與第一偶聯體結合的分析物的第二表位，和用于檢測偏差的對照位點；和吸收墊，通過毛細管現象吸收液體樣品。根據本發明的另一個方面，提供了一種免疫層析試劑盒，其包括樣品墊，含有分析物的液體樣品施加到墊上；偶聯物墊，包括具有特異性結合分析物的第一表位的第一抗體、和與第一抗體結合的第一指示劑的第一偶聯體、和具有特異性結合第一偶聯體的第一抗體的第三抗體和與第三抗體結合的第二指示劑的第二偶聯體，其中第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑大于第一指示劑，使得第二偶聯體遲于第一偶聯體到達固定的第二抗體；膜，包括檢測位點，其上固定的第二抗體能特異性結合與第一偶聯體結合的分析物的第二表位，和用于檢測偏差的對照位點；和吸收墊，通過毛細管現象吸收液體樣品。有益效果本發明的信號放大方法將第一偶聯體和抗原一起固定于捕獲抗體，并隨后將第一偶聯體與第二偶聯體結合，從而給出了良好的信號放大效果。同樣，該信號放大方法的使用使得可以制造出提高了靈敏度的免疫層析試劑盒。附圖簡要說明
圖1顯示了用本發明所述的方法測試抗原時信號放大的過程，其中參考編號1表示第一抗體、參考編號2表示連接體、參考編號3表示第一指示劑、參考編號4表示分析物、參考編號5表示第二抗體、參考編號6表示第三抗體、參考編號7表示第二指示劑、參考編號8表示第一偶聯體、參考編號9表示第二偶聯體。圖2A顯示了本發明實施方式所述的免疫層析試劑盒，其中參考編號10表示樣品墊、參考編號11表示偶聯物墊、參考編號12表示膜、參考編號13表示檢測位點、參考編號 14表示對照位點、參考編號15表示吸收墊、參考編號17表示固定第二偶聯體的位點、參考編號18表示固定第一偶聯體的位點。圖2B顯示了本發明另一實施方式所述的具有兩個偶聯物墊的免疫層析試劑盒， 其中參考編號16表示第二偶聯物墊、參考編號17表示固定第二偶聯體的位點、參考編號19 表示全面添加有第一偶聯體的第一偶聯物墊。圖2C顯示了圖2B所示免疫層析試劑盒的裝配結構。圖3A和;3B圖表顯示了按第二偶聯體所使用的納米顆粒大小測試信號放大效應的結果，測試中使用肌鈣蛋白I作為抗原。圖4A顯示了根據偶聯物的分離得到的信號放大效應的實驗結果，實驗使用肌鈣蛋白I，圖4B是其結果的圖表顯示。圖5A顯示了根據偶聯體的分離得到的信號放大效應的實驗結果，實驗使用肌紅蛋白，圖5B是其結果的圖表顯示。本發明最佳實施方式下文將參考附圖進一步說明本發明的示例實施方式。本說明書中，術語“連接體”表示通過抗原-抗體反應與第三抗體特異性結合使得第二偶聯體能與第一偶聯體結合的材料。本發明中，第一偶聯體包含第一抗體、連接體、和第一指示劑。然而，若第一抗體能與第二偶聯體的第三抗體結合，則第一偶聯體可以不含連接體。在此，當與抗原結合后流過測試條時，第一偶聯體固定在捕獲抗體上。本發明中，第二偶聯體包含第二指示劑和特異于第一偶聯體的連接體的第三抗體。在此，第三抗原特異性結合第一偶聯體的連接體以放大信號。然而，若第三抗體可特異性結合第一抗體并且第一偶聯體因此不含有連接體時，第三抗體與第一偶聯體的第一抗體結合以放大信號。在本發明的信號放大方法中，包含第一抗體和第一指示劑的第一偶聯體在免疫層析中與抗原結合，并隨后與第二抗體(即固定的捕獲抗體)在夾心反應中結合，隨后包含第三抗體和第二指示劑的第二偶聯體與第一偶聯體結合以放大信號。具體地，本發明的信號放大方法通過控制第二偶聯體的流速提高了信號放大的靈敏度，該流速通過控制第二偶聯體的指示劑的大小比第一偶聯體的指示劑更大而實現。圖1顯示了用本發明所述的方法測試抗原時信號放大的過程，其中包括連接體。 在圖1中，第一抗體1和連接體2與第一指示劑3結合形成第一偶聯體8、第三抗體6與第二指示劑7結合形成第二偶聯體9。第一偶聯體8與分析物4 (即抗原)結合并與第二抗體 5 (即固定的捕獲抗體)結合，隨后第二偶聯體9與第一偶聯體8結合。下面將結合附圖對本發明的免疫層析信號放大方法進行詳細描述。第一偶聯體與分析物4結合，該第一偶聯體8具有能特異性結合分析物4的第一表位的第一抗體1、連接體2、和結合第一抗體1和連接體2的第一指示劑3 ；流經測試條時，結合在第一偶聯體上的分析物4與固定的第二抗體5結合，第二抗體特異性結合到分析物4的第二表位上；隨后第二偶聯體9與第一偶聯體8的連接體結合，第二偶聯體具有能特異性結合第一偶聯體8的連接體2的第三抗體6、和供第三抗體6結合的第二指示劑7。在此，第一偶聯體8比第二偶聯體9更接近固定的第二抗體5，并且第二指示劑7的顆粒大于第一指示劑3的顆粒。因此，第二偶聯體9遲于第一偶聯體8到達固定的第二抗體5，從而放大了免疫層析信號。第一偶聯體8所包括的連接體2可以是牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白 (HSA)，并且第三抗體6可以是抗-BSA或抗-HSA。然而，連接體2和第三抗體不僅限于此。 例如，連接體2和第三抗體6可以包含任何能相互選擇性作用如肽-抗體結合和生物素-親和素結合的物質，這些作用使第二偶聯體9能與第一偶聯體8結合而不和分析物4結合。例如，本發明中，血清白蛋白(特別是BSA)可用作連接體2，并且第二偶聯體9可以用另一種未用于第一偶聯體制備的血清白蛋白制備。然而，由于連接體2包含于第一偶聯體8使第二偶聯體9能與第一偶聯體8結合，如果第三抗體6和第一抗體1可以相互特異性結合，那么不應包括連接體2。第三抗體6和第一抗體1能相互特異性結合的情況包括第三抗體6 識別第一抗體1作為抗原并與第一抗體結合的情況。如上所述，本發明可以包括任何使第二偶聯體9能與第一偶聯體8結合的結構。能由本發明所述方法檢測的分析物4可以是任何能通過免疫反應與第一抗體1和第二抗體5結合(即，抗原-抗體反應形成夾心型免疫復合物)的分析物。分析物4的示例包括蛋白質、脫氧核糖核酸(DNA)、環境污染物包括環境激素、疾病因子如病毒和食物中毒細菌、和病原性毒物。本發明中，抗體和抗原可以是能夠通過抗原-抗體反應特異性結合分析物4的任何物質。若分析物4是抗體，與該抗體特異性結合的物質可以用作抗原。根據分析物4，抗原和抗體可以是任何公知的抗原和抗體。本發明中，可產生“指示劑”信號的色素物質的示例包括成色劑、熒光染料、和有色乳膠顆粒。例如，色素物質可以是膠體金或者量子點。第一偶聯體8的第一指示劑3和第二偶聯體9的第二指示劑7可以相互不同。然而，考慮到制造中的問題，第一指示劑3和第二指示劑7可以是彼此相同的。如實施方式3和圖3所示，第一指示劑3的顆粒大小可以是約IOnm到約20nm，而第二指示劑7的顆粒大小可以是約20nm到約60nm。在本發明中，第二指示劑7的顆粒大小大于第一指示劑3的顆粒大小，使得第二偶聯體9在測試條上的展開比第一偶聯體8慢。 因此，第一偶聯體8與抗原先到達第二抗體5并與第二抗體5結合，隨后第二偶聯體9與第一偶聯體8結合。本發明所述的免疫層析試劑盒使用上述信號放大方法。本發明的免疫層析試劑盒包括樣品墊，含有分析物的液體樣品施加到墊上；偶聯物墊，包括具有特異性結合分析物的第一表位的第一抗體、連接體、與第一抗體和連接體結合的第一指示劑的第一偶聯體、和具有特異性結合第一偶聯體的連接體的第三抗體和與第三抗體結合的第二指示劑的第二偶聯體，其中第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑大于第一指示劑，使得第二偶聯體遲于第一偶聯體到達固定的第二抗體；膜，包括檢測位點，其上固定的第二抗體能特異性結合與第一偶聯體結合的分析物的第二表位，和用于檢測偏差的對照位點；和吸收墊，通過毛細管現象吸收液體樣品。圖2A顯示了本發明實施方式所述的免疫層析試劑盒，其中參考編號10表示樣品墊、參考編號11表示偶聯物墊、參考編號12表示膜、參考編號13表示檢測位點、參考編號14表示對照位點、參考編號15表示吸收墊、參考編號17表示固定第二偶聯體的位點、參考編號18表示固定第一偶聯體的位點。圖2B顯示了本發明另一實施方式所述的具有兩個偶聯物墊的免疫層析試劑盒，其中參考編號16表示第二偶聯物墊、參考編號17表示固定第二偶聯體的位點、參考編號19表示全面添加有第一偶聯體的第一偶聯物墊。圖2C顯示了圖 2B所示免疫層析試劑盒的裝配結構。用于制造本發明的免疫層析試劑盒的墊可由任何天然多孔材料或任何合成多孔材料形成。例如，墊可以由硝酸纖維素形成。樣品墊10是一部分，該部分首先吸收含有分析物的液體樣品的墊。膜12的一端可用作樣品墊10，或者可以用另外的膜作為樣品墊10。樣品墊10吸收含有分析物的樣品， 并通過毛細管現象將分析物移至偶聯物墊11。偶聯物墊11具有干燥狀態的第二偶聯體和第一偶聯體。當偶聯物墊吸收含有分析物的液體樣品時，第二偶聯體和第一偶聯體稱為流體移動入膜12。第一偶聯體位于比第二偶聯體更靠近固定的第二抗體的位置，并且制得的第二指示劑顆粒大于第一指示劑的可以，使得測試條上第二偶聯體的展開比第一偶聯體慢。如實施方式3和圖3所示，第二指示劑7的顆粒大小可以是約20nm到約60nm，而第一指示劑3的顆粒大小可以是約IOnm到約20nm。因此，通過控制偶聯物的排列和偶聯物中指示劑的顆粒大小，第一偶聯體和第二偶聯體不會相互接觸，并且結合了抗原的第一偶聯體到達捕獲抗原，隨后第二偶聯體再與之結合。如圖2A所示，第一偶聯體和第二偶聯體可以在單個偶聯物墊上位于不同的區域。 或者，如圖2B所示，第一偶聯體可以包括在第一偶聯物墊上，而第二偶聯體包括在與第一偶聯物墊分開的第二偶聯物墊上。圖2B中測試條的組裝形成圖2C所示結構。優選第一偶聯體和第二偶聯體以時間間隔依次移動。因此，優選偶聯物墊制造成當液體樣品在測試條上移動的時候第一偶聯體和第二偶聯體不相互接觸，并且第一偶聯體和第二偶聯體因此不相互混合。由實施方式4可見，當通過兩個獨立的偶聯物墊的方式分隔第一偶聯體和第二偶聯體，進一步控制第一偶聯體和第二偶聯體之間的接觸時，信號放大效應得到增強。結果就是，通過兩個獨立偶聯物墊的方式(見圖4和幻分隔第一偶聯物墊和第二偶聯物墊時，信號放大效果良好。第一偶聯物墊可以是孔徑為約20 μ m或更大的墊，其適于處理如聚乙烯醇(PVA)這樣的物質而不會延緩溶劑和抗原的流動，并且平穩地保持金納米顆粒偶聯體的展開。例如，第一偶聯物墊可以是玻璃纖維偶聯(GFC)墊。第二偶聯物墊可以是具有過濾 2 μ m或更大的顆粒珠和生物顆粒的效果的墊，因此在處理血液樣品時具有分離和過濾血漿的功能；并且具有良好的液體吸收能力并因此適于展開金納米顆粒偶聯體。例如，第二偶聯物墊可以是Fusion 5墊。偶聯物墊不限于此，而可以是任何其它合適的具有上述性質的偶聯物墊。膜12可以由涂布了硝酸纖維素顆粒的物質形成。膜12可以由任何能在約180秒 /厘米的側向流速下保持抗原和抗體之間的充分反應時間的物質形成，并因此能確保液體樣品的流動性。膜12包括檢測位點，其上固定有第二抗體，該抗體特異性結合分析物的第二區域，所述分析物結合有第一偶聯體；對照位點，作為其對照組檢測偏差所致反應的存在。檢測位點顯示測試結果的確定。對照位點用來檢測捕獲抗體和金納米顆粒偶聯體的偏
8差，并用于檢測流動物質是否無偏差地與檢測位點/對照位點反應。吸收墊15可以是任何能充分吸收反應后殘液的墊。下文將參照實施方式更詳細地描述本發明。這些實施方式只是示例，本發明不限于這些實施方式。本發明的實施方式實施方式1 納米顆粒-抗體偶聯體的組合物1.第一偶聯體的組成將0. ImL 0. IM硼酸鹽緩沖劑(pH 8. 5)加入到ImL膠體金納米顆粒溶液 (BBInternational,10nm)中，向其中加入IOuL lmg/mL第一抗體，并反應30分鐘。反應后， 向其中加入0. Iml溶解了 (w/v)作為連接體的牛血清白蛋白(BSA) (Sigma)的磷酸緩沖鹽水(PBS) (Gibco)，并在常溫下反應15分鐘。反應后，4°C下10，OOOrpm離心20分鐘后分散入ImL溶解有lmg/mL BSA(Sigma)的IOmM PBS溶液中。重復一次離心/分散過程，并再次離心后分散入ImL PBS中，從而制得第一偶聯體。第一抗體可以是用于肌鈣蛋白I免疫測試的4T21，560 (HyTest)，也可以是用于肌紅蛋白免疫測試的M012607 (Fitzgerald)。2.第二偶聯體的組成將0. ImL 0. IM硼酸鹽緩沖劑(pH 8. 5)加入到ImL膠體金納米顆粒溶液 (BBInternational，10、20、40、60nm)中，向其中加入 IOuL 的 lmg/mL 的抗-BSA 抗體 (Genetex)作為第三抗體，并反應30分鐘。反應后，向其中加入0. Iml溶解了 (w/v)人血清白蛋白(HSA) (Sigma)的蒸餾水，并在常溫下反應15分鐘。反應后，4°C下10，OOOrpm 離心20分鐘后分散入ImL溶解有lmg/mL HSA的PBS溶液中。重復兩次離心/分散過程， 從而制得第二偶聯體。實施方式2 免疫層析的制造1.免疫層析的制造方法將硝酸纖維素膜(密理博公司(Millipore)，180秒)和吸收墊(密理博公司)粘合在塑料墊(密理博公司)上。然后，用分配系統(Zeta Co.)把溶解在PBS中的lmg/mL捕獲抗體(第二抗體)溶液和作為對照組的溶解在PBS中的lmg/mL羊抗鼠IgG抗體(Sigma， M8642)以6厘米/秒的速度刻劃到膜上，從而形成檢測位點和控制線。待膜干后，用切割機以3mm的間隔切開。第二抗體，即捕獲抗體可以是用于肌鈣蛋白I免疫測試的肌鈣蛋白捕獲抗體 (HyTest)，也可以是用于肌紅蛋白免疫測試的肌紅蛋白捕獲抗體M09983110 (Fitzgerald)。樣品墊(密理博公司，C068)浸入含0.5%吐溫20 (Tween 20)、5%蔗糖、0. 05%葡聚糖、5%疊氮化鈉的水溶液后，干燥并切成約10x3mm。如圖2B所示，偶聯物墊和樣品墊組裝在塑料墊，即膜和吸收墊的組件上。與圖2B 不同的是第二偶聯物墊的制造方法。下文將更詳細地描述第二偶聯物墊的制造方法。2.制備偶聯物墊的方法通過區分第一偶聯物墊和第二偶聯物墊來制造偶聯物墊。對于第一和第二偶聯物墊，GFC (密理博公司)被切成切3讓，并在涂布5 μ L實施方式1中所述的第一偶聯體和第二偶聯體后被干燥。
實施方式3 基于金納米顆粒大小的信號放大效應第一偶聯體使用直徑為IOnm或20nm的金納米顆粒，而形成第二偶聯體的金納米顆粒是制成不同大小(10、20、40、60nm)的，并且觀察到信號放大效應取決于金納米顆粒的大小。免疫層析試劑盒浸入96孔板中，孔中浸有70yL溶解了預定濃度的肌鈣蛋白I的血清(線性化學品公司(Linear chemicals), Cromatest)，并進行測量。第一偶聯體具有直徑IOnm的納米顆粒時的結果如表1和圖3A所示，K/S值取決于納米顆粒的大小(第一偶聯體的納米顆粒直徑為lOnm)。第一偶聯體具有直徑20nm的納米顆粒時的結果如表2和圖;3B所示，K/S值取決于納米顆粒的大小(第一偶聯體的納米顆粒直徑為20nm)。
權利要求
1.一種在免疫層析測試中放大信號的方法，包括將具有能特異性結合分析物第一表位的第一抗體、連接體、和與第一抗體和連接體結合的第一指示劑的第一偶聯體與分析物結合；將結合在第一偶聯體上的分析物與能特異性結合分析物第二表位的固定的第二抗體相結合；將具有能特異性結合第一偶聯體的連接體的第三抗體、和連接第三抗體的第二指示劑的第二偶聯體與第一偶聯體的連接體結合，其中，第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑的顆粒大于第一指示劑的顆粒，使得第二偶聯體比第一偶聯體更晚到達固定的第二抗體。
2.一種在免疫層析測試中放大信號的方法，包括將具有能特異性結合分析物第一表位的第一抗體、和與第一抗體結合的第一指示劑的第一偶聯體與分析物結合；將結合在第一偶聯體上的分析物與能特異性結合分析物第二表位的固定的第二抗體相結合；將具有能特異性結合第一偶聯體的第一抗體的第三抗體、和與第三抗體結合的第二指示劑的第二偶聯體與第一偶聯體的第一抗體結合，其中，第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑的顆粒大于第一指示劑的顆粒，使得第二偶聯體遲于第一偶聯體到達固定的第二抗體。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述連接體選自下組牛血清白蛋白(BSA)、 人血清白蛋白(HAQ、生物素、親和素和肽，并且不和分析物結合。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述第三抗體識別第一抗體為抗原，與第一抗體結合。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一指示劑的顆粒大小是約IOnm 到約20nm，而第二指示劑的顆粒大小是約20nm到約60nm。
6.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述指示劑是膠體金或者量子點。
7.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述分析物選自下組抗原蛋白質、脫氧核糖核酸(DNA)、環境激素、病原性毒物和食物中毒細菌。
8.一種免疫層析試劑盒，其包括樣品墊，含有分析物的液體樣品施加到墊上；偶聯物墊，包括具有特異性結合分析物的第一表位的第一抗體、連接體、和與第一抗體和連接體結合的第一指示劑的第一偶聯體、和具有特異性結合第一偶聯體的連接體的第三抗體和與第三抗體結合的第二指示劑的第二偶聯體，其中第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑大于第一指示劑，使得第二偶聯體遲于第一偶聯體到達固定的第二抗體；膜，包括檢測位點，其上固定的第二抗體能特異性結合與第一偶聯體結合的分析物的第二表位，和用于檢測偏差的對照位點；和吸收墊，通過毛細管現象吸收液體樣品。
9.一種免疫層析試劑盒，其包括樣品墊，含有分析物的液體樣品施加到墊上；偶聯物墊，包括具有特異性結合分析物的第一表位的第一抗體、和與第一抗體結合的第一指示劑的第一偶聯體、和具有特異性結合第一偶聯體的第一抗體的第三抗體和與第三抗體結合的第二指示劑的第二偶聯體，其中第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑大于第一指示劑，使得第二偶聯體遲于第一偶聯體到達固定的第二抗體；膜，包括檢測位點，其上固定的第二抗體能特異性結合與第一偶聯體結合的分析物的第二表位，和用于檢測偏差的對照位點；和吸收墊，通過毛細管現象吸收液體樣品。
10.如權利要求8所述的免疫層析試劑盒，其特征在于，所述連接體是牛血清白蛋白 (BSA)。
11.如權利要求9所述的免疫層析試劑盒，其特征在于，所述第三抗體識別第一抗體為抗原，與第一抗體結合。
12.如權利要求9或10所述的免疫層析試劑盒，其特征在于，所述偶聯物墊包括含有第一偶聯體的第一偶聯物墊和含有第二偶聯體的第二偶聯物墊，并制造成第一偶聯體和第二偶聯體不相互接觸。
13.如權利要求9或10所述的免疫層析試劑盒，其特征在于，所述第一指示劑的顆粒大小是約IOnm到約20nm，而第二指示劑的顆粒大小是約20nm到約60nm。
14.如權利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述指示劑是膠體金或者量子點。
15.如權利要求9或10所述的免疫層析試劑盒，其特征在于，所述分析物選自下組抗原蛋白質、脫氧核糖核酸(DNA)、環境激素、病原性毒物和食物中毒細菌。
全文摘要
本發明涉及用于分析物的高靈敏度檢測的免疫層析測試中放大信號的方法和使用該方法的免疫層析試劑盒，該方法通過區分第一指示劑的大小和第二指示劑的大小來控制流速實現放大信號。本發明的一個方面提出了在免疫層析測試中放大信號的方法，包括將具有能特異性結合分析物第一表位的第一抗體、連接體、和與第一抗體和連接體結合的第一指示劑的第一偶聯體與分析物結合；將結合在第一偶聯體上的分析物與能特異性結合分析物第二表位的固定的第二抗體相結合；將具有能特異性結合第一偶聯體的連接體的第三抗體，和連接第三抗體的第二指示劑的第二偶聯體與第一偶聯體的連接體結合，其中第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑的顆粒大于第一指示劑的顆粒，使得第二偶聯體比第一偶聯體更晚到達固定的第二抗體。根據本發明的另一個方面，一種免疫層析試劑盒包括樣品墊，含有分析物的液體樣品施加到墊上；偶聯物墊，包括具有特異性結合分析物的第一表位的第一抗體、連接體、與第一抗體和連接體結合的第一指示劑的第一偶聯體、和具有特異性結合第一偶聯體的連接體的第三抗體和與第三抗體結合的第二指示劑的第二偶聯體，其中第一偶聯體比第二偶聯體更接近固定的第二抗體，并且第二指示劑大于第一指示劑，使得第二偶聯體遲于第一偶聯體到達固定的第二抗體；膜，包括檢測位點，其上固定的第二抗體能特異性結合與第一偶聯體結合的分析物的第二表位，和用于檢測偏差的對照位點；和吸收墊，通過毛細管現象吸收液體樣品。因此，本發明可以實現信號放大而無需另外的機械控制或人工逐步反應。
文檔編號G01N30/90GK102227631SQ200880132189
公開日2011年10月26日 申請日期2008年11月28日 優先權日2008年11月28日
發明者張晉姬, 慎容范, 李星東, 申志勛, 裴柄宇, 金珉坤 申請人:英佛皮亞有限公司