Stat3和tyk2作為神經退行性疾病的藥物靶點的制作方法

專利名稱：Stat3和tyk2作為神經退行性疾病的藥物靶點的制作方法
STAT3和TYK2作為神經退行性疾病的藥物靶點
背景技術：
神經退行性疾病例如阿爾茨海默病(AD)主要影響老年人。AD是一種進行性 疾病，其導致認知下降和癡呆。AD的兩個病理性標志是細胞內神經原纖維纏結(neuro fibrillary tangle，NFT)和細胞外老年斑(senile plaque，NP)。前者在快死亡的細胞 中累積，而后者在神經細胞之間建立。神經退行性發病中牽涉到多個過程，包括β-淀粉 樣蛋白的產生、tau的高度磷酸化、氧化應激、炎癥、突觸衰竭和神經元調亡。但是，AD的 真實誘因仍待闡明。一種假設認為，AD中的神經元損失是由于毒性蛋白的積累。β-淀 粉樣蛋白是衍生自淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的切割產物，其作為細胞外斑在AD腦中積 累。新興的研究揭示特異性細胞內信號途徑的失調導致AD或Αβ-誘導的神經元調亡。 例如，發現JNK和ρ38的激活與小鼠AD模型相關(Savage等人，(2002) J Neurosci 22: 3376-8 。也已經證明糖原合酶激酶(GSK)-3途徑參與氧化應激誘導的神經元細胞死亡機 制(Koh 等人，(2003)Brain Res Mol Brain Res 118 :72-81 ;Takadera 等人，(2004)EurJ Pharmacol. 499 :239-45)。此外，GSK-3的抑制降低了 Αβ -誘導的神經毒性(Koh等人， (2008) Brain Res 1188 =254-62) 類似地，Wnt和Notch 二者的信號傳導在AD發病中具有 一定作用(De Strooper 等人，(2001) J Cell Biol 152 :F17_20 ；Anderton等人，(2000)Mol Med Today6 54-9)。目前，AD的臨床診斷需要評估醫療史和體檢，包括神經學、神經心理學和精神病學 評估，以及各種生物學、放射學和電生理學測試。雖然有這一連串檢測，但是只能通過死后 腦檢查來達到確切的診斷。因此，存在尚未滿足的需要，即需要一種可以在早期檢測神經退化并監視相關疾 病和病癥進展的簡單生化測試。老齡化人口，例如美國、歐洲和中國的老齡化人口正日益尋 求改進的診斷和治療AD和其它神經退行性病癥的工具。本發明涉及另一種信號途徑與AD病癥的關聯，以及涉及AD的分子機理中涉及的 兩個新靶標的鑒定，即STAT3蛋白和 Κ2， Κ2是STAT3的上游調節劑。STAT3和 Κ2主 要牽涉于AD診斷以及針對該疾病的治療藥物的開發中。之前僅僅表明STAT3的過表達與 炎癥和癌癥有關。STAT3及其上游調節劑 Κ2均在A β -誘導的神經細胞毒性中具有主要作用。在 AD腦的皮層和海馬中STAT3在705位酪氨酸的磷酸化增強，這可以促進皮層神經元的調亡， 而 Κ2調節STAT3的磷酸化和激活。阻斷這些靶標中的一個或二者能夠阻止A β -誘導的 細胞死亡并且能夠潛在地阻斷疾病進展。因此，本發明在開發治療AD的藥物、以及在診斷 該疾病中具有重要意義。

發明內容
在一些實施方式中，本發明提供了鑒定調控神經退行性病癥例如阿爾茨海默病 (AD)的化合物的方法和組合物。在一些實施方式中，所述方法包括以下步驟(i)將化合 物與STAT3或 Κ2多肽接觸；和(ii)測定該化合物對于STAT3或 Κ2的功能效應，其中所述功能效應指示該化合物調控神經退行性病癥。在一些實施方式中，所述方法包括以下 步驟(i)將化合物與編碼STAT3或 Κ2多肽的多核苷酸接觸；和(ii)測定該化合物對于 STAT3或 Κ2的功能效應，其中所述功能效應指示該化合物調控神經退行性病癥。本領域 技術人員將認識到此方法包括對照，例如在不存在所述化合物的情況下，或者在存在已知 激活劑化合物的情況下，測定STAT3和 Κ2的表達或活性。在一些實施方式中，神經退行性病癥的特征在于淀粉樣肽在腦中的沉積，例如阿 爾茨海默病(AD)。在一些實施方式中，神經退行性病癥選自AD、輕度認知損傷、帕金森病、 齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(DRPLA)、神經元核內透明包涵體病(NIHID)、路易體癡 呆、唐恩綜合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜銀顆粒癡呆、皮層基底退化、拳擊員 癡呆、彌散性神經原纖維纏結、GSS氏病(Gerstmann-Strausslerlcheinker disease)、哈 勒沃登-施帕茨病、克-雅二氏病、尼曼-皮克病3型、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全 腦炎、脊髓小腦共濟失調、亨廷頓病、皮克病和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥。在一些實施方式中，多核苷酸或多肽是重組的。在一些實施方式中，在體外測定功 能效應。在一些實施方式中，在真核細胞例如神經元細胞中測定功能效應。在一些實施方式中，通過測定 Κ2或STAT3的表達來測定功能效應。在一些實施 方式中，使用基于雜交的測定法例如RT-PCR來測定表達。或者，使用基于蛋白的測定法例 如免疫測定法來測定表達。在一些實施方式中，通過測定 Κ2的磷酸化或激酶活性來測定功能效應。在一些 實施方式中，通過測定STAT3的磷酸化例如705位酪氨酸的磷酸化來測定功能效應。在一 些實施方式中，通過測定STAT3的活性，例如二聚體化或下游轉錄激活來測定功能效應。在 一些實施方式中，通過測定細胞的調亡來測定功能效應。在一些實施方式中，化合物選自對 Κ2或STAT3特異性的反義分子、RNAi分子、 抗體或抗體片段、小肽、或有機小分子。本發明還提供了用于診斷神經退行性病癥和疾病的方法和組合物。在一些實施方 式中，所述方法包括以下步驟(i)從個體獲得生物樣品；(ii)測定所述樣品中 Κ2多核 苷酸或多肽的水平；和(iii)將步驟(ii)的樣品中 Κ2的水平與正常生物樣品中 Κ2的 水平進行比較，從而診斷所述個體中的神經退行性病癥。在一些實施方式中，測定步驟包括基于雜交的測定例如RT-PCR，或者，基于蛋白的 測定例如免疫測定。在一些實施方式中，測定步驟包括功能測定，例如激酶測定。在一些實 施方式中，測定并比較磷酸化的Tyk2的水平。在一些實施方式中，所述方法包括以下步驟(i)從個體獲得生物樣品；(ii)測定 所述樣品中STAT3多核苷酸或多肽的水平；和(iii)將步驟(ii)的樣品中STAT3的水平與 正常生物樣品中STAT3的水平進行比較，從而診斷所述個體中的神經退行性病癥。在一些實施方式中，測定步驟包括基于雜交的測定例如RT-PCR，或者，基于蛋白的 測定例如免疫測定。在一些實施方式中，測定步驟包括功能測定，例如，測定STAT3依賴性 的基因表達。在一些實施方式中，測定磷酸化的STAT3多肽的水平，例如在705位酪氨酸磷 酸化的STAT3。在一些實施方式中，神經退行性病癥的特征在于淀粉樣肽在腦中的沉積，例如AD 患者的腦。在一些實施方式中，神經退行性病癥選自阿爾茨海默病(AD)、輕度認知損傷、帕金森病、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(DRPLA)、神經元核內透明包涵體病(NIHID)、路 易體癡呆、唐恩綜合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜銀顆粒癡呆、皮層基底退化、 拳擊員癡呆、彌散性神經原纖維纏結、GSS氏病、哈勒沃登-施帕茨病、克-雅二氏病、尼 曼-皮克病3型、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎、脊髓小腦共濟失調、亨廷頓病、 皮克病和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥。在一些實施方式中，相對于正常樣品的 Κ2或STAT3的表達或活性水平指示個體 中的神經退行性病癥。在一些實施方式中，所述方法與其它診斷方法例如本文描述的那些 聯合使用。


圖1 轉基因AD小鼠模型的皮層和海馬中STAT3的酪氨酸磷酸化增加。A 裂解來 自9月齡APP/PS1 (具有Swedish突變KM670/671NL禾口 PSl ΔE9的ΑΡΡ695)雙轉基因小鼠 的腦的皮層、海馬和小腦并按照圖中所示進行免疫印跡。B 裂解來自不同階段的APP/PS1 轉基因小鼠的腦的皮層并按照圖中所示進行免疫印跡。圖2 在以A β 25-35刺激的培養的皮層神經元中，STAT3的酪氨酸磷酸化增加。使 用A β 25-35 (40 μ M ;Η20用作溶劑對照)處理7DIV的原代皮層神經元，持續圖中所示時間。 收集細胞裂解物并使用P_TyrSTAT3和總STAT3抗體進行免疫印跡。圖3 :STAT3的敲除保護神經元免受A β -誘導的調亡。A :STAT3的敲除減少了 Aβ 25-35處理誘導的PC12細胞的細胞死亡。使用STAT3siRNA轉染PC12細胞。STAT3的 Western印跡分析確認了經過STAT3siRNA轉染3天的PC12細胞中STAT3的敲除，但是使 用混雜siRNA轉染的PC12細胞則沒有STAT3的敲除(α -微管蛋白用作上樣對照)。以 Aβ 25-35將經過STAT3siRNA轉染3天的PC12細胞處理M小時。通過MTT測定法評估 細胞存活性，*代表P < 0. 05。B 阻斷STAT3的激活減弱了 Αβ 25-35處理后的神經元中 切割的胱天蛋白酶-3的增加。在Αβ 25-35處理之前，使用細胞通透性的STAT3抑制劑肽 (200yg/ml)預處理皮層神經元30分鐘。然后使用胱天蛋白酶_3抗體通過免疫印跡分析 細胞裂解物。對切割的胱天蛋白酶-3的水平進行定量。圖4 β -淀粉樣肽誘導的STAT3的磷酸化和神經元細胞死亡需要Tyk2。A 使用 各種抑制劑按圖中所示預處理原代皮層神經元2個小時，所述抑制劑包括JAK的強抑制劑 (JAK抑制劑1)、JAK2抑制劑(AG490)、Src酪氨酸激酶抑制劑(PP》和蛋白合成抑制劑(環 己酰亞胺)；然后使用A β 25-35肽處理4小時或M小時。使用P-TyrSTAT3和總STAT3抗 體對細胞裂解物進行免疫印跡。B 使用A β 25-35處理原代皮層神經元。使用Tyk2或JAK2 抗體對細胞裂解物進行免疫沉淀，然后以磷酸化-酪氨酸(P-Tyr)抗體進行Western印跡 分析。C:使用A β 25-35處理從Tyk2+小鼠制備的原代皮層神經元。使用P-Tyr STAT3、 總STAT3和胱天蛋白酶-3抗體對細胞裂解物進行免疫印跡。對酪氨酸磷酸化的STAT3和 切割的胱天蛋白酶-3的倍數變化進行定量分析(下面的圖版)。圖5 使用Aβ 25-35處理之后，PC12細胞中的STAT3的轉錄活性和培養的皮層神 經元中的iNOS RNA升高。A.使用STATl (pGAS_Luc)或STAT3 (pSTAT3_Luc)報道基因構建 體聯合內部對照質粒(β -半乳糖苷酶-PCMV)轉染PC12細胞。通過NGF使細胞分化4天， 然后使用A β 25-35或NGF (陽性對照)處理1天。測定樣品中的熒光酶活性并根據半乳糖苷酶的活性進行校正。結果根據半乳糖苷酶的活性進行校正；平均值士S.E.，η =3 ； *，ρ < 0. 05。B.使用STAT3抑制劑或JAK抑制劑I預處理7DIV的原代皮層神經元 30分鐘，然后使用A β 25-35 (40 μ Μ)處理6個小時。收集總RNA并進行逆轉錄。然后使用 iNOS引物對cDNA進行實時PCR分析。圖6 阿爾茨海默病患者的海馬中STAT3酪氨酸磷酸化增加。使用P_Tyr STAT3抗 體和神經元特異性標志物NeuN或神經膠質特異性標志物GFAP將AD患者的腦的石蠟切片 染色。P-Tyr STAT3染色的定量分析表明NeuN和GFAP的共定位。
具體實施例方式本發明建立了增加的STAT3磷酸化與神經退行性病癥例如阿爾茨海默病(AD)之 間的關聯。我們發現，AD的標志物β淀粉樣蛋白(Αβ)誘導STAT3的激活，并且這種STAT3 的激活是神經元細胞調亡所需要的。
Κ2是上游調節劑，其介導AD中Αβ誘導的STAT3的
酪氨酸磷酸化。如以下實施例中所證明，在多個表現出AD病癥的小鼠模型的腦的皮層和海馬中， STAT3的酪氨酸磷酸化一致升高。在具有老年斑(其為Αβ的沉積)的腦區域中也檢測到 了活化的STAT3(即，在705位酪氨酸磷酸化的STAT3)。相反，在野生型小鼠的皮層中則幾 乎檢測不到STAT3的酪氨酸磷酸化，因此說明了增加的pTyr-STAT3水平與AD病癥之間的關聯。STAT3與AD的另一個聯系是在705位酪氨酸磷酸化的STAT3與A β的關聯。發現 Αβ誘導STAT3的磷酸化和激活，其導致神經元細胞死亡。此外，當阻斷STAT3的激活時， A β誘導的細胞死亡顯著減少，這說明STAT3活性在A β誘導的神經元細胞死亡中具有重要 作用。本發明還包括新發現的 Κ2在AD病癥中的作用，其介導Αβ誘導的STAT3的酪 氨酸磷酸化。在源自 Κ2敲除小鼠的皮層神經元中，Αβ誘導的STAT3在705位酪氨酸的 磷酸化減少。因此，我們的累積發現鑒定了 STAT3和 Κ2作為開發用于神經退行性病癥的 藥物以及用于診斷的核心靶標。Α.定義本文使用的“STAT3”是指信號傳導子和轉錄激活子(STAT)蛋白家族的成員。 STAT3具有兩種剪接變體，命名為STAT3a (P92)和β (ρ83)。STAT3多肽的一個實例是 Genbank登記號Ρ40763. 2中描述的人類STAT3多肽，其705位氨基酸是酪氨酸。示例性的 STAT3編碼序列是Genbank登記號L29277中描述的人類序列。STAT3還指具有STAT3信號 傳導活性的物種同源物、剪接變體、多態性變體和STAT3的保守性修飾變體。本文使用的“ Κ2”是指酪氨酸激酶的Janus激酶(JAK)家族的成員。
Κ2多肽 的一個實例是Genbank登記號Ρ^597. 3中描述的人類多肽序列。示例性的 Κ2編碼序列 是Genbank登記號)(54637中描述的人類序列。
Κ2還包括具有 Κ2酪氨酸激酶活性的物 種同源物、剪接變體、多態性變體和 Κ2的保守性修飾變體。術語“神經退行性疾病”和“神經退行性病癥”在本文中相互替換地使用，是指以 下病癥，包括阿爾茨海默病(AD)、帕金森病、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(DRPLA)、神 經元核內透明包涵體病(NIHID)、路易體癡呆、唐恩綜合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜銀顆粒癡呆、皮層基底退化、拳擊員癡呆、彌散性神經原纖維纏結、GSS氏病、哈勒沃 登-施帕茨病、克-雅二氏病、尼曼-皮克病3型、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎、 脊髓小腦共濟失調、亨廷頓病、皮克病和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥。神經退行性病癥 的通常特征在于腦中的神經原纖維纏結和/或淀粉樣肽的沉積。神經退行性疾病或病癥的“診斷”是指預測與這些病癥相關的癥狀，例如受損的認 知功能、累積的Αβ沉積和神經元細胞死亡。在一些實施方式中，可以通過常規的簡易精神 狀態檢查(Mini-Mental StateExam)測定認知功能。在一個實施方式中，可以使用預后以 調整治療從而提供更好的結果。“生物樣品”包括組織切片，例如活組織檢查樣品(例如神經元活組織檢查)或用 于組織學目的的冷凍切片。此類樣品還包括血液和血液組分(例如血清、血小板、紅細胞 等)、腦脊髓液、培養的細胞，例如原代培養物、外植體和轉化的細胞、糞便、尿等。通常從哺 乳動物例如靈長類或人類獲取生物樣品。本文使用的“正常生物樣品”或“正常個體”代表基線值或對照。“正常”代表不患 有神經退行性病癥或不會患上神經退行性病癥的健康個體(按照標準方法測定，例如認知 測試或使用生物樣品，例如神經元活組織檢查或腦脊髓液)中的多核苷酸或核酸的水平。“核酸”、“核苷酸”或“多核苷酸”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以及它們的 單鏈或雙鏈形式的聚合物，及其互補物。該術語包括含有已知的核苷酸類似物或修飾的骨 架殘基或鍵的核酸，其為合成的、天然存在的和非天然存在的，其與參考核酸具有相似的結 合特征，并且其以類似于參考核苷酸的方式代謝。此種類似物的實例包括但不限于，硫代磷 酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另有指明，否則具體的核酸序列還暗指包括其保守性修飾的變體(例如簡并 密碼子替換)和互補序列，以及明確指明的序列。具體而言，可以通過產生“其中一個或 多個所選(或全部)密碼子的第三個位置被替換為混合堿基和/或脫氧肌苷殘基的序列” 來實現簡并密碼子替換(Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991) ；Ohtsuka 等人， J. Biol. Chem. 260 :2605-2608 (1985) ；Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes8 :91-98 (1994))。 術語核酸與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸相互替換地使用。術語“多肽”、“肽”和“蛋白，，在本文中相互替換地使用，其是指氨基酸殘基的聚合 物。該術語適用于這樣的氨基酸聚合物其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在的 氨基酸的人造化學模擬物，還適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合 物。術語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以類似于天然存在的氨基酸 的方式作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基 酸，以及后來經修飾的氨基酸，例如羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸 類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學結構的化合物，即與氫、羧基、氨基和 R基團結合的碳，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。此種類似物具有修 飾的R基團(例如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保持與天然存在的氨基酸相同的基本化 學結構。氨基酸模擬物是指結構不同于氨基酸的一般化學結構、但是以類似于天然存在的 氨基酸的方式作用的化學化合物。本文中可以通過其通常已知的三字符或IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字符來指稱氨基酸。類似地，可以通過其通常接受的單字符代碼來指稱核苷酸。“保守性修飾的變體”適用于氨基酸和核酸序列二者。關于具體的核酸序列，保守 性修飾的變體是指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者，當核酸不編碼氨基酸 序列時，該術語是指基本上相同的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量的功能上相同的核酸 編碼任意給定蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每 個被密碼子指定為丙氨酸的位置處，該密碼子可以改變成所描述任何相應密碼子而不改變 所編碼的多肽。此類核酸變體是“沉默變體”，其為保守性修飾變體的一種。本文中編碼多 肽的每個核酸序列也描述該核酸的每種可能的沉默變體。本領域技術人員將認識到，核酸 中的每個密碼子(除了 AUG之外，其通常是蛋氨酸的唯一密碼子；和TGG，其通常是色氨酸 的唯一密碼子)可以被修飾以產生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每個沉默 變體暗示在每個所描述的序列中，這是就表達產物而言，不是就實際探針序列而言。關于氨基酸序列，本領域技術人員將認識到對于核酸、肽、多肽或蛋白序列進行的 單個替換、刪除或添加(其改變、增加或刪除編碼序列中的單個氨基酸或很小百分率的氨 基酸)是“保守性修飾的變體”，其中所述改變導致氨基酸被替換為化學上相似的氨基酸。 提供功能上相似氨基酸的保守性替換表格是本領域眾所周知的。此類保守性修飾的變體是 除了本發明的多態性變體、物種間同源物和等位基因之外的變體，但保守性修飾的變體不 排除上述這些。術語“過表達(overexpress)，，、“過表達(overexpression)，，或“過表達 (overexpressed)，，相互替換地指，相對于正常細胞而言，在細胞中以可檢測的更高的水平 轉錄或翻譯的蛋白或核酸(RNA)。該術語包括由于轉錄、轉錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細 胞定位(例如細胞器、細胞質、細胞核、細胞表面)，以及RNA和蛋白質穩定性(相對于正常 細胞而言)而引起的過表達。可以使用檢測mRNA的常規技術(即RT-PCR、PCR、雜交)或 檢測蛋白質的常規技術(即ELISA、免疫組化技術)來檢測過表達。過表達可以是比正常細 胞高10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。在一些實例中，過表達是 相對于正常細胞而言高1倍、2倍、3倍、4倍或更高的轉錄或翻譯水平。術語“低表達(underexpress)”、“低表達(underexpression)，，或“低表達 (underexpressed) ”相互替換地指，相對于正常細胞而言，細胞中以可檢測的較低的水平轉 錄或翻譯的蛋白或核酸。該術語包括由于轉錄、轉錄后加工、翻譯、翻譯后加工、細胞定位 (例如細胞器、細胞質、細胞核、細胞表面)，以及RNA和蛋白質穩定性(相對于對照而言) 而引起的低表達。可以使用檢測mRNA的常規技術(即RT-PCR、PCR、雜交)或檢測蛋白質 的常規技術(即ELISA、免疫組化技術)來檢測低表達。低表達可以是對照低10 %、20 %、 30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或更低。在一些實例中，低表達是相對于對照而言 低1倍、2倍、3倍、4倍或更低的轉錄或翻譯水平。術語“差別化表達”或“差別化調節的” 一般是指相對于至少一種其它樣品而言， 在一種樣品中的蛋白或核酸是過表達(上調)或低表達(下調)。為了本發明的目的，通常 將來自于懷疑患有神經退行性病癥的個體的樣品與來自于已知患有該病癥(陽性對照)或 已知對該病癥為陰性(陰性對照)的個體的樣品進行比較。“標記物”或“可檢測部分”是可以通過分光光度法、光化學法、生物化學法、免疫化 學法、化學法或其它物理方法檢測的成分。例如，有用的標記物包括32P、熒光染料、電子密度高的試劑、酶(例如ELISA中通常使用的酶)、生物素、異羥基洋地黃毒苷(digoxigenin) 或半抗原和可以被制備成可檢測的蛋白(例如通過向肽中摻入放射性標志物)或用于檢測 與肽特異性反應的抗體的蛋白。標記物可以結合至靶向分子，例如抗體或用于特異性檢測 靶標化合物的核苷酸序列。當用于指稱例如細胞、核酸、蛋白或載體時，術語“重組”代表已經通過導入異源核 酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白而經過修飾的細胞、核酸、蛋白或載體，或者該細胞衍生自 經過所述修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在天然(非重組)形式的細胞中不存在的 基因，或者表達那些異常表達的、低表達的或根本不表達的天然基因。“抗體”是指這樣的多肽，其包含來自特異性識別并結合抗原的免疫球蛋白基因的 框架區或其片段。識別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε、和μ恒定區基因，以 及眾多的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分類為κ或λ。重鏈被分類為Y、μ、α、δ或 ε，其繼而又定義了免疫球蛋白的類別，分別是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗體的抗 原結合區對于結合的特異性和親和性是最重要的。抗體可以是多克隆的或單克隆的，衍生 自血清、雜交瘤的或重組克隆的，還可以是嵌合的、靈長源化的或人源化的。示例性的免疫球蛋白(抗體)結構單元包括四聚體。每個四聚體由兩對相同的多 肽鏈組成，每對具有一條“輕鏈”(大約25kDa)和一條“重鏈”(大約50-70kDa)。每條鏈的 N-末端定義了大約100至110或更多的氨基酸的可變區，主要負責抗原識別。術語輕鏈可 變區和重鏈可變區(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈。抗體以例如完整免疫球蛋白的形式存在，或以通過各種肽酶消化而產生的多種清 楚表征的片段的形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區的二硫鍵下消化抗體，從而產生 F(ab) ’ 2，其為Fab的二聚體，Fab本身是通過二硫鍵與Vh-ChI連接的輕鏈。F(ab)，2可以 在溫和條件下被還原以破壞鉸鏈區中的二硫鍵，從而將F(ab)’ 2 二聚體轉化為Fab’單體。 Fab，單體基本上是具有部分鉸鏈區的Fab (參見Fundamental Immunology (Paul ed.，3d ed. 1993)。雖然根據完整抗體的消化定義了多種抗體片段，但是本領域技術人員將認識到 可以通過化學方式或通過使用重組DNA方法從新(de novo)合成此類片段。因此，本文使 用的術語抗體還包括通過對整個抗體進行修飾產生的抗體片段，或那些使用重組DNA方法 從新合成的抗體片段(例如單鏈Fv)或那些使用噬菌體顯示文庫鑒定的抗體片段(參見， 例如 McCafferty 等人，Nature 348 :552-554 (1990))。本文使用的術語“單鏈抗體”(scFv)是指在多肽連接中包含VH結構域和VL結 構域(一般通過間隔子肽，例如[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x連接)的多肽，其可以在氨基和 /或羧基末端包含兩外的氨基酸序列。例如，單鏈抗體可以包含用于連接至編碼多核苷酸 的系繩區段(tethersegment)。作為一個實例，scFv是單鏈抗體。單鏈抗體一般是由一 個或多個多肽區段組成的蛋白，所述區段是實質上由免疫球蛋白超家族的基因編碼的至少 10 個連續氛基酸(例如，參見 Thelmmunoglobulin Gene Superfamily, A. F. Williams and Α. N. Barclay, in Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F. W. Alt, and T. H. Rabbitts, eds., (1989)Academic Press =San Diego,Calif.，pp. 361-387，通過引用并入本文)，最通常是由 嚙齒類、非人靈長類、禽類、豬、牛、綿羊、山羊或人類重鏈或輕鏈基因序列編碼。功能性單鏈 抗體通常包含足以保持對特定靶分子(通常是受體或抗原(表位))的結合特性的免疫球 蛋白超家族基因產物的一部分。
本文使用的“抗體”還可以指任何功能性VH和VL對(即能夠特異性結合表位)， 其各自以多種構型連接至可以執行多種功能的其它多肽，例如受體、受體抑制劑或VH-VL 復合物的穩定劑。本文使用的“免疫球蛋白可變區結構域”是指用作結合部分(不伴有VH或VL結 構域)的任何VH或VL結構域。就抗體而言，此類結構域可以以多種構型連接至可以執行 多種功能的其它多肽，例如受體、受體抑制劑或報道分子激活劑。當指稱蛋白、核酸、抗體或小分子化合物時，詞語“特異性(或選擇性)結合”是 指結合反應，其通常測定在蛋白或核酸及其它生物制劑的異質群體中是否存在蛋白或核酸 (例如STAT3、TYK2或其修飾形式)。在抗體的情況下，在指定的免疫測定條件下，指定抗 體與特定蛋白的結合可以是背景的至少2倍，更通常是背景的10倍以上至100倍。在這 樣的條件下與抗體的特異性結合需要那些就其針對特定蛋白的選擇性而被選擇的抗體。例 如，可以篩選多克隆抗體以只獲得那些與所選抗原具有特異性免疫反應而與其它蛋白沒有 特異性免疫反應的多克隆抗體。這種篩選可以通過減掉與其它分子有交叉反應的抗體來實 現。可以使用多種免疫測定形式來選擇與特定蛋白具有特異性免疫反應的抗體。例如，固 相ELISA免疫測定被常規地用于選擇與蛋白具有特異性免疫反應的抗體(參見例如Harlow & Lane，Antibodies, ALaboratory Manual (1988)，其描述了可用于測定特異性免疫反應性 的免疫測定的形式和條件)。在測定調控AD的化合物或神經退化生物標志物的測定中，詞語“功能效應”包括 測定間接或直接受本發明的生物標志物影響的參數，例如化學或表型效應。因此，功能效應 包括即刻的信號傳導事件，例如轉錄激活或磷酸化，或更間接的效應，例如基因表達或細胞 凋亡。“功能效應”包括體外的、體內的和離體的活性。“測定功能效應”意思是測定升高或降低那些間接或直接受本發明的生物標志物 影響的參數的化合物，例如測定物理和化學或表型效應。可以通過本領域技術人員已知 的任何方法來測定此類功能效應，例如通過分光光度特性的變化(例如，熒光、吸收、折射 率)；流體力學(例如形狀)、色譜法；或蛋白的溶解性特性；測定可誘導的標志物或標志物 的轉錄激活；測定酶(例如激酶)活性的變化；增加或減少細胞增殖、凋亡、細胞周期阻滯 的能力；測定細胞表面標志物的變化。可以通過本領域技術人員已知的很多方法來評估功 能效應，例如用于定量或定性測定形態特征變化的顯微鏡法，測定細胞中表達的其它基因 的RNA或蛋白水平的變化，測定RNA穩定性，鑒定下游或報道分子基因表達(CAT、熒光素酶、 β -gal、GFP等)，例如通過化學發光、熒光、比色反應、抗體結合、可誘導標志物等。神經退化生物標志物多肽的“活性”是指其天然細胞或組織中的多肽的結構、調節 或生物化學功能。神經退化生物標志物的活性包括直接活性和間接活性二者。示例性的直 接活性是催化活性，即 Κ2的激酶活性。磷酸化的STAT3的直接活性包括二聚體化和轉錄 激活。示例性的間接活性是針對多肽的直接活性產生的細胞或組織的表型變化或響應，例 如凋亡。可以通過例如測定被磷酸化的底物的量來測定催化活性。可以使用本領域已知的 方法評估其它活性，例如凋亡。標志物的“抑制劑”、“激活劑”和“調節劑”用于指使用神經退化生物標志物(例 如STAT3、 Κ2、磷酸化的STAT3、磷酸化的 Ι^)的體外和體內測定法鑒定的激活、抑制或 調節分子。“抑制劑”是例如結合、部分阻斷或完全阻斷活性、降低、阻止、延遲激活、滅活、去敏、或下調神經退化生物標志物的活性或表達的化合物。“激活劑”是增加、開啟、激活、 促進、增強激活、敏化、激動或上調神經退化生物標志物的活性的化合物，例如激動劑。抑 制劑、激活劑或調節劑還包括經過遺傳修飾的神經退化生物標志物，例如具有改變的活性 的形式，以及天然存在的和合成的配體、拮抗劑、激動劑、抗體、肽、環肽、核酸、反義分子、核 酶、RNAi和SiRNA分子，有機小分子等。抑制劑和激活劑的此類測定法包括，例如在體外、 細胞或細胞提取物中表達神經退化生物標志物、施用假定的調節劑化合物、然后測定對于 活性的功能效應，如上所述。將經過潛在的激活劑、抑制劑或調節劑處理的包含神經退化生物標志物(例如 Κ2、STAT3、磷酸化的STAT3、磷酸化的 Ι^)的樣品或測定與不含抑制劑、激活劑或調節 劑的對照樣品進行比較以檢測活性改變的程度。對照樣品(未經處理的或經過已知的調節 劑處理的)被分配為100%的相對蛋白活性值。當相對于對照的活性值是大約80%，優選 50%，更優選25-0%時，達到對于神經退化生物標志物的抑制。當相對于對照(未經激活劑 處理)的活性值是110%，更優選150%，更優選200-500% (即相對于對照高2至5倍)， 更優選高1000-3000%時，達到對于神經退化生物標志物的激活。術語“測試化合物”、“測試試劑”、“調節劑”或等價術語在本文中用于描述其直接 或間接調節神經退化生物標志物的能力待測的任何分子，無論是天然存在的還是合成的， 例如蛋白質、寡肽(例如長度是大約5至大約25個氨基酸，優選地，長度是大約10至20，或 12至18個氨基酸，優選地，長度是12、15或18個氨基酸)、有機小分子、多糖、肽、環肽、脂、 脂肪酸、siRNA、多核苷酸、寡核苷酸等。測試化合物可以是測試化合物的文庫的形式，例如 提供足夠多的多樣性的組合文庫或隨機文庫。測試化合物任選地連接至融合伴侶，例如靶 向化合物、挽救化合物(rescue compound)、二聚體化化合物、穩定化化合物、可尋址化合物 (addressable compound)和其它功能部分。方便地，通過鑒定具有某些想要的特性或活性 (例如抑制活性)的測試化合物(稱作“先導化合物”)、產生所述先導化合物的變體、評價 這些變體化合物的特性和活性來產生具有有用性質的新的化學實體。通常，應用高通量篩 選(HTQ來進行此類分析。術語“有機小分子”和“小分子”是指天然存在的或合成的有機分子，其具有大約 50道爾頓以上且大約2500道爾頓以下的分子量，優選大約2000道爾頓以下，優選大約100 至大約1000道爾頓，更優選大約200至大約500道爾頓。B. STAT3 禾口 TYK2STAT3屬于信號傳導子和轉錄激活子(STAT)蛋白家族。與該家族其它成員一樣， 它通過受體結合的激酶通過磷酸化被激活。一旦被磷酸化，STAT蛋白即形成同二聚體或異 二聚體，所述二聚體轉位至細胞核，在那里它們作為轉錄激活子發揮作用。除了二聚體化和 轉位至細胞核所需的酪氨酸磷酸化之外，STAT蛋白還需要絲氨酸磷酸化以進行最佳轉錄激 活(Zhang 等人，(1995) Science 267 :1990-94)。響應于生長因子(例如表皮生長因子、CSF-I和PDGF)和多種干擾素和細胞因子 (例如 IFNa、IL-6、LIF)的刺激，STAT3 被激活(Akira (2000) Oncogene 19 :2607-11)。通過 IL-6家族的細胞因子的STAT3激活導致多種功能響應。在刺激后，細胞因子與gpl30和其 它相關受體結合以引發Janus激酶(JAK)對STAT3的磷酸化。磷酸化發生在轉激活結構域 內的705位的氨基酸的單一酪氨酸位點，這導致STAT3的二聚體化、轉位和DNA結合(Levyand Lee(2002)J ClinInvest 109:1143-48)。由于它響應于大量的信號傳導分子而被激活并且介導多種不同的信號途徑，所 以STAT3的功能是普遍性的(即其作用可以引起增殖、促進存活或引起凋亡)。基于很多 已發表的報道，其功能包括誘導肝細胞癌細胞中的急性期應答(Alonzi等人，O001)Mol Cell Biol21 1621-32)，刺激B淋巴細胞增殖，激活單核細胞分化和生長阻滯(Heinrich 等人，(1998) Biochem J 334 :297-314)，維持胚胎干細胞的多能性(Raz等人，(1999) Proc Natl Acad Sci USA 96 J846-51)，以及在肝臟再生中的作用(Moh等人，(2007) Lab Invest 87 :1018-28).還發現STAT3的轉錄活性對于神經元細胞存活具有重要意義(Battle andFrank(2002)Curr Mol Med 2:381-92)。Tyk2屬于細胞內蛋白-酪氨酸激酶(PTK)的JAK家族，其包括JAK1、JAK2和JAK3。 這些PTK具有兩個串聯排列的激酶結構域羧基末端、功能性酪氨酸激酶(TK)結構域和鄰 近的激酶樣(KL)結構域。JAK通過多種細胞受體在信號傳導中發揮重要作用，如最初通過 其補充對于干擾素(IFN)無響應的突變細胞系的遺傳缺陷的能力所證明的。后來發現，與 幾乎所有已知的細胞因子受體的配體結合誘導一個或多個JAK家族成員的酪氨酸磷酸化。 這些PTK使下游效應子分子磷酸化，并且對于正確的配體-受體信號傳導是至關重要的。C. 一般的重組方法為了表達克隆的基因，例如編碼STAT3或 Κ2的cDNA，人們通常將編碼序列亞 克隆進入表達載體，所述表達載體包含指導轉錄的啟動子、轉錄/翻譯終止子、和用于翻 譯起始的核糖體結合位點。合適的細菌啟動子是本領域熟知的，見例如Sambrook等人和 Ausubel等人(見上文)的描述。用于表達CMRl蛋白的細菌表達系統可以在例如大腸桿 菌、桿菌屬(Bacillus sp.)和沙門氏菌屬(Salmonella)中獲得(Palva等人，Gene 22: 229-235(1983) ；Mosbach 等人，Nature302 :543-545 (1983))。用于此類表達系統的試劑盒 可以從商業渠道獲得。用于哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核表達系統是本領域熟知 的，也可以從商業渠道獲得。逆轉錄表達系統也可用于本發明中。用于指導異源核酸表達的啟動子的選擇取決于特定的應用。優選地，啟動子距離 異源轉錄起始點的距離大約等于在其天然環境中其距離轉錄起始點的距離。但是，本領域 已知的是，可以接受該距離的一些改變而不喪失啟動子功能。除了啟動子之外，表達載體通常包含轉錄單元或表達盒，其包含在宿主細胞中表 達編碼STAT3或 Κ2的核酸所需的所有其它元件。因此，典型的表達盒包含與編碼序列可 操作地連接的啟動子和轉錄物有效多聚腺苷化所需的信號、核糖體結合位點和翻譯終止。 盒的另外的元件可以包括增強子，如果使用基因組DNA作為結構基因，還可以包括具有功 能性剪接供體和受體位點的內含子。除了啟動子序列之外，表達盒還應該包含位于結構基因下游的轉錄終止區，以提 供有效的終止。終止區可以從獲取啟動子序列的相同基因獲得，或者可以從不同基因獲得。用于將遺傳信息傳遞至細胞的特定表達載體不是特別關鍵的。可以使用用于在真 核或原核細胞中表達的任何常規載體。標準的細菌表達載體包括質粒，例如基于PBR322的 質粒、pSKF、pET23D，以及融合表達系統，例如MBP、GST和LacZ。還可以向重組蛋白中加入 表位標簽以提供常規的分離方法，所述標簽為例如c-myc。可以在表達盒中包括序列標簽 以進行核酸挽救。可以在載體中包括標志物，例如熒光蛋白、綠色或紅色熒光蛋白、β-gal、CAT等，它們作為載體轉導的標志物。包含來自真核病毒的調控元件的表達載體通常用于真核表達載體，例如SV40載 體、乳頭瘤病毒載體、逆轉錄病毒載體和衍生自EB病毒的載體。其它示例性的真核載體包 括pMSG、pAV009/A+、pMT010/A+、pMAMneo-5、桿狀病毒pDSVE，以及任何其它允許在以下啟動 子的指導下表達蛋白的載體CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白 啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子或其它顯示出對 于在真核細胞中的表達有效的啟動子。還可以使用可誘導的啟動子調控從真核載體進行的蛋白表達。使用可誘導啟動 子，通過將響應于試劑(例如四環素或蛻皮激素)的元件引入啟動子中，使表達水平關聯于 這些誘導劑的濃度。一般而言，只有在存在誘導劑的情況下，從可誘導啟動子獲得高水平的 表達；基礎表達水平是極低的。使用標準轉染方法來產生細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞系，它們表達所選的蛋 白，然后可通過使用標準技術純化所述蛋白(參見，例如Colley等人，J. Biol. Chem. 264 17619-17622 (1989) ；Guide toProtein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher編，1990))。根據標準技術進行真核和原核細胞的轉化(參見， 例如 Morrison, J.Bact. 132 :349-351 (1977) ;Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101 :347-362 (Wu 等人編，1983)。可以使用任何熟知的用于將外源核苷酸序列導入宿主細胞的程序。這些包括使用 磷酸鈣轉染、聚凝胺(polybrene)、原生質體融合、電穿孔、生物彈(biolistics)、脂質體、 微注射、血漿載體、病毒載體和任何其它熟知的用于將克隆的基因組DNA、cDNA、合成的DNA 或其它外源遺傳材料導入宿主細胞的方法(參見例如Sambrook等人，見上文)。所用的具 體遺傳工程程序僅需要能夠成功地將至少一個基因導入宿主細胞。將表達載體導入細胞之后，在有利于表達所選蛋白(例如 Κ2或STAT3)的條件 下培養轉染的細胞。D.診斷方法本發明提供了預測、診斷神經退行性病癥例如AD的方法或為其提供預后的方法， 所述方法是通過檢測STAT3和 Κ2的表達或激活。預測和預后包括測定來自個體的生物樣 品中神經退化生物標志物表達或激活的水平，然后將該水平與對照基線或范圍進行比較。 通常而言，基線值代表不患有或不會患上神經退行性病癥(通過使用生物樣品例如神經元 細胞活組織檢查或體液樣品例如腦脊髓液來測定)的健康個體的多核苷酸或核酸的水平。 神經退化生物標志物的表達或激活水平的改變可以指示該患者具有神經退化的增加的風 險。此類方法可以與本領域已知的其它診斷方法聯合使用。1.基于核苷酸的測定在一些實施方式中，使用來自生物樣品的RNA通過實時或定量PCR來檢測 STAT3或 Κ2的表達。可以通過本領域技術人員已知的任何方法來提取RNA，例如使用 Trizol和RNeasy。可以通過本領域技術人員已知的任何方法進行實時PCR，例如使用 AppliedBiosystem測定法的Taqman實時PCR。相對于匯集的正常肺RNA計算基因表達，并 將該表達針對持家基因進行校正。合適的寡核苷酸引物由本領域技術人員選擇。在一個實施方式中，使用核酸結合分子例如探針、寡核苷酸、寡核苷酸陣列和引物來檢測RNA生物標志物，以檢測患者樣品中的差別化的RNA表達。在一個實施方式中，根據 本領域已知的標準方法使用RT-PCR。在另一個實施方式中，可以使用定量PCR測定法(例 如可以從例如Applied Biosystems獲得的Taqman 測定法)來檢測核酸及其變體。在 其它實施方式中，可以使用核酸微陣列來檢測核酸。可以使用常規技術例如northern分析 來實現核酸的分析，或者，任何其它基于與核酸序列雜交(所述核酸序列互補于標志物編 碼序列的一部分)的方法(例如條形斑點雜交)也包括在本發明的范圍內。可以根據本領 域技術人員已知的方法制備與選擇的核酸生物標志物結合的試劑，或者從商業渠道購買。可應用的PCR擴增技術描述于例如Ausubel等人和hnis等人(見上文)。一 般性的核酸雜交方法描述于 Anderson，“Nucleic AcidHybridization, ” BIOS Scientific Publishers，1999。多個核酸序列(例如基因組DNA、mRNA或cDNA)的擴增或雜交還可 以從排列在微陣列中的mRNA或cDNA序列進行。微陣列方法的一般性描述見Hardiman， "Microarrays Methods and Applications :Nuts & Bolts,"DNA Press,2003 ；禾口 Baldi 等 人，“DNA Microarrays and GeneExpression :From Experiments to Data Analysis and Modeling,，，Cambridge University Press, 2002。2.基于蛋白的測定和免疫測定在另一個實施方式中，可以使用本領域技術人員已知的多種免疫測定法中的任意 方法，在測定中使用抗體試劑來檢測生物樣品中本發明的神經退化生物標志物的表達和/ 或活性水平。免疫測定技術和程序的一般性描述見I^rice and Newman, "Principles and Practice ofImmunoassay, "2nd Edition, Grove ' s Dictionaries, 1997 ；禾口 Gosling, "Immunoassays :A Practical Approach,，，Oxford University Press,2000。可以使用 多種免疫測定技術，包括競爭性和非競爭性免疫測定。參見，例如klf等人，Curr. Opin. Biotechnol.，7 :60-65(1996)。術語“免疫測定”涵蓋的技術包括但不限于，酶免疫測 定(EIA)，例如酶放大免疫測定技術(EMIT)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、IgM抗體捕獲 ELISA (MAC ELISA)和微顆粒酶免疫測定(MEIA)；毛細管電泳免疫測定(CEIA)；放射免疫測 定(RIA)；免疫放射性測定(IRMA)；熒光極化免疫測定(FPIA)；和化學發光測定(CL)。如果 需要的話，此類免疫測定法可以進行自動化。免疫測定還可以與激光誘導的熒光聯合使用。 參見，例如 Schmalzing 等人，Electrophoresis, 18 :2184-93(1997) ；Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci.，699 :463-80 (1997)。脂質體免疫測定，例如流注射脂質體免疫測定和脂 質體免疫傳感器也適合用于本發明。參見，例如Rongen等人，J. Immunol. Methods, 204 105-133(1997)。此外，比濁法測定也適合用于本發明的方法中，其中，蛋白質/抗體復合 物的形成引起增加的光散射，其被轉化為峰速信號作為標志物濃度的函數。比濁法測定可 通過商業渠道從Beckman Coulter (Brea，CA ；Kit#449430)獲得，并且可以使用Behring Nephelometer Analyzer (Fink 等人，J. Clin. Chem. Clin. Biochem.，27 :261-276 (1989))來 進行。可以在本文描述的測定法中使用可檢測的部分以進行直接或間接檢測。可以使 用多種可檢測部分，標記物的選擇取決于所需的靈敏性、與抗體綴合的容易程度、穩定性需 求和可用的儀器和處理規定(disposal provision) 0合適的可檢測部分包括但不限于， 放射性核苷酸、熒光染料(例如熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC) .OregonGreen 、若丹明、 Texas red、異硫氰酸四甲基若丹明(TRITC)、Cy3、Cy5等)、熒光標志物(例如，綠色熒光蛋白(GFP)、藻紅蛋白等)、由腫瘤相關的蛋白酶激活的自動猝滅熒光化合物、酶(例如，熒光 素酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)、納米顆粒、生物素、異羥基洋地黃毒苷、金屬等。使用核酸特異性的化學發光抗體的化學發光測定法適合于進行蛋白水平的靈敏 性、非放射活性檢測。以熒光團標記的抗體也是適合的。熒光團的例子包括但不限于DAPI、 熒光素、Hoechst 33258、R-藻青蛋白、B-藻紅蛋白、R-藻紅蛋白、若丹明、Texas red和麗 絲胺(lissamine)。間接的標記物包括各種本領域熟知的酶，例如辣根過氧化物酶(HRP)、 堿性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。辣根過氧化物酶檢測系統可以與例如發色底物 四甲基聯苯胺(TMB) —起使用，其在存在過氧化氫的情況下產生可以在450nm檢出的可溶 性產物。堿性磷酸酶檢測系統可以與例如發色底物對硝基苯磷酸鹽一起使用，其產生可在 450nm容易地檢出的可溶性產物。類似地，β _半乳糖苷酶檢測系統可以與發色底物鄰硝基 苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG) —起使用，其產生可在410nm檢出的可溶性產物。脲酶檢 測系統可以與底物例如脲-溴甲酚紫(Sigma Immunochemicals ；St. Louis, MO) 一起使用。來自直接或間接標記物的信號可以這樣分析，例如使用分光光度計檢測來自發 光底物的顏色；使用放射計數器檢測放射，例如使用Y計數器檢測125I ；或者使用熒光計 在存在一定波長的光的情況下檢測熒光。對于酶聯抗體的檢測，可以使用分光光度計例如 EMAXMicroplate Reader (Molecular Devices ；Menlo Park, CA)根據生產商的說明書進行 定量分析。如果需要的話，本發明的測定可以自動化或由機器人操作，并且可以同時檢測來 自多個樣品的信號。可以將抗體固定在多種固體載體上，例如磁性或色譜基質顆粒、測定板的表面 (例如微量滴定孔)、多片固體基底物質或膜(例如塑料、尼龍、紙)等。可以通過將抗體或 多個抗體包被在固體載體上的陣列上來制備檢測條(assay strip)。然后可以將這種條浸 沒在測試樣品中并通過洗滌和檢測步驟迅速處理以產生可測定的信號，例如有色斑點。有用的物理形式包括，具有多個不連續、可尋址的位置的表面，以檢測多個不同的 標志物。此類形式包括微陣列和一些毛細設備。參見，例如Ng等人，J. Cell Mol. Med. ,6 329-340(2002)；美國專利號6，019，944。在這些實施方式中，每個不連續表面位置可以包 含抗體以固定一種或多種標志物，以便在每個位置進行檢測。或者，表面可以包含一個或多 個不連續顆粒(例如微顆粒或納米顆粒)，它們固定在表面的不連續位置上，其中所述微顆 粒包含抗體以固定一種或多種標志物以進行檢測。可以通過多種物理形式進行分析。例如，微量滴定板或自動化設備可用于促進大 量測試樣品的處理。或者，可以開發單一樣品形式以促進以實時的方式進行診斷或預后。或者，本發明的抗體或核酸探針可應用于固定在顯微鏡玻片上的患者活組織檢查 樣品的切片上。可以使用本領域已知的多種光學或熒光顯微鏡方法中的任一種來顯示產生 的抗體染色或原位雜交模式。在另一種形式中，本發明的各種標志物還提供了用于體內成像的試劑，例如標記 試劑的圖像，其檢測本發明的生物標志物的核酸或編碼的蛋白。非侵入性醫學成像技術，例如正電子發射斷層攝影(PET)或單光子發射計算機斷 層掃描(SPECT)成像對于檢測腦疾病是特別有用的。PET和SPECT成像顯示器官和組織的 化學功能，其它成像技術，例如X-射線、CT和MRI則顯示結構。PET和SPECT成像的使用在 定性和監視腦疾病例如AD的進展中的作用正日益增強。在一些情況中，使用PET或SPECT成像允許在癥狀出現數年之前檢出神經退行性病癥。該策略已經用于開發適合于人類腦中的淀粉樣蛋白沉積的體內成像的化合物。在 患有AD的患者中進行測試時，腦對于針對A β的單克隆抗體和肽片段的攝取是有限的。迄 今為止，用于淀粉樣蛋白成像的小分子方法是最成功的，其描述見例如Nordberg A5Lancet Neurol. ,3(9) :519-27(2004) ；Kung MP et al，Brain Res. , 1025(1-2) :98-105(2004)； Herholz K ·入，Mol Imaging Biol. ,6(4) :239-69(2004) ；NeuropsycholRev. ， Zakzanis KK 等人，13 :1-18(2003) ；HerhoIz K, Ann Nucl Med. , 17 :79-89(2003) 本文公開的診斷化合物或其片段可用于PET和SPECT成像應用的環境中。為了 PET或SPECT應用，以合適的示蹤殘基修飾后，可以使用診斷化合物(例如抗體片段，其與 神經退化生物標志物蛋白相互作用)來顯示這些生物標志物在個體中的水平。此類檢測是 AD腦的特征性神經毒性淀粉樣蛋白沉積的位置的指征。3.功能測定還可以使用功能測定來檢測神經退化生物標志物的表達或活性。鑒于 Κ2的已 知活性(例如酪氨酸激酶)和STAT3的已知活性(二聚體化、轉錄激活)以及本文公開的 那些活性，此類測定對于本領域技術人員是顯而易見的。用于檢測神經退化生物標志物的 活性的測定在以下部分中有更詳細的討論。4.另外的診斷方法用于診斷神經退行性病癥的方法是本領域已知的(參見，例如Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, FourthEdition(DSM-IV-TR), American Psychiatric Assoc. 2000)。一般而言，醫生或神經學者在對特定個體或患者進行診斷時將 考慮多個因素。例如，家族史經常是AD和其它神經退行性病癥風險的指征。醫生將進行化 學測試以檢查正常血液計數、甲狀腺功能、肝功、葡萄糖水平。脊髓液的分析通常是這種測 試的一部分。醫生還可以使用神經心理學測試來評估記憶、解決問題、注意力、視覺動作協調性 和抽象思維。這些包括空間練習和簡單的計算。簡易精神狀態檢查也是普遍的。CAT掃描和MRI也可用于排除腫瘤，并且可以提供關于腦退化區域的線索。E. STAT3和TYK2調節劑化合物作為神經退化生物標志物的調節劑進行測試的試劑可以是任何小的化學化合物， 或生物實體，例如蛋白質、糖、核酸或脂。通常，測試化合物將是小的化學分子、肽、寡核苷酸 或抗體片段。1.抗體和抗體片段在一些實施方式中，抗體或其表位結合片段可用于抑制STAT3和 Κ2活性。本領 域已知有數種對這些蛋白特異性的抗體，并且可從商業渠道獲得(參見，例如^witrogen 產品目錄，可從網站invitrogen. com獲得；以及BD Biosciences的產品目錄，可從網站 bdbiosciences. com 獲得)。或者，可以使用標準技術從新(de novo)產生 Κ2或STAT3抗體(參見，例如 Kohler & Milstein， Nature 256 :495-497(1975) ；Kozbor φ A, Immunology Today 4 72(1983) ；Cole 等人，pp. 77_96inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985))。 用于生產單鏈抗體的技術(美國專利4，946，778)可適用于生產針對本發明的多肽的抗體。另外，轉基因小鼠或其它生物體例如其它哺乳動物，可用于表達人源化抗體。或 者，噬菌體顯示技術可用于鑒定特異性結合所選抗原的抗體和異聚的Fab片段(參見， 例如 McCafferty 等人，Nature348 :552-554(1990) ；Marks 等人，Biotechnology 10 779-783(1992))。一般而言，抗體抑制劑包括保持對于抗原或表位(例如 Κ2、STAT3、磷酸化的 STAT3、磷酸化的 Κ2)的特異性的抗體片段。抗體抑制劑通常靶向抗原的功能性結構域， 例如，TYK2的激酶結構域或STAT3的二聚體化結構域。在一些實施方式中，抗體抑制劑包括單鏈抗體，例如scFV。在一些實施方式中，抗 體抑制劑包括Fab區域。在一些實施方式中，抗體抑制劑是人源化的。2.核酸抑制劑調節劑還包括設計為降低編碼神經退化生物標志物多肽的mRNA的水平的試劑 (例如反義分子、核酶、DNA酶、小的抑制性RNA等)或降低從mRNA的翻譯水平的試劑(例 如翻譯阻滯劑，例如互補于翻譯起始點或mRNA分子上的其它序列的反義分子)。在一些實 施方式中，使用已知的方法來鑒定抑制神經退化生物標志物的核酸序列。此類抑制劑可以 包括但不限于，siRNA寡核苷酸和反義寡核苷酸。抑制劑siRNA或反義寡核苷酸可用于特 異性地靶向 Κ2和STAT3表達。在一些實施方式中，使用RNA干擾來產生小的雙鏈RNA，小的干擾RNA (SiRNA)或 短發夾RNA(shRNA)抑制劑以影響 Κ2和STAT3的表達，這一般是通過切割和破壞其同源 RNA來進行。小的干擾RNA (siRNA或shRNA，二者相互替換地使用)通常是19_22nt的雙鏈 RNA。可以通過化學合成或通過基于DNA載體的RNAi技術獲得siRNA。使用基于DNA載體 的siRNA技術，將小的DNA插入子(大約70bp，其編碼靶向目標基因的短發夾RNA)克隆進 入商業上可獲得的載體。包含插入子的載體可以轉染進入細胞，并表達所述短發夾RNA。發 夾RNA迅速被細胞機制處理成19-22nt的雙鏈RNA (siRNA)。siRNA —般插入到合適的RNAi 載體中，因為合成制備的siRNA傾向于具有較低的穩定性并且在轉染中不那么有效。可以使用例如以下參考文獻中描述的方法和算法來制備siRNA :Wang等人， (2004)A Web-based Design Center for Vector-basedsiRNA and siRNA cassette Bioinformatics. (In press) ；Khvorova 等人，(2003)Cell. 115(2) :209-16 ；Harborth φ 人，(2003)Antisense NucleicAcid Drug Dev. 13(2) :83-105 ；Reynolds ^A, (2004)Nat Biotechnol. 22 :326-30 ；以及 Ui-iTei 等人，(2004)Nucleic Acids Res. 32 :936-48 用 于構建siRNA序列的其它工具是網上的工具，例如siRNA TargetFinder and Construct Builder,可從 GenScript 獲得；Oligo Design andAnalysis Tools,可從 Integrated DNA Technologies 獲得；或 siDESIGN Center，可從 Dharmacon, Inc.獲得。建議使用 ORF(開 放讀碼框)作為靶標選擇區，優選起始密碼子下游50-100nt處，來構建siRNA。3.肽和小分子抑制劑作為本發明的多肽或多核苷酸的調節劑進行測試的試劑可以是任何小的化學化 合物或生物實體，例如蛋白、糖、核酸或脂。測試化合物通常包括小的化學分子和肽。肽抑 制劑可以被設計為模擬所靶向的分子的天然配體或結合伴侶。在本發明的上下文中，示例 性的STAT3的肽抑制劑可以從例如STAT3 二聚體化伴侶來設計。示例性的 Κ2的肽抑制 劑可以從例如 Κ2的天然底物來設計。
基本上任何化學化合物可用作本發明的測定中的潛在調節劑，雖然最經常使用的 是可溶于水或有機(尤其是基于DMSO的)溶液的化合物。測定被設計為通過自動化進行 測定步驟并從任何方便的來源為測定提供化合物來篩選大的化學文庫，通常平行地運行 (例如，在自動化測定中在微量滴定板上以微量滴定的形式進行)。將認識到，有很多化學 化合物的供應商，包括 Sigma (St. Louis, MO)、Aldrich (St. Louis, MO)、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)、FlukaChemika-Biochemica Analytika(Buchs, Switzerland)等。在一個實施方式中，高通量篩選方法包括提供組合化學或肽文庫，其包含大量的 潛在的治療化合物(潛在的調節劑化合物)。然后按照本文的描述，在一個或多個測定中篩 選此類“組合化學文庫”或“肽文庫”，以鑒定那些顯示出想要的特征性活性的文庫成員(尤 其是化學種類或亞類)。由此鑒定的化合物可以作為常規的“先導化合物”或者它們自身可 用作潛在的或實際的治療劑。組合化學文庫是一般通過化學合成或生物合成而產生的多種化學化合物的集合， 通過組合多個化學“構建模塊”來實現。例如，通過以對于給定化合物長度(即多肽化合物 中的氨基酸數目)而言每種可能的方式組合一組化學構建模塊(氨基酸)而形成線性組合 化學文庫，例如多肽文庫。可以通過化學構建模塊的此類組合混合來合成數以百萬的化學 化合物。組合化學文庫的制備和篩選是本領域技術人員熟知的。此類組合化學文庫包括 但不限于，肽文庫(參見，例如，美國專利5,010, 175，Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37 487-493(1991)和 Houghton 等人，Nature 354:84-88(1991))。也可以使用其它用于產 生化學多樣性文庫的化學法。此類化學法包括但不限于，擬肽(ρ印toid)(例如PCT國 際公開號WO 91/19735)、編碼的肽(例如PCT國際公開號WO 93Λ0242)、隨機生物寡聚 物(例如PCT國際公開號WO 92/00091)、苯并二氮萆(例如美國專利號5，觀8，514)、 diversomers 例如乙內酰脲、苯并二氮革和二肽(Hobbs 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90 6909-6913(1993))(vinylogous polypeptide) (Hagihara ^A, J. Amer. Chem. Soc. 114 :6568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽類模擬肽(Hirschmann等人，J. Amer. Chem. Soc. 114 :9217-9218(199 )、小化合物文庫的類似物有機合成(Chen等人，J. Amer. Chem. Soc. 116 :2661 (1994))、寡氨基甲酸酉旨(Cho 等人，Science :1303 (1993))、和 / 或肽基 膦酸酯(Campbell 等人，J. Org. Chem. 59 :658 (1994))、核酸文庫(參見 Ausubel，Berger 和Sambrook，均見上文)、肽核酸文庫(參見，例如美國專利5，539，083)、抗體文庫(參見， 例如 Vaughn 等人，Nature Biotechnology,14(3) :309-314(1996)和 PCT/US96/10287)、 碳水化合物文庫(參見，例如Liang等人，Science, 274 :1520-1522(1996)和美國專利 5，593，85 、有機小分子文庫(參見，例如苯并二氮革，Baum C&EN, 1月18日，第33頁 (1993)；類異戊二烯，美國專利5，569，588 ；噻唑烷酮和間噻嗪酮，美國專利5, 549, 974 ；吡 咯烷，美國專利5，525，735和5，519，134 ；嗎啉化合物，美國專利5，506，337 ；苯并二氮革， 5，288，514 等)。用于制備組合文庫的設備可從商業渠道獲得(參見，例如，357MPS，390MPS， Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, ΜΑ,433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，很多組合文庫本身可從商業渠道獲得(參見，例如，ComGenex, Princeton, N. J.，Tripos, Inc.，St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD 等)。F.鑒定神經退化生物標志物的調節劑的方法用于篩選測定的神經退化生物標志物多肽和多核苷酸一般類似于野生型STAT3 和 Κ2序列并保持蛋白的至少一種生物活性。任選地，用于活性測定的神經退化生物標志 物多肽或多核苷酸將包含全長序列的片段，例如激酶結構域、或轉激活結構域。本發明的多 肽或其結構域將共價連接至異源蛋白以產生用于本文描述的測定中的嵌合蛋白。當本發明 的多肽相對于對照具有110%，任選為150%、200%、300%、400%、500%或1000-2000%的 活性值時，其是有活性的。使用重組的或天然存在的多肽來測定神經退化生物標志物活性的候選調節劑。蛋 白可以是分離的、在細胞中表達、在源自細胞的膜中表達、在組織或在動物中表達，可以是 重組的或天然存在的。例如，可以使用組織切片、解離的細胞(例如來自于表達本發明的多 肽的組織)、轉化的細胞、或膜。使用本文描述的體外或體內測定法之一來測試抑制情況。測試化合物與本發明的多肽、結構域或嵌合蛋白的結合可以在溶液中、在雙層膜 中、附著至固相、在脂單層中、或在囊泡中測定。可以使用例如分光光度特性(例如熒光、吸 收值、折射率)、流體力學(例如形狀)、色譜的或溶解性特性的變化來檢測所述測試化合物 的結合情況。將經過潛在的調節劑(例如，“測試化合物”)處理的樣品或測定與不含測試化合 物的對照樣品進行比較以檢測調節的程度。對照樣品(未經候選化合物處理)被分配為 100的相對活性值。當相對于對照的活性值是大約90%，任選50%，任選25-0%時，達到對 本發明的多肽的抑制。還提供了用于調節神經退化生物標志物多核苷酸和多肽的表達的化合物的篩選 測定。篩選方法一般包括進行基于細胞的測定，其中，將測試化合物與一種或多種表達 STAT3或 Κ2的細胞接觸，然后檢測表達的增加或減少(轉錄物或翻譯產物)。可以使用 任何表達STAT3或 Κ2多肽的細胞，例如神經元細胞，進行所述測定。可以通過多種不同方式檢測表達情況。如上文所述，神經退化生物標志物多核苷 酸的表達水平可以這樣測定使用與神經退化生物標志物轉錄物(或由其衍生的互補性核 酸)特異性雜交的探針來探測細胞中表達的mRNA。或者，可以使用免疫學方法檢測神經退 化生物標志物多肽，例如這樣的測定使用特異性結合多肽的抗體來探測細胞裂解物。報道分子系統也可用于鑒定神經退化生物標志物表達的調節劑。多種不同類型的 細胞可用于報道分子測定中。不內源表達神經退化生物標志物多肽的細胞可以是原核的， 但優選是真核的。真核細胞可以是任何常規用于產生具有重組核酸構建體的細胞的細胞。 示例性的真核細胞包括但不限于，HCN-I (皮層神經元)、132mi (星細胞瘤)、H4(神經膠質 瘤)、IMR32和PC12細胞系。可以設置各種對照以確保觀察到的活性是可信的，這包括使用不含報道分子構建 體的細胞進行平行反應，或者不將攜帶報道分子構建體的細胞與測試化合物接觸。可以使用多種體外和體內測定法來評估活性，從而測定功能、化學和物理效應。在 TYK2的情況下，這些測定法包括監視例如底物的催化磷酸化。在實施例中提供了示例性的 激酶測定。或者，可以通過將底物與 Κ2多肽在含有32P-YATP的緩沖液中溫育并測定磷酸化的底物的量來測定 Κ2將底物(例如STAB)磷酸化的能力。還可以使用形式為高通量用途的測定。例如，激酶催化Y-磷酰基從ATP轉移至合 適的羥基受體，并釋放質子。因此，使用適當匹配的緩沖液/指示劑系統的基于檢測該質子 的測定可用于檢測活性(參見,例如Chapman & Wong Bioorg Med Chem 10 :551-5,2002) 或者，可以使用 Κ2和STAT3-介導的胱天蛋白酶3的切割和細胞調亡來測定活 性。在此類測定中，檢測細胞調亡的標志，例如DNA片段化，細胞存活性。可以使用適合于 高通量篩選形式的測定法來檢測細胞存活性，例如比色法或熒光存活性測定。例如，Alamar blue (A^測定，引入氧化還原指示劑，其響應于代謝活性而改變顏色或熒光。在存在活細胞 的情況下，Alamar blue發熒光；在存在死細胞時，則不發熒光。可以在微量滴定板中或通 過流式細胞術讀取此類測定。比色測定例如MTT測定法(其測定MTT (3-G，5-二甲基)噻 唑-2-基-2，5- 二苯基四唑溴鹽還原為甲臜)也可方便地用于高通量形式，以測定細胞存 活性和增殖。還可以使用測定細胞數目的其它測定。這些包括測定染料摻入細胞DNA中的測定 法。摻入的染料的量直接與細胞數目成比例。例如，可以使用諸如Hoechst 33342的染料 將細胞染色，其摻入到活細胞的DNA中，通過測定熒光的量來確定細胞數目。還可以直接對 細胞進行計數。或者，可以使用 Κ2和STAT3下游的信號傳導事件來測定活性。例如，可以使用 本文描述的技術測定通過STAT3轉激活而激活的基因表達(例如iNOS、IRF-1)。或者，可 以檢測胱天蛋白酶-3的切割，如實施例中所描述。可以進一步測試那些通過任意前述篩選方法最初鑒定的化合物以驗證表觀活性。 優選地，使用合適的動物模型進行此類研究。此類方法的基本形式包括，向用作人類AD模 型的動物施用在最初篩選中鑒定的先導化合物，然后測定AD是否確實被調節和/或改善。 用于驗證研究的動物模型一般是任意種類的哺乳動物。合適的動物的具體實例包括但不限 于，靈長類、小鼠和大鼠。用于AD的示例性動物模型是APP/PS1小鼠。G.實施例1.實施例1 在阿爾茨海默病(AD)模型小鼠的腦組織中，STAT3在Tyr705的磷酸
化升高為了鑒定AD病癥中涉及的信號傳導途徑，篩選了 AD小鼠腦中多個信號傳導分子 的表達水平和功能狀態。從APP/PS1轉基因小鼠[APP (Swe)/PSl ( Δ E9)] (9月齡，其為清楚 表征的AD小鼠模型)制備腦組織的不同部分(包括皮層、海馬和小腦)的裂解物。發現 STAT3的酪氨酸磷酸化水平在AD小鼠腦的皮層中一致性升高(圖1Α)。這些發現表明在升 高的pTyr-STAT3水平和AD病癥之間存在關聯。在4個月至18個月大的AD小鼠的皮層中檢測到了升高的STAT3的酪氨酸磷酸化 (圖1B)。已經報道了這些AD小鼠在 6至7月齡時具有β-淀粉樣蛋白(Αβ)沉積，其 為AD腦中老年斑的主要成分，這表明STAT3的酪氨酸磷酸化發生在形成老年斑之前。在野生型小鼠的皮層中幾乎檢測不到STAT3的酪氨酸磷酸化，而在APP/PS1小鼠 的皮層中觀察到酪氨酸磷酸化的STAT3的顯著升高。通過免疫染色，我們發現有活性的(酪 氨酸磷酸化的)STAT3與NeuN陽性的神經元(> 80% )共定位，但不與GFAP-陽性的神經 膠質細胞共定位，這進一步表明STAT3的激活主要發生在AD小鼠腦的神經元中。此外，發現STAT3的酪氨酸磷酸化在AD小鼠腦中的產生區域類似于老年斑產生的區域(通過A β 染色指示)。2.實施例2 :Αβ誘導皮層神經元中STAT3的酪氨酸磷酸化使用培養的大鼠皮層神經元作為細胞培養模型來研究STAT3酪氨酸磷酸化在AD 中的作用。使用A β肽25-35處理皮層神經元(7DIV)。觀察到STAT3的酪氨酸磷酸化的顯 著升高，并且在Αβ處理的所有4個小時中持續磷酸化(圖幻。免疫染色顯示由Αβ處理 誘導的STAT3的酪氨酸磷酸化集中于β -微管蛋白III-陽性的神經元中。3.實施例3 :STAT3的敲低或STAT3活性的抑制保護神經元細胞免受A β誘導的 細胞調亡為了研究STAT3在AD中的神經元細胞死亡中的作用，使用STAT3siRNA敲低PC12 細胞中STAT3的表達。敲低了大約80%的STAT3蛋白(圖3A)。經過4天分化(通過NGF 誘導)之后，使用Αβ肽處理細胞。STAT3的敲低減少了 Αβ誘導的細胞死亡(圖4Α)。此 外，STAT3激活的抑制(通過使用特異性STAT3抑制劑處理細胞)降低了 Αβ誘導的切割 的胱天蛋白酶-3的水平(圖:3Β)，這指示了神經元細胞調亡的程度。胱天蛋白酶-3是細胞 內的半胱氨酸蛋白酶，其參與神經元細胞調亡。其作為針對細胞損傷的調亡響應的一部分 被激活。綜上，這些發現表明31413活性在々0肽誘導的神經元細胞死亡中具有重要作用。4.實施例4 :Tyk2介導A β誘導的STAT3的酪氨酸磷酸化，并且是A β誘導的神 經元細胞調亡所需要的。由于Αβ誘導STAT3的酪氨酸磷酸化，所以下一個目標是鑒定STAT3的上游調節 劑。在Αβ處理之前使用不同的抑制劑預處理皮層神經元。JAK抑制劑1(其對于STAT3上 游的多種酪氨酸激酶包括JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2具有強烈抑制效應)完全抑制了 A β誘 導的STAT3的酪氨酸磷酸化(圖4Α)。但是，JAK2的抑制劑AG490則不顯示類似于JAK抑 制劑1的抑制效應。這些發現說明A β誘導的STAT3的磷酸化是通過除了 JAK2之外的JAK 家族成員介導的。另外，Src激酶抑制劑ΡΡ2和蛋白合成抑制劑己酰亞胺都不影響Αβ誘導 的STAT3的磷酸化，這表明A β誘導的STAT3的磷酸化(i)不是通過Src途徑進行的；和 ( )不需要蛋白合成。使用Αβ肽處理皮層神經元1個小時。通過特異性抗體將內源性 Tyk2或JAK2免疫沉淀，通過單克隆的磷酸化-酪氨酸的抗體4G10來檢測沉淀物。與JAK2 不同，在Αβ處理的細胞中可以檢測出Tyk2酪氨酸磷酸化(圖4B)。然后檢測了 Tyk2在Αβ誘導的神經元細胞調亡中的參與情況。從Tyk2+小鼠制 備原代皮層神經元培養物。在對照神經元中，Αβ肽處理導致STAT3在Tyr705的酪氨酸磷 酸化。但是，在Tyk2+神經元中，這種特異性磷酸化降低(圖4C)。此外，在Tyk2+神經元 中，由Αβ誘導的胱天蛋白酶-3激活和神經元細胞調亡也減少。綜上，Tyk2是Αβ誘導的 STAT3磷酸化所需要的，并且其介導A β誘導的胱天蛋白酶-3切割和神經元細胞死亡。5.實施例5 皮層神經元中的Aβ處理誘導iNOS基因表達為了進一步表征A β肽是否影響STAT3的轉錄活性，使用連接至STAT3-響應增強 子元件的熒光素酶構建體(pSTAT3-Luc)轉染PC12細胞。連接至STATl-響應增強子元件 的熒光素酶構建體(pGAS-Luc)用作對照。與以前的報道相一致，NGF處理誘導了 STAT3和 STATl的啟動子活性，但是A β肽僅誘導STAT3啟動子活性(圖5Α)。以Αβ肽處理原代皮層神經元6個小時。通過實時PCR檢測誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA水平。iNOS是哺乳動物中的3種類型的一氧化氮合酶(NOS)之一，其負責 產生氣體信號傳導分子一氧化氮(NO)。iNOS在炎癥和病原體誘導的免疫應答中具有重要 作用。在暴露于某些細胞因子例如干擾素-Y (IFN-γ)之后，iNOS產生N0，其通過JAK家 族和STAT蛋白進行信號傳導。激活的STAT 二聚體化并轉位至細胞核，在那里它們增加轉 錄因子例如IRF-I的表達，IRF-I繼而結合至iNOS基因啟動子區域的特定DNA元件以增加 iNOS基因的表達。在Αβ肽處理之后，iNOS基因表達水平升高。有趣的是，iNOS基因表達的這種升 高可以通過STAT3抑制劑或JAK抑制劑I的預處理被阻斷，這表明JAK-STAT途徑對于A β 誘導的iNOS基因表達的上調是必需的(圖5B)。6.實施例6 :STAT3酪氨酸磷酸化在AD腦切片中是可見的為了確定在AD患者的腦中是否觀察到STAT3的酪氨酸磷酸化，將來自4位AD患 者的海馬腦切片進行染色。所有4位患者顯示出相似的染色樣式。在AD腦切片中清楚地 觀察到STAT3的酪氨酸磷酸化。通過免疫染色，我們還發現活性的STAT3與NeuN陽性的神 經元(大約70% )共定位，但不與GFAP-陽性的神經膠質細胞(大約7% )共定位，這與來 自APP/PS1轉基因小鼠腦切片的結果是一致的(圖6)。7.方法腦提取物、細胞提取物的制備和Wfestern印跡從不同階段(從2個月至18個 月)的轉基因小鼠中分離4個腦部分，包括皮層、海馬、小腦和紋狀體，并保持在干冰上。在 具有多種蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液05mM Tris-HCl, pH 7. 4,150mM NaCl, ImM EDTA, pH 7.4,50mM NaF)中將冷凍的腦組織勻漿。保留上清用于Western印跡，使用RIPA裂解緩沖 液(150mM NaCl, 1% (v/v)Nonidet Ρ-40，0. 5%去氧膽酸，0. 1% (w/v) SDS ；(其中含有多種 蛋白酶抑制劑O μ g/ml抑肽酶，ImM苯基甲基磺酰化氟，5mM芐脒，ImM原釩酸鈉(NaOV)和 1(^8/!111大豆胰蛋白酶抑制劑)重新提取沉淀物。收集原代培養的皮層神經元或PC12細 胞，并在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中裂解。免疫組化分析將石蠟腦切片在ImM EDTA緩沖液(pH 8. 0)中煮沸5分鐘，以 進行抗原恢復。按照生產商的說明書進行DAB或AEC染色。對于熒光免疫染色，在室溫 使用含0.4% "Triton X-100的PBS中的4%山羊血清將腦切片封閉20分鐘。在4°C使 用一抗(抗-NeuN ;1 200)和抗-磷酸化STAT3(Tyr705) (1 100)將切片溫育過夜， 然后在室溫使用Alexa Fluor 488-綴合的抗-小鼠和Alexa Fluor 568-綴合的抗-兔 子IgG(Invitrogen，l 1000)溫育1小時。然后洗滌切片并使用抗褪色劑(anti-fade reagent) (Invitrogen)進行封片，然后在 Olympus 共聚焦顯微鏡(Fluoview BX61, Olympus)下分析。使用4%多聚甲醛在室溫將培養的皮層神經元固定30分鐘，然后使用 含0. 4% Triton X-100的PBS中的4%山羊血清在室溫封閉20分鐘。在4°C使用抗-NeuN 單克隆抗體(1 500)和P-Tyr STAT3多克隆抗體(1 200)進行免疫組化分析過夜。 然后在室溫使用Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 568-綴合的抗-小鼠或抗-兔子 IgG(Invitrogen,l 1000)將細胞標記1小時。然后使用抗褪色劑(Invitrogen)將神經 元進行封片，并在Olympus共聚焦顯微鏡(Fluoview BX61, Olympus)下分析。細胞存活性根據生產商的說明書(細胞增殖試劑盒I，Roche)，通過細胞將四唑 鹽(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四唑溴鹽(MTT)還原為有顏色的甲臜產物的能力來定量細胞存活性。簡而言之，向細胞中加入(培養基體積的1/10)MTT試劑(5mg/ ml，在DPBS中)。在37°C將細胞溫育4個小時。向細胞中加入2倍體積的MTT增溶緩沖 液(0.01M HC1，10% SDS)，然后在37°C在黑暗中溫育M小時。使用平板讀數器(EYNEX REVELATION 4.22，MRC TC REVELATIONDYNEX TECHNOLOGIES)在 570nm 測定吸收值。僅有 活細胞攝入MTT。細胞存活性表示為Αβ處理的細胞的吸收值相對于對照培養物的吸收值 的百分率。胱天蛋白酶-3活性測定使用 CaspACE Assay System, Fluorometric kit (Promega)測定胱天蛋白酶_3的活性。簡而言之，將細胞裂解，并通過熒光測定法來測 定細胞提取物中胱天蛋白酶-3的活性。使用SpectraMaxGemini (激發波長為360nm ；發射 波長為460nm)測定由于胱天蛋白酶_3對熒光團AMC標記的底物肽DEVD的特異性切割而 產生的AMC的熒光發射。根據校正對照進行蛋白測定。定量RT-PCR 根據生產商的說明書，使用RNeasy微量試劑盒^jiagen)從Αβ處 理的皮層神經元分離總RNA。使用隨機六聯體(random hexamer) (Roche)合成第一條cDNA 鏈。使用Bio-RadMX3000P實時PCR系統，使用靶向特定基因的特異性引物進行定量PCR。應該理解本文描述的實施例和實施方式僅僅為了解釋的目的，其各種修飾或改變 對于本領域技術人員是可知的，并且包括在本申請的精神和范圍以及隨附的權利要求的范 圍內。本文引用的所有的公開物、專利和專利申請為了所有目的通過引用的方式全文并入 本文。
權利要求
1.用于鑒定調控神經退行性病癥的化合物的方法，所述方法包括以下步驟 (i)將化合物與STAT3或 Κ2多肽接觸；和( )測定該化合物對于STAT3或 Κ2的功能效應，其中所述功能效應指示該化合物調 控神經退行性病癥。
2.權利要求1的方法，其中所述神經退行性病癥的特征在于淀粉樣肽在腦中的沉積。
3.權利要求1的方法，其中所述神經退行性病癥選自阿爾茨海默病(AD)、帕金森病、齒 狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(DRPLA)、神經元核內透明包涵體病(NIHID)、路易體癡呆、 唐恩綜合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜銀顆粒癡呆、皮層基底退化、拳擊員癡 呆、彌散性神經原纖維纏結、GSS氏病、哈勒沃登-施帕茨病、克-雅二氏病、尼曼-皮克病3 型、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎、脊髓小腦共濟失調、亨廷頓病、皮克病和齒狀 核紅核蒼白球路易體萎縮癥。
4.權利要求1的方法，其中所述多肽是重組的。
5.權利要求1的方法，其中在體外測定所述功能效應。
6.權利要求1的方法，其中在真核細胞中測定所述功能效應。
7.權利要求6的方法，其中所述細胞是神經元細胞。
8.權利要求6的方法，其中通過測定細胞的調亡來測定所述功能效應。
9.權利要求6的方法，其中通過測定STAT3激活的轉錄來測定所述功能效應。
10.權利要求1的方法，其中通過測定STAT3的磷酸化來測定所述功能效應。
11.權利要求10的方法，其中所述磷酸化是在STAT3的705位酪氨酸處。
12.權利要求1的方法，其中所述功能效應是抑制STAT3的磷酸化。
13.權利要求1的方法，其中通過測定 Κ2激酶活性來測定所述功能效應。
14.權利要求1的方法，其中所述化合物是對于STAT3或 Κ2特異性的抗體或抗體片段。
15.權利要求1的方法，其中所述化合物是對于STAT3或 Κ2特異性的肽抑制劑。
16.權利要求1的方法，其中所述化合物是有機小分子。
17.用于鑒定調控神經退行性病癥的化合物的方法，所述方法包括以下步驟 (i)將化合物與編碼STAT3或 Κ2多肽的多核苷酸接觸；和( )測定該化合物對于STAT3或 Κ2的功能效應，其中所述功能效應指示該化合物調 控神經退行性病癥。
18.權利要求17的方法，其中所述神經退行性病癥的特征在于淀粉樣肽在腦中的沉積。
19.權利要求17的方法，其中所述神經退行性病癥選自阿爾茨海默病(AD)、帕金森病、 齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(DRPLA)、神經元核內透明包涵體病(NIHID)、路易體癡 呆、唐恩綜合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜銀顆粒癡呆、皮層基底退化、拳擊員 癡呆、彌散性神經原纖維纏結、GSS氏病、哈勒沃登-施帕茨病、克-雅二氏病、尼曼-皮克 病3型、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎、脊髓小腦共濟失調、亨廷頓病、皮克病和 齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥。
20.權利要求17的方法，其中所述多核苷酸是重組的。
21.權利要求17的方法，其中在體外測定所述功能效應。
22.權利要求17的方法，其中在真核細胞中測定所述功能效應。
23.權利要求22的方法，其中所述細胞是神經元細胞。
24.權利要求22的方法，其中通過測定細胞的調亡來測定所述功能效應。
25.權利要求22的方法，其中通過測定STAT3激活的轉錄來測定所述功能效應。
26.權利要求17的方法，其中通過測定STAT3或 Κ2的表達來測定所述功能效應。
27.權利要求沈的方法，其中使用免疫測定法來測定STAT3或 Κ2的表達。
28.權利要求沈的方法，其中通過RT-PCR來測定STAT3或 Κ2的表達。
29.權利要求17的方法，其中所述化合物是對于STAT3或 Κ2特異性的反義分子。
30.權利要求17的方法，其中所述化合物是對于STAT3或 Κ2特異性的RNAi分子。
31.診斷個體中的神經退行性病癥的方法，所述方法包括以下步驟 (i)從個體獲得生物樣品；( )測定所述樣品中STAT3多核苷酸或多肽的水平；(iii)將步驟(ii)的樣品中STAT3的水平與正常生物樣品中STAT3的水平進行比較， 從而診斷所述個體中的神經退行性病癥。
32.權利要求31的方法，其中檢測STAT3多肽的水平。
33.權利要求32的方法，其中檢測磷酸化的STAT3多肽的水平。
34.權利要求33的方法，其中所述磷酸化是在STAT3的705位酪氨酸處。
35.權利要求31的方法，其中測定步驟包括免疫測定。
36.權利要求31的方法，其中所述測定步驟包括RT-PCR。
37.權利要求31的方法，其中所述神經退行性病癥的特征在于淀粉樣肽在腦中的沉積。
38.權利要求31的方法，其中所述神經退行性病癥選自阿爾茨海默病(AD)、輕度認 知損傷、帕金森病、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(DRPLA)、神經元核內透明包涵體病 (NIHID)、路易體癡呆、唐恩綜合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜銀顆粒癡呆、皮層 基底退化、拳擊員癡呆、彌散性神經原纖維纏結、GSS氏病、哈勒沃登-施帕茨病、克-雅二 氏病、尼曼-皮克病3型、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎、脊髓小腦共濟失調、亨 廷頓病、皮克病和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥。
39.診斷個體中的神經退行性病癥的方法，所述方法包括以下步驟 (i)從個體獲得生物樣品；( )測定所述樣品中 Κ2多核苷酸或多肽的水平；(iii)將步驟(ii)的樣品中 Κ2的水平與正常生物樣品中 Κ2的水平進行比較，從 而診斷所述個體中的神經退行性病癥。
40.權利要求39的方法，其中所述測定步驟包括免疫測定。
41.權利要求39的方法，其中所述測定步驟包括RT-PCR。
42.權利要求39的方法，其中所述測定步驟包括測定 Κ2激酶活性。
43.權利要求39的方法，其中所述神經退行性病癥的特征在于淀粉樣肽在腦中的沉積。
44.權利要求39的方法，其中所述神經退行性病癥選自阿爾茨海默病(AD)、輕度認 知損傷、帕金森病、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(DRPLA)、神經元核內透明包涵體病(NIHID)、路易體癡呆、唐恩綜合征、哈勒沃登-施帕茨病、朊病毒疾病、嗜銀顆粒癡呆、皮層 基底退化、拳擊員癡呆、彌散性神經原纖維纏結、GSS氏病、哈勒沃登-施帕茨病、克-雅二 氏病、尼曼-皮克病3型、進行性核上性麻痹、亞急性硬化性全腦炎、脊髓小腦共濟失調、亨 廷頓病、皮克病和齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥。
全文摘要
本發明提供了對于診斷神經退行性病癥例如阿爾茨海默病的診斷具有重要意義的Stat3和Tyk2靶標。Stat3和Tyk2也是用于神經退行性疾病的藥物開發的重要靶標。
文檔編號G01N33/566GK102112879SQ200880130414
公開日2011年6月29日 申請日期2008年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者萬峻, 傅潔瑜, 葉玉如, 王學荊, 鄔振國 申請人:生物科技研究有限公司