專利名稱：診斷病毒的方法和系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種診斷病毒的方法，其包括以下步驟(a)收集樣品并裂解存在于 樣品中的病毒；(b)用特定的蛋白酶處理裂解的樣品從而將樣品中的蛋白消化成肽段；(C) 用質量測量裝置測量樣品中肽段的質量；和(d)將樣品中肽段的質量與來自于用和步驟 (b)相同的蛋白酶消化的已知病毒蛋白的肽段的質量進行比較，從而鑒定產生樣品肽段的 蛋白。本發明還涉及了用于進行上述診斷方法的診斷病毒的系統。
背景技術：
術語“病毒”是指由蛋白和遺傳物質例如DNA或RNA構成的傳染原。其大小與類 型有關，通常在IOnm至IOOOnm之間。因為不能自我復制，它要將自身DNA或RNA注入宿主 細胞例如細菌、植物或動物細胞中，然后利用宿主細胞的細胞器復制出新病毒。為此，宿主 細胞遭到破壞。根據病毒類型和宿主免疫狀態，一些病毒感染宿主后不會引起疾病，而一些病毒 感染宿主后會快速復制并擴散，導致宿主死亡或引起巨大經濟損失。最近，在韓國和其它國 家，高致病性禽流感(Al)病毒N5m在人畜共患傳染病方面，具有極高的危險因素，表現出 很高的死亡率。特別是，2003年以來，在包括中國，泰國，越南和印尼的14個國家中，H5m 病毒感染了 330人，導致了 240人死亡。為了建立針對由這些病毒引起的疾病的即時治療 和預防對策，需要非常快速且準確的疾病診斷。但是，能夠準確區分診斷這些疾病的診斷方 法是不足的，因此這類疾病正造成巨大的經濟損失。目前用于檢測病毒和病毒蛋白以及核酸的病毒診斷方法包括蛋內注射和免疫色 譜。特別是，蛋內注射法具有高度的檢測靈敏性，但為了檢測病毒需要2-5天的試驗期。同 時，采用免疫色譜的診斷方法能夠在短時間內檢測病毒蛋白，但其缺點在于檢測靈敏性較 低。盡管它可用于簡單診斷，但是由于這個優點，它不適合用于精確診斷，。此外，用于檢測 病毒的血清學測試方法包括血細胞凝集抑制(HI)測試和ELISA反應，但這些診斷方法需要 額外的試驗來檢查致病性。此外，對于RT-PCR來講，它是一種廣泛用于診斷病毒的方法，其使用與每個病毒 基因特異性結合的引物根據是否發生聚合反應來確定病毒基因的存在與否，在從進行測試 的受試者糞便或器官中提取的樣品中，同時存在低/高致病性病毒和污染物，例如多糖和 鹽時，則會出現假陰性結果。此外，通過RT-PCR中所用的引物難以區分致病株和非致病株。
發明內容
本發明人發現了通過裂解樣品，用質譜儀測量裂解樣品中的肽段的質量并比較所 測量肽段的質量和來自已知病毒蛋白的肽段的質量，可以快速并準確地鑒定含病毒樣品中 的病毒，從而完成本發明。因此，本發明的一個方面是提供診斷病毒的方法，其包括以下步驟(a)收集樣品 并裂解存在于樣品中的病毒；(b)用特定的蛋白酶處理裂解的樣品從而將樣品中的蛋白消化成肽段；(C)用質量測量裝置測量樣品中肽段的質量；和(d)將樣品中肽段的質量與來自 于用和步驟(b)相同的蛋白酶消化的已知病毒蛋白的肽段的質量進行比較，從而鑒定產生 樣品肽段的蛋白。本發明的另一方面是提供了診斷病毒的系統，其包括數據庫，該數據庫存儲了來 自病毒蛋白的肽段的質量相關信息；質量測量裝置，該質量測量裝置用于測量樣品中存在 的肽段的質量；和病毒蛋白匹配/過濾單元，該病毒蛋白匹配/過濾單元進行數據庫中信息 的過濾，且通過經測量的樣品肽段的質量信息和數據庫肽段的質量信息的比較，進行樣品 病毒蛋白的信息匹配，從而確定來自經測量的樣品肽段質量的信息。一個方面，本發明涉及診斷病毒的方法，其包括(a)收集樣品并裂解存在于樣品中的病毒；(b)用特定的蛋白酶處理裂解的樣品從而將樣品中的蛋白消化成肽段；(c)用質量測量裝置測量樣品中肽段的質量；和(d)將樣品中肽段的質量與來自于用和步驟(b)相同的蛋白酶消化的已知病毒蛋 白的肽段質量進行比較，從而鑒定產生樣品肽段的蛋白。下文中，將更具體地描述診斷病毒方法的每個步驟。步驟(a)樣品的收集和裂解如本文所用的，術語“樣品”表示包括從頻繁發生病毒感染的位點(例如血液，組 織，痰，尿，糞便等)收集的樣品、細胞培養樣品和自然獲取的樣品。可采用本領域公知的任 何方法收集樣品，優選將收集的樣品進行勻漿和梯度稀釋。如果所收集的樣品除待診斷病毒之外還含有許多雜質，可以額外進行從樣品中分 離病毒的步驟以去除這些雜質。為了進行從樣品中分離病毒的步驟，可采用本領域公知的 任何可從樣品中分離病毒的方法。在本發明的一種實施方式中，利用可以吸附多種小肽的 抗體、樹脂或微球的方法可用于從樣品中分離病毒。病毒分離方法的一個示例是免疫磁性 分離(IMS)。可用裂解緩沖液裂解樣品且無需任何其它處理。可選地，從樣品中分離的病毒可 用裂解緩沖液處理或通過超聲波或熱處理進行裂解。在本發明的一個實施方式中，用裂解 緩沖液處理從樣品中分離的病毒。為達到該目的，裂解緩沖液優選含有曲拉通(Triton) X-100和DL-二硫蘇糖醇(DTT)。非離子表面活性劑曲拉通(Triton)-IOO可以增強細胞膜 的滲透性，從而可用于裂解病毒，而DTT可以打開三維蛋白結構中的二硫鍵，以便減輕三維 結構對酶進入造成的困難。本發明所用的裂解緩沖液還可含有NaCl和Tris-HCl。通過此 步驟，將裂解樣品中存在的病毒。本發明中，盡管可以在步驟(a)之后立即進行步驟(b)，但是也可以在步驟(a)和 (b)之間增加過濾裂解樣品的步驟。通過這個過濾步驟，可從裂解物中去除裂解步驟所用的 緩沖液組成成分，并有利于通過質量測量裝置分析裂解物，同時可以獲得純的斷裂病毒體。步驟(b)蛋白酶處理如本領域所公知的，蛋白酶可將蛋白降解成肽段。優選在微波輻射下進行該步驟。 通過微波輻射產生的波長和高溫誘導蛋白-蛋白碰撞和分子-分子碰撞以利于通過蛋白酶 消化病毒蛋白，并通過抑制蛋白聚集來縮短蛋白消化所需的時間，蛋白聚集即蛋白消化期 間發生的蛋白重結合。此外，微波輻射可通過省去烷基化過程而縮短反應時間，而所述烷基化過程是為了阻止通過可用于破壞蛋白的三維結構從而利于蛋白酶進入蛋白的活性位點 的化合物(如DTT)打開的二硫鍵重結合所必須進行的。步驟(c)肽段質量的測量本發明的特征在于可用質量測量裝置測量通過蛋白酶降解病毒(即病毒的總蛋 白)獲得的肽段質量。對于質量測量裝置，優選使用質譜儀。在本發明中，MALDI-TOF MS(基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜儀)可用 于質量分析。例如，可使用Voyager De STR MALDI-TOF MS裝置。但是，本發明還可使用可 進行蛋白測量的多種類型的質譜(MQ和MS/MS。此處，例如，可使用芥子酸作為基質。影 響檢測效率的因素包括(1)延遲時間(DE)-—次激光輻射和下一次之間的時間間隔(納 秒)；(2)柵極電壓(％ )_肽段離子在MALDI-TOF MS管飛行直至被檢測器檢測到所需的能 量量級；C3)質量范圍-待檢測肽段的質量范圍；和(4)激光強度-激光輻射劑量。本領域 技術人員可確定適宜的這些因素。步驟(d)經測量肽段質量和已知肽段質量的比較例如，可通過以下步驟獲得已知病毒蛋白產生的肽段的質量。蛋白酶是可識別一 段氨基酸序列并切斷識別位點的酶。因此，可以推斷當用特定蛋白酶處理含有特定氨基酸 序列的蛋白時所獲得的肽段序列，參照已知氨基酸序列的質量可計算出肽段質量。根據所 計算的已知病毒蛋白產生的肽段質量，通過篩選具有與所測量肽段質量相同或最相似的質 量的肽段并鑒別具有產生該質量肽段的病毒蛋白從而鑒別樣品中的病毒。此外，可以通過確定在樣品中是否存在與用蛋白酶消化已知病毒中特異存在的一 組肽段的質量相匹配的一組肽段的質量來進行步驟(d)。本發明所述的病毒診斷方法可使用具有以下結構的系統來進行。在另一方面，本發明涉及用于診斷病毒的系統，其包括數據庫，該數據庫存儲了 來自病毒蛋白的肽段的質量相關信息；質量測量裝置，該質量測量裝置用于測量樣品中存 在的肽段的質量；和病毒蛋白匹配/過濾單元，該病毒蛋白匹配/過濾單元進行數據庫信息 的過濾，且通過經測量的樣品肽段的質量信息和數據庫肽段的質量信息的比較，進行樣品 病毒蛋白的信息匹配，從而確定來自經測量的樣品肽段的質量的信息。本發明中，所述質量測量裝置優選但不限于質譜儀。本發明所用的數據庫經構建使得其儲存理論質量，該理論質量是通過根據遺傳信 息(氨基酸序列或堿基序列)，計算將特定病毒蛋白用特定蛋白酶降解所能產生的肽段的 質量而獲得的。本文中，數據庫經構建使得肽段的質量與產生該肽段的病毒蛋白名稱和所 用蛋白酶名稱的信息聯系起來。本發明數據庫所包含的病毒蛋白和蛋白酶類型是沒有限制 的。本發明數據庫也可以在將來通過包含未知的病毒、蛋白和蛋白酶信息來進行擴充。本發明的病毒診斷系統可進一步包括樣品接收單元和用于將蛋白酶導入樣品接 收單元的蛋白酶存儲單元。樣品接收單元可進一步包括用微波輻射樣品接收單元的微波 源。此外，本發明的病毒診斷系統可進一步包括病毒信息輸出單元，其根據所提取的 病毒蛋白的信息輸出樣品所含的病毒信息。如果樣品含有病毒的多種信息，病毒信息輸出 單元可分別輸出每種信息。此外，在本發明的病毒診斷系統中，數據庫、質量測量裝置、病毒蛋白提取單元和病毒信息輸出單元優選通過網絡相互聯接。根據本發明，可快速并準確地診斷病毒。尤其是，在本發明中，在使用蛋白酶降解 待診斷的病毒總蛋白的過程中，用微波輻射樣品，以便蛋白降解成肽段所需的時間可以顯 著縮短，因此診斷病毒所需的時間也會縮短。因為使用的是病毒總蛋白，而不是只使用病毒 裂解后非結構蛋白從病毒中分離后所剩余的一些蛋白來診斷病毒，本發明可用于多種分析 應用，包括病毒的血清型分析和病原性分析和疫苗病毒的分析。此外，可通過相同或相似方 式診斷人、動物和植物病毒。
圖1顯示了如本發明所述的用質譜測量的肽段質譜圖。圖2顯示了如本發明所述的用質譜測量的肽段的質量數值，該質量數值以excel 文件的形式顯示。圖3顯示了將如本發明所述的用質譜測量的肽段的質量數值代入本發明診斷系 統的過程。圖4顯示了使用本發明診斷系統診斷的結果，結果表明了新城疫病毒以最高的一 致性得到診斷。圖5顯示了使用本發明診斷系統診斷的結果，結果表明了新城疫病毒以最高的一 致性得到診斷。圖6顯示了使用本發明診斷系統診斷的結果，結果表明了新城疫病毒以最高的一 致性得到診斷。
具體實施例方式實施例1 樣品的收集從疑似新城疫病毒感染的雞的組織、血液、痰、尿和糞中收集樣品。將所收集的樣 品勻漿，梯度稀釋并用于以下實施例2。實施例2 裂解從樣品中分離病毒，將10 μ 1 (含4. 811 μ g病毒/ μ 1) —等份病毒轉移至e管 中。并在其中加入20μ 1病毒裂解緩沖液[含曲拉通(Triton) X-100 (Amresco), 2mM DTT(DL-二硫蘇糖醇，Promega)，150mM NaCl (Amresco)和 IOmM Tris-HCl (Amresco)，pH 7. 4]，將混合液在室溫下溫育15分鐘。在如下所述使用Microcon之前，加入470 μ 1樹脂水以確定最大濃度。實施例3 裂解物的過濾使用微量離心過濾裝置(ΥΜ-3 ；額定分子重量限制3，000道爾頓；Amicon)從實 施例2所獲得的含有斷裂病毒體和病毒斷裂緩沖液混合物的反應溶液中分離純的斷裂病毒體。實施例4 通過微波輻射對蛋白的降解將25 μ 1的IOmM DTT加入到實施例3所獲得的10 μ 1病毒體溶液中，并輕微混合 20分鐘。并在其中加入20 μ 1胰蛋白酶溶液OO μ g/ml胰蛋白酶在50mM NH4HCO3)，然后用 注射針頭在e管蓋上穿孔以形成3-4個洞。接著，在家用微波爐(SAMSUNG RE-442B)中用微波輻射混合溶液10分鐘。輻射之后，將溶液在4°C冷卻5分鐘，然后加入20 μ 1標準品 (來自牛胰腺的胰島素；FW = 5733 ；SIGMA)實施例5 通過本發明方法對病毒的診斷A. MALDI-T0F 電離板(ID :100)用芥子酸(Fluka)作為基質，使用夾心法來靶定板上的病毒蛋白。具體而言，將40 μ 1 25%三氟乙酸(TFA ；MERCK)與960 μ 1樹脂水混合來制備1 % TFA 溶液。將 500 μ 1 TFA 溶液與 500 μ 1 乙腈(CAN ；99. 93+% HPLC 級；Sigma Aldrich) 混合，并在其中加入20 μ 1芥子酸(Fluka)。將混合溶液渦旋30分鐘，并將1 μ 1渦旋溶液 滴在電離板上，然后在空氣中干燥。然后，將實施例4所獲得的1 μ 1樣品溶液滴在電離板 上。此外，通過將990 μ 1丙酮(99+% HPLC級，Sigma Aldrich)與10 μ 1樹脂水溶液混合， 加入200ml SA并渦旋混合溶液獲得的1 μ 1溶液滴在電離板上，然后在空氣中干燥。B. MALDI-TOF MS 的進行通過使用Voyager DE STR MALDI-TOF MS反射器模式在以下條件下延遲時 間(DE) =IOOns ；柵極電壓(％ ) :68% ；質量范圍800-10000 ；和激光強度2205進行 MALDI-TOF MS，獲得樣品溶液中存在的肽段的質譜圖。在實施例5測量的肽段的質量數值以質譜圖(圖1)和excel文件(圖2)的形式 獲得，然后將測量的質量數值代入本發明的診斷系統中以進行樣品中存在的病毒診斷(圖 3)。在診斷結果中，診斷樣品中的病毒蛋白被診斷為新城疫病毒(圖4)的融合蛋白、新城 疫病毒的基質蛋白(圖幻和新城疫病毒的RNA依賴RNA聚合酶(圖6)，表明了樣品中的病 毒可準確診斷為新城疫病毒。根據本發明，可快速并準確診斷病毒。尤其是，在本發明中，在蛋白酶降解待診斷 的病毒總蛋白過程中用微波輻射樣品，以便蛋白降解成肽段所需的時間可以顯著縮短，因 此診斷病毒所需的時間也會縮短。因為使用的是病毒總蛋白，而不是只使用病毒裂解后非 結構蛋白從病毒中分離后所剩余的一些蛋白來診斷病毒，本發明可用于多種分析應用，包 括病毒的血清型分析和病原性分析和疫苗病毒的分析。此外，可通過相同或相似方式診斷 人、動物和植物病毒。
權利要求
1.一種診斷病毒的方法，該方法包括以下步驟(a)收集樣品并裂解存在于該樣品中的病毒；(b)用特定的蛋白酶處理裂解的樣品從而將樣品中的蛋白消化成肽段；(c)用質量測量裝置測量樣品中肽段的質量；和(d)將樣品中肽段的質量與來自于用和步驟(b)相同的蛋白酶消化的已知病毒蛋白的 肽段的質量進行比較，從而鑒定產生樣品肽段的蛋白。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(a)中病毒的裂解是在從樣品中分離病毒之 后進行的。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(a)中病毒的裂解是用裂解緩沖液處理病毒 而進行的，所述裂解緩沖液含有DTT和曲拉通X-100作為必要成分。
4.根據權利要求3所述的方法，所述方法還包括在步驟(a)之后，將裂解的樣品過濾的 步驟，以去除裂解緩沖液成分。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，進行步驟(b)的同時，用微波輻射所述樣品。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(c)中的質量測量裝置為質譜儀。
7.根據權利要求1所述的方法，其中，通過確定在樣品中是否存在與用蛋白酶消化已 知病毒中特異存在的一組肽段的質量相匹配的一組肽段的質量來進行步驟(d)。
8.一種診斷病毒的系統，該系統包括數據庫，該數據庫存儲了來自病毒蛋白的肽段的質量相關信息；質量測量裝置，該質量測量裝置用于測量樣品中肽段的質量；和病毒蛋白匹配/過濾單元，該病毒蛋白匹配/過濾單元進行數據庫信息的過濾，且通過 經測量的樣品肽段的質量信息和數據庫肽段的質量信息的比較，進行樣品病毒蛋白的信息 匹配，從而確定來自經測量的樣品肽段的質量的信息。
9.根據權利要求8所述的系統，其中，所述質量測量裝置為質譜儀。
10.根據權利要求8所述的系統，所述系統還包括樣品接收單元；和蛋白酶存儲單元，所述蛋白酶儲存單元用于將蛋白酶導入所述樣品接收單元。
11.根據權利要求10所述的系統，其中，所述樣品接收單元還包括用微波輻射樣品接 收單元的微波源。
12.根據權利要求8所述的系統，所述系統還包括病毒信息輸出單元，所述病毒信息輸 出單元根據所提取的病毒蛋白信息輸出樣品所含的病毒的信息。
13.根據權利要求12所述的系統，其中，如果樣品所含的病毒的信息數量為兩種或兩 種以上，所述病毒信息輸出單元分別輸出每種信息。
14.根據權利要求8所述的系統，其中，所述數據庫、質量測量裝置、病毒蛋白提取單元 和病毒信息輸出單元通過網絡相互聯接。
全文摘要
本發明公開了診斷病毒的方法，其包括以下步驟(a)收集樣品并裂解存在于樣品中的病毒；(b)用特定的蛋白酶處理裂解的樣品從而將樣品中的蛋白消化成肽段；(c)用質量測量裝置測量樣品中肽段的質量；和(d)將樣品中肽段的質量與來自于用和步驟(b)相同的蛋白酶消化的已知病毒蛋白的肽段的質量進行比較，從而鑒定產生樣品肽段的蛋白。還公開了用于進行上述診斷方法的診斷病毒的系統。
文檔編號G01N33/48GK102047111SQ200880129262
公開日2011年5月4日 申請日期2008年12月22日 優先權日2008年7月23日
發明者盧成沅, 張鎬彬, 樸成玭, 車仁碩, 鄭泰成 申請人:慶尚大學校產學協力團