抗體的穩定性試驗的制作方法

專利名稱：抗體的穩定性試驗的制作方法
抗體的穩定性試驗背景信息近年來制藥工業領域在以酶、抗體和細胞因子(例如促紅細胞生成素、干擾素、纖 溶酶原激活物等)為基礎的產品方面取得巨大成功。全世界對蛋白質治療藥物的需求逐年 增加。治療性單克隆抗體(mAbsnionoclonal迎tihodies)在蛋白質治療中是重要一類。它 們被稱為單克隆，因為相對于多克隆抗體，它們是由衍生自單個抗體形成細胞的免疫細胞 (細胞克隆)分泌的。單克隆抗體的特征在于它們每個僅直接對抗免疫原性物質的一個表 位，從而僅對抗一個抗原決定簇，并且因此在治療疾病中可以非常特異地應用。蛋白質治療 的實例是Roche Diagnostics GmbH Company(羅氏診斷有限責任公司)的單克隆抗體曲妥 單抗(商品名赫賽汀(Here印tin))、達珠單抗(商品名賽尼哌(Zenapax))和利妥昔單 抗(商品名美羅華(MabThera))，它們已經成功地用于治療乳腺癌(曲妥單抗)、器官排斥 反應(達珠單抗)和治療非霍奇金淋巴瘤(利妥昔單抗)。治療性單克隆抗體是通過復雜的生物技術方法獲得的。降解產物可以在它們制 備、配制和貯存過程中產生，這常常是由于例如氧化和脫酰胺反應以及蛋白酶剪切過程引 起的(Yan，B.等人，J. Chromatog.A 1164(2007) 153-161)。由于分子中結構改變，生物制品 的修飾可能導致活性和/或免疫原性的改變，即使它們僅輕微發生。除了它的作用之外，生物制藥產品的質量是決定性重要的。因此，為了安全應用它 們作為治療藥物，除了詳細研究作用方式之外，測定基于蛋白質的藥物的同一性、純度和活 性是完全必需的。盡管mAbs可以通過多種分離和試驗技術來成功分析，但是長期以來還難以應用 和優化RP-HPLC方法(RP-HPLC，反相高效液相色譜法)來分離抗體種類。但是，抗體的 多種修飾常常同時存在于降解過程中，這使得更難以分析不同色譜和電泳條帶。通過液 相色譜分離方法聯用高分辨質譜儀(LC/MS，液相色譜法/質譜法)的分析獲得了多種種 類準確質量的信息，并且因此便于鑒定抗體變體(Dillon，Τ. Μ.等人，J. Chromatogr. A, 1053(2004)299-305)。從人病原體化膿鏈球菌中獲得的半胱氨酸內切蛋白酶IdeS(免疫球蛋白降 解酶S)，其也稱為Mac-I或sib-38，是半胱氨酸蛋白酶，其特異性切割G型免疫球蛋 白(IgG)抗體的重鏈。IgG是迄今為止僅僅已知的IdeS底物(Vincents，B.等人， Biochem. 43 (2004) 15540-15549)。IdeS包含339個氨基酸，包括含29個氨基酸的信號肽 (von Pawel-Rammingen, U.等人，EMB0J. 21(2002) 1607-1615)，其中 RGD基序是由 214至 216 位氨基酸形成的。IdeS在識別序列LLGGP中的236和237位氨基酸(Gly-Gly)間切割人 IgG (G類免疫球蛋白)。人IgG2在識別基序PVAGP中的丙氨酸和甘氨酸間被切割。IgG2a 和 IgG3 型鼠抗體也被切割(Vincents, B.等人，Biochem. 43(2004) 15540-15549)。Hess, J. K.等人(Hess, J. K.等人，J. Microbiol. Meth. 70 (2007) 284-291)報道了 質譜方法，其借助SELDI-T0F質譜法測定IdeS的酶活性。在US2007/0237784中報道了從 化膿鏈球菌中分離并且具有IgG半胱氨酸蛋白酶活性的多肽。在歐洲專利申請EP 1 458 861中報道了形成抗體的Fc或Fab片段的方法。在WO 2006/131347中報道了來自A組鏈球菌的IdeS蛋白酶。發明概述本發明描述了用于檢測樣品中抗體和抗體片段或抗體修飾形式的方法，其特征在 于包括下列步驟a)提供包含抗體和/或其切割產物的樣品，b)將a)項中提供的樣品與下列物質溫育i) IgG特異性半胱氨酸蛋白酶，ii)糖苷酶，iii)還原劑，c)將b)項中溫育的樣品通過聯用的液相色譜法和質譜法進行分析以檢測a)項提 供的溶液中包含的完整的抗體和檢測抗體片段或修飾形式。在該方法的一個實施方案中，IgG特異性半胱氨酸蛋白酶是IdeS。在進一步的實 施方案中，半胱氨酸蛋白酶IdeS衍生自化膿鏈球菌或齒垢密螺旋體。在進一步的實施方案 中，IgG特異性半胱氨酸蛋白酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :1。另一個實施方案包括與IgG 特異性半胱氨酸蛋白酶在pH范圍為5. 5至8. 5之間溫育。在另一個實施方案中，pH范圍為 PH 7.0至8.0之間，并且在進一步的實施方案中在pH 7. 5至8.0之間。在進一步的實施方 案中，IgG特異性半胱氨酸蛋白酶與樣品中包含的抗體和/或抗體片段的摩爾比為1 25 至1 2500之間、優選1 25至1 100之間。在另一個實施方案中，糖苷酶是N-糖苷 酶F(PNGase F)。另一個實施方案的特征在于N-糖苷酶F衍生自腦膜炎膿毒性黃桿菌(EC 3. 2. 2. 18、EC 3. 5. 1. 52)。在另一個實施方案中是糖苷酶Endo H并且在pH 6. 0至6. 5之 間應用。在另一個實施方案中，糖苷酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :2。在另一個實施方案 中，該方法的特征在于將a)項提供的樣品在b)項中首先與IgG特異性半胱氨酸蛋白酶 溫育，隨后與糖苷酶溫育。在另一個實施方案中，還原劑是磷酸三氯乙酯(TCEP)。在另一 個實施方案中，還原劑與甲酸同時加入，并且溫育在兩種試劑的存在下進行。在進一步的實 施方案中，與還原劑的溫育在溫度為60°C或更高下進行。在進一步的實施方案中，質譜法 是電噴射離子化飛行時間質譜法(ESI-TOF)。在進一步的實施方案中，液相色譜法是疏水 性相互作用色譜法或η-η相互作用色譜法。在疏水性相互作用色譜法的情況中，另一個 實施方案中的色譜配體是C8或C18配體，其是鍵合至色譜材料上的，具有300埃的孔徑，或 者在JI-Ji相互作用色譜法的情況中，色譜配體是二苯基配體。在進一步的實施方案中，將 Jupiter C18柱或Zorbax 300SB C8柱或Pursuit 二苯基柱應用于液相色譜法。在另一個 實施方案中應用Pursuit 二苯基柱。在進一步的實施方案中，步驟c)中的液相色譜法是反 相色譜法。本發明的另一個方面是檢測抗體修飾形式的方法，其中步驟c)是通過疏水性相 互作用色譜法分析b)項中溫育的樣品。本發明還包括IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶在檢測樣品中的抗體或抗體片段中的 用途，其特征在于將樣品與IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶溫育，并且與糖苷酶溫育后，將獲 得的片段通過聯用的液相色譜法和質譜法分析。本發明的一個方面還是用于檢測抗體或抗體片段的試劑盒，其特征在于該試劑盒 包含i)來自化膿鏈球菌的IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶，和
ii)來自腦膜炎膿毒性黃桿菌的內切糖苷酶N-糖苷酶F。發明詳述本研究關注治療性單克隆抗體的降解產物和修飾物的分析，其是例如在抗體的生 產、抗體的貯存過程中或者通過抗體配制過程中的應激條件形成的。“多肽”是包含由肽鍵連接在一起的氨基酸的聚合物。其可以是通過酶解或合成產 生的。包含小于20個氨基酸的多肽也稱為“肽”。“蛋白質”是大分子，其包含兩個或多個多肽，或者它是包含超過100個氨基酸的多 肽。蛋白質也可以包含非肽組分，例如碳水化合物。碳水化合物和其它非肽修飾物是通過 表達蛋白質的細胞加入的，并且因此取決于細胞類型。在本申請中，蛋白質是通過它們的氨 基酸序列來定義的。修飾物(例如碳水化合物)沒有明確描述，但是經常存在。本申請中同義應用的術語“抗體”和“免疫球蛋白”表示包含至少兩條輕多肽鏈 (LC)和兩條重多肽鏈(HC)的分子。每條輕和重多肽包含可變區(通常是多肽的氨基端)， 其包含結合抗原的結合域。每條重和輕多肽包含恒定區(通常是多肽的羧基端)，其例如 負責抗體與細胞的結合。輕多肽或輕鏈(LC)通常包含可變域\和恒定域Q。重多肽或 重鏈(HC)通常包含可變域￥11和恒定區，恒定區包含結構域(^1、鉸鏈區、Ch2、Ch3和任選的 Ch4。抗體可以以多種形式出現，例如Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈(scFv)(例如Huston, J. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883 ；Bird, R. Ε.等人，Science 242(1988)423-426 ；和 Hood，L. Ε.等人，Immunology, Benjamin N. Y.，第 2 版(1984)以及 Hunkapi 1 Ier，Τ.和Hood，L.，Nature 323(1986) 15-16)。取決于抗體重鏈恒定區的氨基酸 序列，將抗體(免疫球蛋白，Ig)分為多個種類=IgA, IgD, IgE, IgG和IgM0這些種類中的 一些進一步細分為亞類(同種型)，例如IgG分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ；或者IgA分 為IgAl和IgA2。取決于抗體所屬的類型，將重鏈恒定區稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、 Y (IgG)和 μ (IgM)。通用色譜方法是本領域技術人員已知的，例如Chromatography (色譜)， 第 5 版，A 部 fundamentals and Techniques (原理與技術)，Heftmann, E.(編輯)， Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) ；AdvancedChromatographic and Electromigration Methods in Biosciences (生物科學中的高等色譜禾口電遷 移方法)，Deyl, Z.(編輯)，Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998) ；Chromatography Today (今曰色譜)，Poole, D. F.禾口 Poole，S. K.，Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991) ；Scopes, Protein Purification Principles and Practice (蛋白質純化原理與實踐)(1982) ；Sambrook, J.等人(編 輯)，Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y. ,1989 ；或Gurrent Protocols inMolecular Biology (分子生物學最新方法)，Ausubel，F. Μ.等人(編輯)，JohnWiley & Sons, Inc. , New York。抗體是可以進行修飾和降解處理的生物大分子。這些可以基于酶(催化)或非酶 (非催化)處理(Perkins, Μ.等人，Pharm. Res. 17(2000) 1110—1117)。以下描述了經常出 現的非酶降解反應的實例。氨基酸的氧化
抗體的氧化相應于重鏈和輕鏈的氨基酸的共價修飾，其是由活性氧類別誘導的。 原則上，即使幾乎所有氨基酸可以被氧化，但是甲硫氨酸(M)和色氨酸(W)是對氧化最敏感 的。這些氨基酸的氧化(參見

圖1)是特別值得注意的，因為這出現在非常多的不同蛋白質 中，并且經常降低或消除它們的生物學活性，誘導聚集并且促進蛋白質水解(Houde，D.等 人，J. Chromatogr. A 1123(2006) 189-198)。對于氧化的類別，甲硫氨酸簡單氧化成甲硫氨 酸亞砜產生質量差Am = +16Da。色氨酸通常被氧化兩次，其產生質量差Am = +32Da。在 進一步的反應中，色氨酸的兩次氧化形式常常重排為犬尿氨酸，產生質量差Δπι = +4Da。氨基酸的脫酰胺抗體分子中氨基酸的脫酰胺可以發生在天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)上。但是， 通常是天冬酰胺受到影響。另外，某些氨基酸序列和氨基酸組合(例如天冬酰胺和甘氨酸 (NG)、天冬酰胺和絲氨酸(NS)以及天冬酰胺和蘇氨酸(NT))是特別易感的。天冬酰胺的脫 酰胺是貯存過程中生物分子降解的主要原因。折疊的完整抗體的脫酰胺最初僅在應激增高 的條件下緩慢發生。當抗體的三維結構被破壞后(例如還原和酶切割后)，脫酰胺將變得容 易，因為在這些情況中氨基酸更易與周圍介質反應(圖2)。天冬酰胺可以形成中間產物形 式的環狀酰胺(琥珀酰亞胺)，該中間產物自發水解為比例約3 1的異天冬氨酰肽和天冬 氨酰肽的混合物(Chelius，D.等人，Anal. Chem. 77(2005)6004-6011)。該反應優選在堿性 PH值下發生。對于脫酰胺的類別，天冬酰胺脫酰胺成天冬氨酸(aspartate)和異天冬氨酸 (isoaspartate)的結果是出現質量差Am = +lDa。在分子量大于IOkDa的肽和蛋白質的 情況中，應用目前的質譜儀不可能或很難直接檢測到Am =+IDa的質量差。另外，電荷分 布的變化出現更準確的電荷異質性。硫醚鍵的形成非還原性硫醚鍵的形成是在單克隆抗體，特別是亞類IgGl中經常觀察到的現象。 這是基于二硫鍵中硫原子的丟失，二硫鍵將抗體的重鏈和輕鏈連接在一起或者穩定分子內 輕鏈和重鏈。抗體的這種修飾在應激增高的條件下和特別是在PH值升高的情況中容易發 生。認為該反應是 β -消除(Cohen, S. L.等人，J. Am. Chem. Soc.，129(2007)6976-6977)。 因為硫原子是在硫醚鍵形成過程中丟失的，所以對于非還原性修飾的抗體類別，這導致Am ="32Da的質量差。與之相反的是，該二硫鍵(S-S)在抗體的還原過程中被切割成兩個SH 基團。因此，還原的抗體組分產生的質量差Am =-34Da。片段的形成應激誘導的斷裂反應通常基于蛋白質的多肽鏈(例如抗體的重鏈和輕鏈)中肽鍵 的水解切割。蛋白質水解和肽鍵的水解原則上可以在所有的氨基酸之間發生，特別是如果 易于水解的其它氨基酸存在空間張力或側鏈。抗體的特異性切割單克隆抗體是非常大的蛋白質，并且由于它們重鏈的糖結構，它們是非常不均一 的(微觀不均一性)。為了檢查抗體形成的降解產物和修飾物，在分析前將它們切割成更 小的片段，這是有利的。因此，作為樣品制備的一部分，抗體的切割是進行分析研究的重要 方法。在大多數情況中，通過還原二硫鍵，簡單地將抗體分解為其重鏈和輕鏈。但是除此之 外，還有用于切割抗體的其它方法。二硫鍵的切割
IgG分子中出現的所有二硫鍵可以通過還原來切割。在還原過程中獲得游離的抗 體的重鏈和輕鏈。三(2-羧基乙基)_膦(TCEP)是常用的還原劑，因為抗體所有的二硫鍵 在短時間內完全被切割，并且還原在整個PH范圍內均可發生(參見例如Hau，J.C.和Hau， C. Y.，Anal. Biochem. 220(1994)5-10)。在一個實施方案中，pH 范圍從 1. 5 至 8. 5。二硫蘇 糖醇(DTT)也具有快速切割二硫鍵的特征。但是，DTT還原在酸性環境中進行很慢。為了 完全分離重鏈和輕鏈，變性步驟通常是必要的。變性還使得二硫基更易受影響。變性可以 例如借助鹽酸胍或甲酸來進行。酶切割木瓜蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)相對非特異地切割精氨酸(R)、賴氨酸(K)、谷 氨酸(E)、組氨酸(H)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)之后的肽鍵。如果溫育時間足夠長，木瓜 蛋白酶消化導致完全水解。但是，抗體可以在它們的鉸鏈區通過限制性蛋白水解相對特 異地被切割(Lottspeich, F.禾口 Engels， J. W. ,"Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag”Munich第2版(2006)201-214)。切割發生在將兩條重鏈連接在一起的二硫鍵的 N-端側。二硫鍵在該過程中是得到保留的，從而在消化后獲得三個片段(2個Fab片段、1 個Fc片段)。兩個N-端片段被稱為抗原結合片段(Fab，抗原結合片段)，C-端片段被稱為 結晶片段(Fe，結晶片段)。每個Fab片段包含完整的輕鏈和氨基-端的半個重鏈。Fc片段 包含兩個仍然通過二硫鍵連接在一起的羧基_端的半個重鏈。IdeS 消化IdeS (化膿鏈球菌的免疫球蛋白G-降解酶)是細胞半胱氨酸蛋白酶，其可以從致 病菌化膿鏈球菌中分離。該酶直接在識別序列GPSVFLFP前高特異性切割人IgG。該序列 位于IgG鉸鏈區的將兩條重鏈(HC)連接在一起的二硫鍵的C-端側。切割產生兩條重鏈的 C-末端(2個HC-Fc片段)和Fab”片段，Fab”片段來自通過二硫鍵連接的輕鏈和重鏈的 Fab 片段的臂(圖 3) (von Pavel-Rammingen, U.等人，EMBO Journal 21(2002) 1607-1615)。如果將抗體的IdeS片段在消化之后用DTT或TCEP還原，那么獲得兩條抗體的輕 鏈(2LC)和重鏈的N-端片段(2HC Fab)，而不是Fab”片段。重鏈的C-末端(HC-Fc)不受 還原的影響。去糖基化N-糖苷酶F是所謂的內切糖苷酶并且在多肽鏈和近端的N-乙酰基葡糖胺殘基之 間完全切割糖蛋白(例如抗體的重鏈)的糖結構。為了簡化非常復雜的質譜圖，這些質譜圖通常是在分析多種蛋白質和肽類組分中 通過預分離組分獲得的，通常將質譜儀與液相色譜法組合(LC/MS)操作。為了這個目的，在 質譜分析之前，根據它們的組成將高效HPLC系統用于分離溶解物質的混合物。分析混合物 的色譜分離的結果是，組分在不同時間離開分離柱，并且這樣可以通過質譜法按洗脫順序 進行分析。洗脫圖每個峰的質譜圖是通過色譜法與質譜法聯用而獲得的。這樣的優勢在于不 會獲得分析物溶液中所有組分的復雜的整體圖譜，而是在理想的情況下獲得分離的組分的
單一圖譜。電噴霧方法(ESI)是經常應用的電離方法，用于將溶解的分子轉化為質譜法中的 氣體離子。這是通過將液體分散在靜電場中獲得的(電噴霧)。在這個過程中形成了很多細小的帶電微滴，其包含分析物分子。高度帶電離子的形成是ESI方法的特征。因此，在確定的蛋白質類別的質譜圖中， 觀察到完整系列的離子信號，根據它的分子量每個具有Δζ = 1的電荷差(通常在正電荷 模式中加上一個質子或在負電荷模式中減去一個質子)。蛋白質的圖譜表現為分子離子的 近似鐘形的電荷分布的特征。最大的分布取決于ESI質譜儀的參數、溶劑的ρΗ和蛋白質的 變性狀態。切割二硫鍵后并且作為變性的結果，蛋白質變成在空間上更展開的結構，從而分 子可以接受(或釋放)更多的電荷。因此，最大的電荷分布可以變成更高(更低)的電荷。多電荷分子離子的電荷的數目η和分子量(M)可以通過電荷分布中任何兩個相鄰 分子離子(m2 > Hi1)的測量的m/z比值(m)來計算 在該等式中，X是電荷載體的質量，即對于加上一個質子X= 1(在正電荷模式中) 和對于減去一個質子X = -1 (在負電荷模式中)。η的數值可以通過計算出變量η并且合 并式1和2來計算 分子離子的分子量可以通過計算出式2中的M并且通過應用式3中η的計算結果 來計算式4 :Μ = η (Hi1-X)譜圖通過是借助計算機程序來分析的，其可以用于測量所有信號或單獨選擇信號 的分子量。因此獲得所謂的重構，其表示對相應的分子量范圍重新計算的給定的譜圖(去 卷積譜)。現在分子量可以直接從計算的峰上讀出。現在令人驚訝地發現用先前應用的方法出現的問題可以通過應用本發明方法來 預防。還令人驚訝地發現應用酶IdeS對實現抗體的LC/MS分析是有利的。因此，本發明的第一方面是檢測樣品中抗體和抗體片段以及抗體的修飾形式的方 法，其特征在于包括下列步驟a)提供包含抗體和/或其切割產物和/或抗體的修飾形式的樣品，b)將a)項中提供的樣品與下列物質溫育，i) IgG特異性半胱氨酸蛋白酶，ii)糖苷酶，iii)還原劑，c)將b)項中溫育的樣品通過聯用的液相色譜法和質譜法進行分析以檢測a)項提 供的溶液中包含的完整的抗體和檢測抗體片段。提供的樣品可以例如是包含抗體的溶液，例如凍干的抗體制劑的重構溶液。修飾 的抗體分子在貯存和凍干的過程中在該溶液中形成。其中這些修飾是單個氨基酸的氧化和脫酰胺、硫醚鍵的形成和抗體片段的形成。本發明的方法包括將樣品與不同的試劑溫育。這些試劑用于將樣品中包含的抗 體分子和抗體片段分子轉化為確定的片段。在該方法的一個實施方案中，第一個溫育步驟 是用IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶IdeS切割分子，優選來自化膿鏈球菌或齒垢密螺旋體的 IdeS。在進一步優選的實施方案中，IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :1。在一個實施方案中，與IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶的溫育在pH范圍從pH 5. 5至8. 5 之間進行。在一個實施方案中，溫育在PH范圍從pH 7.0至8.0之間。還發現IgG-特異性 半胱氨酸蛋白酶與抗體分子(包括抗體片段分子)的摩爾比應該在1 25至1 2500之 間，在優選的實施方案中，在1 25至1 100之間。在該方法的一個實施方案中，第二個溫育步驟是用糖苷酶切割抗體片段的碳水 化合物。在一個實施方案中，糖苷酶選自N-糖苷酶F、內切糖苷酶F2、內切糖苷酶H、乙酰 基_神經氨酰基(neuraminyl)水解酶或0-糖肽內-D-半乳糖基-N-乙酰基半乳糖 氨基水解酶。在一個實施方案中，糖苷酶是N-糖苷酶F，也稱為PNGase F。在一個實施方 案中，N-糖苷酶F衍生自腦膜炎膿毒性黃桿菌。在一個實施方案中，糖苷酶是內切糖苷酶 F2，也稱為Endo F2。在另一個實施方案中，內切糖苷酶F2衍生自腦膜炎膿毒性黃桿菌或 腦膜膿毒性金黃桿菌。在另一個實施方案中，糖苷酶是內切糖苷酶H，也稱為Endo H。在另 一個實施方案中，內切糖苷酶H衍生自褶皺鏈霉菌(Sti^ptomyces plicatus) 0在另一個 實施方案中，糖苷酶是乙酰基-神經氨酰基水解酶，也稱為神經氨酸酶。在另一個實施方案 中，乙酰基-神經氨酰基水解酶衍生自產氣莢膜菌。在另一個實施方案中，糖苷酶是0-糖 肽內-D-半乳糖基-N-乙酰基-a-半乳糖氨基水解酶，也稱為0-糖苷酶。在一個實施方案 中，0-糖肽內-D-半乳糖基-N-乙酰基半乳糖氨基水解酶衍生自肺炎鏈球菌。在另一 個實施方案中，糖苷酶是EC 3. 2. 218或EC 3. 5. 1. 52或EC 3. 2. 1. 96或EC 3. 2. 1. 18或EC 3. 2. 1. 97。在進一步的實施方案中，糖苷酶具有氨基酸序列SEQ ID NO :2。首先將提供的樣品與IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶溫育，隨后用糖苷酶處理，這是 有利的。在第三步中，將二硫鍵通過加入還原劑并且優選加入磷酸三氯乙酯(TCEP)來切 割。在一個實施方案中，甲酸是與還原劑同時加入的。液相色譜法和質譜法的組合用于分析獲得的確定的抗體片段。單個片段是通過液 相色譜法分離的，隨后可以通過質譜法測定。在一個實施方案中，質譜法是電噴霧電離_飛 行時間質譜法(ESI-TOF)。在一個實施方案中，液相色譜法是疏水相互作用色譜法或π-π 相互作用色譜法。在疏水相互作用色譜法的情況中，在一個實施方案中，色譜配體是C8或 C18配體，其位于300埃孔徑的色譜材料上；或者在JI-Ji相互作用色譜法的情況中，將 二苯基配體用作色譜配體。在一個實施方案中，Jupiter C18柱或Zorbax300SB C8柱或 Pursuit 二苯基柱，在優選的實施方案中，Pursuit 二苯基柱用于液相色譜法。本發明還關注IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶在檢測樣品中的抗體或抗體片段中的 用途，其特征在于將樣品與IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶溫育，并且在與糖苷酶溫育后將獲 得的片段通過聯用的液相色譜法和質譜法分析。本發明的另一個方面是用于檢測抗體或抗體片段的試劑盒，其特征在于該試劑盒 包含
i)來自化膿鏈球菌的IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶IdeS，和ii)來自腦膜炎膿毒性黃桿菌的內切糖苷酶N-糖苷酶F。為了優化IdeS消化的溫育條件，首先試驗減小酶抗體比例和溫育時間。對于實 際的原因，最短可能的溫育時間和最小可能的酶抗體比例是需要的，因為消化的抗體分 析物溶液中存在的酶組分可能在獲得的質譜圖中引起干擾信號。為了避免這種情況，用于 抗體消化的酶的量應該盡可能少。同時必須確保抗體分子在消化后完全被切割。為了另外 獲得最高可能的樣品處理量和優化試驗時程，應該縮短溫育時間同時確保完全消化。消化 制備物的凝膠電泳分離的結果(參見圖7)顯示相應于IdeS切割的預期產物的兩條主帶 (約IOOkDa和約25kDa)在所有消化條件下都能形成。分子量約IOOkDa的更大的主帶相應 于預期的抗體Fab”部分，其包含兩條輕鏈(LC)和重鏈(HC)的Fab片段。分子量約25kDa 的更小的主帶是預期的HC的Fc片段。消化制備物的凝膠電泳分離的結果顯示酶抗體的 比例對IdeS消化具有更顯著的影響。關于多種制備物的IdeS消化的效率，SDS-PAGE的結 果顯示在1 50的酶抗體比例以及0.5小時和1小時的溫育時間下仍然出現極小強度 的完整抗體(2HCV2LC)的帶(參見圖7A，泳道6和9)。在相同的酶抗體比例以及2小時 和5小時的溫育時間下(參見圖7B，泳道6和9)，完整抗體分子的帶已經消失。因此優選 的溫育時間是在2小時至5小時之間，并且特別優選2小時。結果還顯示18小時的溫育時 間和1 50、1 500,1 2500,1 10000的酶抗體比例與在相同酶抗體比例下5小 時的溫育相比沒有差異。因此優選1 25至1 100的酶抗體比例。特別優選1 50 的酶抗體比例。基于LC/MS的方法包括樣品制備方法，該方法特別適于分離和檢測應激誘導的降 解產物。原則上存在四種可能的樣品制備變通實施方案1.僅還原抗體；2.去糖基化，隨后還原抗體；3. IdeS消化，隨后還原抗體；4.去糖基化，隨后IdeS消化和還原抗體。結果表明僅還原抗體的制備(變通實施方案1)和IdeS消化并且還原的抗體的 制備(變通實施方案3)不適合抗體溶液的LC/MS分析，因為重鏈的糖結構而獲得異質 (heterogeneous)的圖譜，這降低了 LC/MS測量的靈敏度并且使得分析更加困難。令人驚訝地發現IdeS-消化、去糖基、還原的樣品制備優于去糖基、還原的樣品制 備，因為獲得了更小的抗體片段，這些更小的抗體片段對LC/MS測量的質量分辨率具有正 面影響，并且允許另外存在位于并歸屬為抗體的HC-Fc或HC-Fab部分的修飾。另外，由于 重鏈的切割，可能放大應激誘導的修飾的作用，這可能發生在片段的色譜行為上，以便改善 它們彼此的分離。同時應用兩種酶IdeS和N-糖苷酶F不會產生任何問題。由于實際原因，首先用IdeS消化抗體，然后去糖基化，這是特別有利的。由于實際 原因，以該方式改變方法并且對分析結果沒有顯著影響。在加入TCEP溶液的同時加入甲 酸，即甲酸和TCEP溶液均是在溫育前加入的，因此兩種組分存在于單個溫育過程中。為了明確并且簡單地檢測和定量形成的抗體溶液的降解產物，分離各自的降解類 別是有利的。分析物溶液的分離質量特別受到固定相色譜性能的顯著影響。色譜分離的質 量是根據各自柱子的峰分辨率和峰銳度來評估的。
當選擇柱時，為了分離，除了柱基質的極性之外其它重要參數必需考慮，例如粒度 應當盡可能小，以獲得最高可能的塔板數。另外，應當記住的是，抗體是非常大的分子。因 此，當選擇適合的柱時，基質顆粒的孔徑也發揮決定性作用。基質顆粒的孔越大，越易于抗 體組分擴散到孔里，從而改善分離。與用作參比柱的Jupiter C18柱相比，在所用的色譜條件下，應用Vydac C4柱沒 有獲得降解產物有效的分離改善。與Jupiter C18柱相比，Zorbax 300SB C8具有不同的 色譜選擇性，同時對于分離多種抗體片段獲得較好的結果。相反，Pursuit 二苯基柱表現出 改善的分離結果。與JupiterClS柱的分離圖相比，該柱的分離圖顯示出更多的峰和肩峰， 這些峰在洗脫圖中具有良好的分辨率和可接受的峰銳度。因此，該柱優選用于分離根據本 發明方法獲得的抗體的降解產物。通過下列實施例、文獻參考和圖進一步說明本發明。實際的保護范圍來自本發明 附屬的權利要求。本發明是通過下列基于抗體實例(mAb IGF-1R)的實施例來描述的。這不構成本 發明的限制，而僅旨在說明。 抗體(優選單克隆抗體)的實例是抗IGF-I受體的抗體(mAb IGF-1R)，例如 WO 02/053596、WO 2004/071529、WO 2005/016967W0 2006/008639、US 2005/0249730、 US 2005/0084906、WO 2005/058967、WO 2006/013472、WO 2006/00181、US 2003/0165502、 WO 2005/082415、WO 2005/016970、WO 03/106621、WO 04/083248、WO 2003/100008、WO 2004/087756、WO 2005/005635、WO 2005/094376 和 WO 2007/115814 中所描述的。附圖描述圖1 作為實例的甲硫氨酸(a)和色氨酸(b)的氧化反應(參見例如Taylor，S.等 人，J. Biol. Chem. 278 (2003) 19587-19590)。圖2 天冬酰胺的脫酰胺并且異構化為天冬氨酸；在堿性條件下(pH > 8)優選途 徑I，在酸性條件下(PH < 5)優選途徑II。圖3 =IgGl抗體的IdeS消化的示意圖。圖4 在40°C下溫育并且在-80°C下貯存的抗體的凝膠電泳分離結果泳道1-樣品緩沖液；泳道2-分子量標準；泳道3-樣品緩沖液；泳道4-未還原的標準；泳道5-未還原的抗體(_80°C )；泳道6-未還原的抗體(30天/40°C )；泳道7-樣品緩沖液；泳道8-還原的標準；泳道9-還原的抗體(-80 V )；泳道10-還原的抗體(30天/40°C )；泳道11-樣品緩沖液；泳道12-樣品緩沖液。圖5 應激的抗體(1 :40°C,30天)和未應激的抗體(2 :-80°C )以及在40°C下溫
12育的安慰劑緩沖液(3)疊加的SEC色譜圖。圖6 應激的抗體(1 :40°c,30天)和未應激的抗體(2 :-80°C )溶液以及在40°C 下溫育的安慰劑緩沖液(3)的離子交換色譜法的色譜圖。圖7 在多種酶與抗體比例(1 50-1 1250)和多種溫育時間(0.5小時-5小 時)下IdeS消化的抗體的分離泳道編號-凝膠A-凝膠B 1-樣品緩沖液-樣品緩沖液；2"分子量標準-分子量標準；3-標準-標準；4-未消化的抗體_未消化的抗體；5-樣品緩沖液-樣品緩沖液；6-1:50,0. 5 小時-1:50，2. 0 小時；7-1:125，0. 5 小時-1:125，2. 0 小時；8-1:1250，0. 5 小時-1:1250，2. 0 小時；9-1:50，1.0 小時-1:120，5.0 小時；10-1:125，1.0 小時-1:125，5.0 小時；11-1:1250，1.0 小時-1:1250，5.0 小時；12-樣品緩沖液-樣品緩沖液。圖8 應激的抗體和未應激的抗體在Jupiter C18標準柱(A)和Pursuit 二苯基 柱(B)上的疊加洗脫圖。圖9 應激的抗體(1)和未應激的抗體(2)在Pursuit 二苯基柱上的疊加洗脫圖。實施例1材料與方法本研究中用于試驗的抗體是IgGl型人重組抗體。該抗體在CHO細胞中表達并且 通過親和色譜法和多種離子交換色譜法步驟純化。熱應激將約22mg的IgGl抗體通過在IOmM Tris/HCl緩沖液(pH 8. 5)中透析來更換緩 沖液。將一部分更換緩沖液的抗體溶液在40°C下溫育30天。將其它部分凍存在-80°C下 作為對照。透析為了透析，將1. 5mL抗體溶液(c = 14. 6mg/mL)轉移至slide A-Lyzer透析盒(容 量0.5-3mL，分子量排阻大小10kDa)并且懸掛在透析緩沖液中。透析過程中連續攪拌緩 沖液并且保持在約8°C下。為了確保最完全可能的緩沖液交換，在透析過程中數次更新透析 緩沖液。表1顯示更換緩沖液的時間表。表1 更換抗體溶液的緩沖液的透析表
13 完全透析后，將抗體溶液從slide A-Lyzer透析盒轉移至5mL反應容器中。透析 的抗體溶液的體積通過在分析天平(AT261 Delta Range,Mettler-Toledo)上稱重來測量。滅菌過濾透析后，將抗體溶液在低微生物水平條件下經Minisart單個注射器式濾器 (0.2 μ m，Sartorius)過濾滅菌。測定樣品濃度的取樣頁在低微生物水平條件下進行。抗體濃度的測定抗體濃度通過在Uvikon XL型分光光度計(Goebel Company)上測量280nm處的 吸收來測定。所用的抗體的消光系數是1. 55mL · mg-1 · cnT1并且是根據Pace，C. N.等人 (Protein Sci. 4 (1995) 2411-2423)的方法來計算的。SDS-PAGE抗體溶液通過凝膠電泳分離，應用Power Ease 300電泳儀和InvitrogenCompany 的凝膠、緩沖液和其它試劑。將Tris-甘氨酸4-20%梯度凝膠用于分離。將Tris-甘氨酸 SDS運行緩沖液(IOX)用作運行緩沖液，應用前將其用二次蒸餾水按1 10(v/v)稀釋。將已經在40°C下溫育和在-80°C下貯存的抗體溶液在還原和未還原的條件下應 用。為了測定待測樣品的相對分子量，將5yL的Mark 12 蛋白質標志物也應用于凝膠中 作為參考。電泳分離在125V電壓下進行并且運行時間約95分鐘。凝膠電泳后，根據供應 商的說明將凝膠在Simply BlueSafe Stain (考馬斯G 250染色液)中染色。隨后，將凝膠 在二次蒸餾水中脫色。將染色的凝膠用Dry-Ease微型玻璃紙和干燥溶液(10%甘油(ν/ν)、40%甲醇(ν/ ν)、10%乙酸(ν/ν)、40%水(ν/ν))保存。為了這個目的，將凝膠在干燥溶液中溫育5分鐘， 并且加入兩張玻璃紙后再溫育10分鐘。然后將除去氣泡的凝膠放置在玻璃紙之間并且在 固夾框中干燥。對于未還原SDS-PAGE，將抗體溶液用IOmM Tris/HCl緩沖液(pH 8. 5)稀釋至濃度 約Img · mL—1。隨后，將10 μ L(相應于10 μ g抗體)的稀釋的抗體溶液與10 μ L的SDS樣 品緩沖液(2Χ)以1 2(ν/ν)的比例混合，混合并且最后短暫離心。將樣品在70°C下變性 10分鐘。然后將它們再次短暫離心。為了電泳分離，將16yL(相應于Syg抗體)的變性 的樣品應用于凝膠中。除了蛋白質標志物之外，應用稀釋至濃度Img ^r1并且隨后用與抗 體樣品相同的方法處理的抗體參考標準品(c = 16. 5mg · mL-1)作為參考。對于還原SDS-PAGE，也將抗體溶液用IOmM Tris/HCl緩沖液(pH 8. 5)稀釋至濃 度lmg·!!^1。DTT(二硫蘇糖醇)用于還原溶液。為了確保抗體的完全還原，將DTT溶液 以IOOmM的濃度配制在SDS樣品緩沖液(2 X)中。隨后將10 μ L (相應于IOyg抗體)的 稀釋的溶液與IOyL 2 X SDS樣品緩沖液+IOOmM DTTWl 2 (ν/ν)的比例混合，混合并且短暫離心。將樣品在70°C下變性10分鐘。然后將它們再次短暫離心。為了電泳分離， 將16yL(相應于Syg抗體)的變性的樣品應用于凝膠中。除了蛋白質標志物之外，應 用稀釋至濃度Img · mL-1并且隨后用與抗體樣品相同的方法處理的抗體參考標準品(c = 16. 5mg · ι Γ1)作為參考。尺寸排阻色譜法(SEC)根據組分的大小將Tosoh Bioscience Company的TSK凝膠G3000SWXL凝膠過濾 柱(7. 8 X 300mm ;5 μ m，250人)用于色譜分離抗體溶液的組分。分離在Shimadzu-HPLC系 統上進行。將樣品組分用200mM磷酸鉀、250mM氯化鉀緩沖液(pH 7. 0)以0. 5mL · mirT1的 流速并且歷經30分鐘等度洗脫。將TSK凝膠G3000 SWXL凝膠過濾柱的溫度在分離過程中 維持在25°C不變。自動進樣器的溫度是6°C。將樣品組分在280nm波長下用二極管陣列檢 測器檢測。離子交換色譜法(IEC)將Agilent Company 的弱陽離子交換柱 SynChropak WCX(4. 6X 250mm，6 μ m, 300 Α )用于離子色譜分離抗體溶液的組分。分離在ShimadzuHPLC系統上進行。將樣品組 分通過洗脫液A (IOmM磷酸鈉緩沖液，pH 7.0)和洗脫液B (IOmM磷酸鈉緩沖液，750mM氯化 鈉緩沖液，PH 7. 0)的二元梯度系統在ImL · mirT1的流速并且55分鐘的運行時間下洗脫。 洗脫分布如表2所示。將SynChropak WCX陽離子交換柱的溫度在分離過程中維持在25°C 不變。自動進樣器的溫度是6°C。將樣品組分在280nm波長下用二極管陣列檢測器檢測。Ml 通過IEC分離抗體溶液的梯度分布 實施例2熱應激為了加速單克隆抗體的降解產物和修飾物的形成，將其在溫育器(Venticell， MM-Medcenter)中進行規定的熱應激。對于溫育，將透析的抗體溶液在40°C下溫育30天。 另外，將250 μ L的抗體溶液分成10 μ L等份并且在-80°C下貯存。這些用作零點對照。
30天后，將進行熱應激的各等份從溫育器中取出并且目測微生物感染。將取出的 各等份傾倒入在反應容器中，以獲得均勻的應激的分析溶液。均一化通過仔細混合抗體溶 液來進行(MS2微型混合器，IKA, Staufen)。將均勻的抗體溶液分成20 μ L等份并且在_80°C 下貯存。為了液相色譜法和質譜法分析，將約22mg抗體(c = 14. 6mg -πιΓ1)在IOmM Tris/ HCl緩沖液(ρΗ 8. 5)中更換緩沖液并且隨后在40°C下溫育30天。熱溫育的安慰劑緩沖液的制備為了在隨后分析中確定因在40°C下貯存引起的抗體溶液觀察到的變化不是歸因 于緩沖液的變化，將兩個15mL等份的IOmM Tris/HCl緩沖液在低微生物水平條件下通過過 濾滅菌，并且也在40°C的溫育器(Venticell,MM-Medcenter)中溫育30天。隨后的操作如 抗體溶液那樣進行。熱溫育溶液的凝膠電泳分析在40°C下溫育并且在-80°C下貯存的抗體的凝膠電泳分離結果如圖4中所示。在 40°C下溫育導致聚集物和抗體分子片段的形成(泳道6和10)。未溫育的抗體樣品在非還 原條件下表現出典型的IgGl分子帶型(參見泳道4和5)。主帶相應于包含兩條重鏈(HC) 和兩條輕鏈(LC)的完整抗體。對于沒有完全保持結構的抗體類別，還能觀察到其它條帶。 這些條帶是缺乏輕鏈的2HC/LC類別、半抗體(HC/LC)、游離的重鏈(HC)和游離的輕鏈(LC) (參見泳道4和5)。該典型的帶型還主要出現在40°C下溫育的非還原的抗體樣品中(參見泳道6)。主 帶也是完整抗體(2HC/2LC)。在比-80°C下貯存的抗體樣品更高的強度下，其它條帶還出現 在多種非完整抗體類別中(2HC/LC、HC/LC、HC、LC)。在應激的樣品中還形成范圍從約90kDa 至> 200kDa的其它條帶(參見泳道6)。低于主帶出現的類別是抗體片段，并且高于主帶的 那些是聚集物。對于LC/MS分析特別有意義的兩條帶出現在約21kDa區域(參見泳道6)。這是非 共價的Fab片段，其中HC Fab片段(AA 1_220)和LC不是通過二硫鍵連接在一起的，而是 通過非共價相互作用(離子相互作用、氫鍵、偶極_偶極相互作用、范德華力)連接在一起。 由于樣品是在變性條件下應用于凝膠的，HC Fab和LC在凝膠中以單帶出現(參見泳道6)。 在該組合中，凝膠中較高帶是LC (LCf)并且較低帶是HC Fab片段(Cohen，S. L.等人，J. Am. Chem. Soc. ,129(2007)6976-6977)。包含第二個Fab片段和Fc片段的殘留的抗體可以歸屬 為在97kDa和116kDa區域中弱強度出現的條帶(參見泳道6)。在還原條件下分離的主帶是重鏈(HC)和輕鏈(LC)(參見泳道8、9和10)。除了兩 條主帶之外，在未應激的抗體樣品中，在范圍約97kDa和120kDa之間出現較低強度的兩條 其它條帶。這些是共價、未還原的聚集物(參見泳道8和9)。在40°C下溫育的抗體溶液顯示出與未溫育的抗體溶液相同的帶型(參見泳道 10)。在未應激的樣品的情況中歸屬為未還原的類別的兩條帶在應激的樣品中沒有出現非 常高的強度(參見泳道10)。在應激的抗體溶液中，除了已經提到的類別(HC、LC和兩條共 價、未還原的條帶)之外，在約30kDa至200kDa范圍內出現大量的其它條帶。這些是還原 的共價聚集物、未還原的類別和還原類別的片段(參見泳道10)。在凝膠約90kDa至95kDa處出現并且可以歸屬為半抗體的未還原的聚集物類別的條帶對于LC/MS分析是特別有意義。溫育的結果是該條帶的強度顯著增加。該條帶強度增 加最可能是由于硫醚類別的形成。該類別是實際質量75kDa的半抗體分子，它的HC和LC 不是通過二硫鍵連接在一起的，而是通過未還原的硫醚鍵連接的(Tous，G. I.等人，Anal. Chem. 77(2005)2675-2682)。熱溫育溶液的SEC分析尺寸排阻色譜法(SEC)給出了應激誘導的片段和聚集物形成的概觀。由于SEC是 在天然條件下進行的，在分析中檢測共價以及非共價聚集物。為了建立降解產物的形成和 在40°C下溫育之間的關系，除了應激抗體溶液之外，還分析在-80°C下貯存的未應激樣品。圖5顯示了在40°C下溫育的安慰劑緩沖液、在40°C下溫育的抗體和在_80°C下貯 存的抗體的SEC結果。在每種情況中，將50yL或50yg抗體用于分析。分子量標準的分 析結果作為測定抗體溶液組分的分子量大小的參考。它們列于表4中。表3顯示了洗脫圖 中多種抗體類別的百分數。計算的百分數是基于某個類別的不同峰面積占出現的所有峰的 面積總和的比例。表3 應激和未應激抗體的SEC評價 表4分子量t示準的SEC盧Λ普分離結果 應激抗體類別的洗脫圖與SDS-PAGE的結果相關。SEC的結果也顯示聚集物已經形 成并且抗體在溫育過程中已經降解(參見圖5)。保留時間約15-16. 5分鐘的主要類別(其可以歸屬為完整的抗體)在40°C下溫 育過程中從占總面積的約96%減少至72% (參見表3)。根據分子量標準，主要類別的保
17留時間(RT 15-16. 5分鐘)相應于分子量約150kDa(參見表4)。分子量> 158kDa的聚集 物(參見表4)在約12-14. 5分鐘的時間窗口中洗脫。在40°C下溫育的結果是，具有該洗脫 時間的峰從占總面積的約3%增加至約12% (參見表3)。明顯的肩峰在應激抗體洗脫圖 的主要類別峰的減少區域(RT約16. 5-18分鐘)中形成，其具有約11%的面積比例并且其 在-80°C下貯存的抗體溶液中不會出現這種情況(參見圖5)。在肩峰區域洗脫的抗體類別 具有分子量約70kDa至120kDa(參見表4)。這些是例如半抗體(HC/LC)、失去輕鏈的抗體 (2HC/LC)和Fab+Fc片段的類別。在保留時間約19-20分鐘處還看到另一個峰，其可以歸屬 為分子量在約20kDa至40kDa之間(參見表4)。非共價Fab片段的重鏈(HC)和輕鏈(LC) 以及HCFab在這個時間窗口內洗脫。在40°C下溫育的結果是，該峰從占總面積的約增 加至5% (參見表3)。在40°C下溫育的安慰劑緩沖液與在40°C下溫育的抗體溶液的洗脫圖的比較表明 緩沖液的溫育沒有出現峰。熱溫育溶液的IEC分析離子交換色譜法(IEC)適用于檢測由于抗體分子的修飾引起的電荷變化。為了能夠鑒定抗體中應激相關的變化，除了在40°C下溫育的抗體之外，還應用 在_80°C下貯存的未應激的抗體。圖6表示在40°C下溫育的應激和未應激抗體溶液以及安慰劑緩沖液的離子交換 色譜法中獲得的色譜圖。在每種情況中將50yL或25yg抗體用于分析。洗脫圖中多種類 別的百分數顯示在表5中。計算的百分數表示某個類別的不同峰面積占出現的所有峰的面 積總和的比例。 表5 應激和未應激抗體的IEC評價
在-80°C下貯存的抗體與在40°C下溫育的抗體的洗脫圖的比較表明電荷顯著位 移至酸性范圍是由溫育誘導的(參見圖6)。因此主要類別(保留時間RT約22-25分鐘，其 可以歸屬為完整抗體)的峰強度從占總面積的約61%顯著地減少至約40% (參見表5)，然 而洗脫圖中酸性范圍(RT 12-18分鐘)的峰強度顯著增加(從占總面積的約8%增加至約 44%)。在未應激抗體樣品的堿性范圍(RT 26-32分鐘)內看到的肩峰在40°C溫育的過程 中完全消失(參見圖6)。相反，在應激抗體溶液的情況中，主峰(RT 19-22分鐘)酸性部 分的肩峰強度增加。在該情況中，面積從占總面積的約5%增加至約17% (參見表5)。在 40°C下溫育的安慰劑緩沖液與在40°C下溫育的抗體溶液的洗脫圖的比較表明緩沖液的溫 育沒有出現峰。抗體溫育誘導的電荷位移至酸性范圍通常主要是由于脫酰胺反應。在脫酰胺中，
18氨基被羥基代替，而羥基將額外的負電荷引入至分子中。IEC色譜圖的結果表明由于在 40 V下溫育，脫酰胺和其它的電荷變化高度發生。實施例3IdeS消化的優化酶IdeS以lmg/mL的濃度存在于50mM Tris/HCl緩沖液(pH 8. 0)中。制備包含 三個不同IdeS濃度的稀釋系列，用于將酶加入至消化溶液中。預稀釋液(V)中IdeS的終 濃度是 0. Img · mL—1 (Vl)、0. Olmg · mL—1 (V2)和 0. OOlmg · mL—1 (V3)。稀釋應用 50mM Tris/ HCl緩沖液(pH 8. 0)實現。待分析的抗體是以15. 5mg/mL的濃度存在于組氨酸-緩沖液，pH 6. 0中。將抗體 溶液用50mM Tris/HCl緩沖液(pH 8. 0)稀釋至濃度為c = 5mg · mL—1，用于加入至消化溶 液中。制備消化溶液的吸量流程在表6中列出。制備IdeS消化溶液的吸量流程 將制備的消化溶液在37°C下溫育0. 5,1. 0,2. 0和5. 0小時。制備沒有加入酶的抗 體溶液，作為零對照。對于對照溶液，將10 μ L (50 μ g)抗體通過移液管加入至40 μ L 50mM Tris/HCl緩沖液(pH 8. 0)中。溫育在37°C下進行5. 0小時。另外，將抗體參考標準溶液(抗體在20mM組氨酸、240mM海藻糖、0. 02%吐溫20， pH = 6. 0，c = 16. 5mg .mL-1)用 50mM Tris/HCl 緩沖液(pH 8. 0)稀釋至濃度為 Img ·πι Λ 作為另一個對照。參考標準溶液沒有先前的溫育而應用。多種抗體消化溶液是在非還原條件下應用的。實施例4不同樣品制備方法的比較僅還原將43 μ g濃度為c = Img · mL—1的抗體用0. 43M磷酸三氯乙酯(0. 5M，在H2O中) 還原。為了這個目的，將38μ L TCEP溶液(0. 511，在吐0中)加入至51^未應激的抗體溶液 (c = 8. 55mg · πιΓ1)中并且在37°C下溫育30分鐘。隨后將抗體溶液用甲酸(1%，ν/ν)以 1 2 (ν/ν)的比例稀釋。用甲酸稀釋后，抗體的濃度是Ο.δπ^·!!^1。甲酸的比例是0.5% (ν/ν)。將獲得的溶液以13，400rpm離心(Minispin, Eppendorf) 2分鐘。將上清液用移液 管小心取出并且轉移至分析管中。在LC/MS試驗中，將4yL(2yg)抗體應用至柱中。IdeS消化和還原
用IdeS消化是通過與43 μ g濃度為c = Img -πιΓ1的抗體溫育來實現的。為了這 個目的，將5 μ L未應激的抗體溶液(c = 8. 55mg Γ1)用34 μ L 50mMTris/HCl緩沖液(pH 8. 0)稀釋，加入 4μ L IdeS 溶液(0. 25mg · ml/1，在 50mMTris/HCl 緩沖液(pH 8. 0)中)并 且將其在37°C下溫育2小時。然后將其以0. 5mg · mL—1的濃度用0. 25M TCEP(0. 5皿，在H2O 中)還原。為了這個目的，將35 μ L消化的抗體溶液(c = Img · πιΓ1)加入至35 μ L TCEP 溶液(0. 511，在H2O中)中并且在37°C下溫育30分鐘。隨后將抗體溶液用甲酸(1%，ν/ν) 以1 2 (ν/ν)的比例稀釋。用甲酸稀釋后，抗體的濃度是OJSmg·!!^1。甲酸的比例是 0.5%。將獲得的抗體溶液以13，400rpm離心(Minispin，Eppendorf) 2分鐘。將上清液用 移液管小心取出并且轉移至分析管中。在LC/MS試驗中，將8yL(2yg)抗體應用至柱中。實施例5LC-MS分析方法為了 LC/MS分析表征抗體的降解產物，首先將抗體用IdeS消化，然后去糖基，隨后 還原。IdeS 消化為了用IdeS消化，在每種情況中將4 μ L IdeS溶液(c = 0. 25mg · ι Γ1，在50mM Tris/HCl緩沖液中，pH 8. 0)加入至7. 9 μ L應激的抗體(c = 6. 26mg · ml/1)和5. 8 μ L未 應激的抗體(c = 8. 55mg -πιΓ1)中。將該溶液用50mMTris/HCl緩沖液(pH 8. 0)稀釋至抗 體濃度為Img · mL—1，并且在37°C下溫育2小時。酶抗體比例是1 50。用N-糖苷酶F去糖基化抗體重鏈的糖結構是用酶N-糖苷酶F切割的。N-糖苷鍵合的糖是在IdeS消化 后通過以在50mM Tris/HCl緩沖液(pH 8. 0)中的0. 5mg -πιΓ1的抗體濃度溫育切割的。切 割是通過加入0. 5 μ L(活性10U · mLlN-糖苷酶F來啟動的。溫育是在37°C下進行4小 時。還原_實施例1還原是在IdeS消化和去糖基化后通過加入60 μ L TCEP (磷酸三氯乙酯；0. 5Μ，在 H2O中)實現的。隨后將混合物用甲酸(1%，ν/ν)以1 2(ν/ν)的比例稀釋，從而獲得濃 度為0. 16mg · ml/1的抗體在還原溶液中。TCEP的濃度是0. 1M，溶液中甲酸的比例是0. 5% (w/v) 0溫育是在甲酸和TCEP的存在下、在37°C下進行30分鐘。隨后將獲得的抗體溶液 以13400rpm離心(Minispin，Eppendorf) 2分鐘。將上清液用移液管小心取出并且轉移至 分析管中。在LC/MS試驗中將13yL(2yg)抗體應用至柱中(圖8)。還原_實施例2還原是在IdeS消化和去糖基化后通過加入60 μ L TCEP (磷酸三氯乙酯；0. 5Μ，在 H2O中)實現的。隨后將混合物用甲酸(1%，ν/ν)以1 2(ν/ν)的比例稀釋，從而獲得濃 度為0. 16mg · ml/1的抗體在還原溶液中。TCEP的濃度是0. 1M，溶液中甲酸的比例是0. 5% (w/v) 0溫育是在甲酸和TCEP的存在下、在70°C下進行10分鐘。隨后將獲得的抗體溶液 以13400rpm離心(Minispin，Eppendorf) 2分鐘。將上清液用移液管小心取出并且轉移至 分析管中。在LC/MS試驗中將13yL(2yg)抗體應用至柱中(圖9)。RP-HPLC 分離方法制備物的RP分離是在安裝有微脫氣裝置、毛細管泵、帶溫控單元的微自動進樣器、柱溫箱和多波長檢測器的Agilent 1100 Cap-LC系統(Agilent，ffaldbronn)上實現 的。將3. 5 μ m粒度、300人孔徑并且具有直徑1. OX250mm的Jupiter C18柱(Phenomenex， Aschaffenburg)用于標準分離，其表示參考點。色譜分離是在75°C下并且以40 μ L · mirT1 的流速進行的。對于每個制備物，將2yg抗體應用至柱中。將樣品組分用二元梯度洗脫， 二元梯度是將洗脫液A(0.5%甲酸，在吐0中(ν/ν))和洗脫液Β(70% 2-丙醇、20%乙腈、 9. 5% H2O和0.5%甲酸(ν/ν)) —起混合的。表7顯示了洗脫所用的梯度分布。
^IjRP分離的梯度分布 將洗脫的樣品組分用UV-檢測器在波長280nm處檢測。對于在線TOF質量分析， 將HPLC系統與micromass LCT質譜儀(Waters，Eschborn)聯用。空白值通過注射IOyL 洗脫液A來記錄。質譜分析LC分離的洗脫物的在線ESI-TOF質譜分析是在安裝有電噴霧源的micromass LCT 質譜儀(Waters，Eschborn)上實現的。數據是在600-2000amu(原子質量單位)質量范圍 內、在正離子模式(ES+)下、在80°C的錐孔溫度和100°C的脫溶劑溫度下記錄的。毛細管電 壓是3000V，錐孔電壓是30V，RF透鏡電壓是400V并且提取錐孔電壓是IV。ESI-TOF質量 分析的其它參數設置歸納在表8中。表8 =LCT質譜儀的參數設置 單點校正(LTeff測定)是應用在50 %乙腈中的0. 085% H3PO4進行的，將其借助 Hamilton泵(泵11，Harvard Apparatus)以5μ L ^mirT1的流速進入質譜儀。質量準確度 是 lOOppm。數據是借助Mass Lynx 4. 0數據記錄軟件來評價的。實施例6Pursuit 二苯基柱的質譜圖與Tupiter C18的質譜圖的比較如Jupiter C18柱，Pursuit 二苯基柱僅能部分分離氧化的HC-Fc類別(23778Da)， 在峰1的前肩峰中(參見圖8)。對于抗體輕鏈的焦谷氨酸類別，也沒有獲得分離改善。在 Jupiter C18柱和Pursuit 二苯基柱中，其在具有相當分辨率的峰3a中洗脫。HC-Fab片 段(氨基酸(AA) 1-220)在兩種柱子中、在洗脫圖的最后一個峰中還與完整的HC-Fab類別 同時洗脫。因此在應用Pursuit 二苯基柱的分離中，以分開的峰分離該片段也是不可能的。 Jupiter C18和Pursuit 二苯基柱的質量圖的比較還表明Pursuit 二苯基柱的峰3b的質 量與Jupiter C18柱的峰4相關。兩個峰均顯示33630Da的質量，其可以歸屬為IdeS酶。 另外，Pursuit DP柱的峰5與Jupiter C18柱的峰5相關。在兩種情況中均出現了包含硫 醚的HC-Fab-LC復合物的質量(48918Da)、不完全還原的HC-Fab片段的質量(25377Da)和 N-糖苷酶F的質量(34783Da)。相反，Pursuit 二苯基柱的峰4不與Jupiter C18柱的任何峰相關，并且因此，對 于Jupiter C18柱的洗脫圖這構成一個差異。該峰顯示質量48916Da，其可以歸屬為硫醚類 別并且質量49118Da。該質量相應于抗體重鏈的分子量。因此，質量49118Da表示完整的、 未被IdeS切割的抗體重鏈，其已經在樣品制備過程中通過還原從殘留抗體分子中分離。兩種柱子洗脫圖比較中的差異還見于峰Ia的情況中，該峰在JupiterClS柱的洗 脫圖中是檢測不到的。質量20037Da的類別在Pursuit 二苯基柱的峰Ia中被分離。將其 歸屬為HC片段是合理的，其是由于271位天冬氨酸(D271)和272位脯氨酸(P272)之間
22的Asp-Pro切割形成的。Asp-Pro切割的C-端片段的理論質量值是20033Da。由于該質 量出現在應激和未應激的抗體的質譜圖中，因此該切割產物不是在40°C下溫育獲得的降解 產物。盡管該片段明確地不是由40°C溫育形成的，然而其是抗體的降解產物，其僅能通過 Pursuit 二苯基柱分離。在Jupiter C18柱的情況中，該片段與氧化的類別一起出現在峰1 的肩峰中，這表明Pursuit 二苯基柱具有更好的分離行為。 Pursuit 二苯基柱和Jupiter C18柱之間的比較表明Pursuit 二苯基柱在特定方 面比Jupiter C18柱具有更好的分離性質(參見峰Ia和峰4)，并且在其它方面具有相當的 結果。因此，有效地改善抗體類別的分離是可能的。
2權利要求
檢測樣品中的抗體和抗體片段的方法，其特征在于包括下列步驟a)提供包含抗體和/或抗體片段的樣品，b)將a)項中提供的樣品與下列物質溫育i)IgG 特異性半胱氨酸蛋白酶，ii)糖苷酶，和iii)還原劑，c)將b)項中溫育的樣品通過聯用的液相色譜法和質譜法分析以檢測a)項提供的樣品中包含的完整的抗體和/或檢測抗體片段。
2.權利要求1的方法，其特征在于IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶是IdeS。
3.權利要求1的方法，其特征在于IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶具有氨基酸序列SEQID NO :1。
4.上述權利要求中任意一項的方法，其特征在于用IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶的溫 育在PH范圍為pH 5. 5至8. 5之間進行。
5.權利要求4的方法，其特征在于pH范圍為pH6. 5至8. 5之間。
6.權利要求5的方法，其特征在于pH范圍為7.0至8. 0之間。
7.上述權利要求中任意一項的方法，其特征在于IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶與樣品 中包含的抗體和/或抗體片段的摩爾比為1 25至1 2500之間。
8.權利要求7的方法，其特征在于摩爾比為1 25至1 100之間。
9.上述權利要求中任意一項的方法，其特征在于糖苷酶是N-糖苷酶F或EndoF2或 Endo H或神經氨酸酶或0-糖苷酶。
10.權利要求9的方法，其特征在于糖苷酶是N-糖苷酶F。
11.權利要求10的方法，其特征在于N-糖苷酶F衍生自腦膜炎膿毒性黃桿菌。
12.權利要求1至8中任意一項的方法，其特征在于糖苷酶具有氨基酸序列SEQID NO2。
13.上述權利要求中任意一項的方法，其特征在于步驟b)-i)、b)-ii)和b)-iii)的溫 育是連續地。
14.上述權利要求中任意一項的方法，其特征在于步驟b)-iii)是 iii)還原劑和甲酸。
15.上述權利要求中任意一項的方法，其特征在于還原劑是磷酸三氯乙酯。
16.上述權利要求中任意一項的方法，其特征在于液相色譜法是反相液相色譜法。
17.權利要求16的方法，其特征在于反相色譜法應用具有C8或C18殘基的色譜材料。
18.權利要求1至14中任意一項的方法，其特征在于液相色譜法是疏水相互作用色譜法。
19.權利要求18的方法，其特征在于疏水相互作用色譜法應用具有二苯基殘基的色譜 材料。
20.來自化膿鏈球菌的IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶IdeS在檢測樣品中的抗體或抗體 片段中的用途，其特征在于將樣品與IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶溫育，在與來自腦膜炎膿 毒性黃桿菌的N-糖苷酶F溫育后，將獲得的片段通過聯用的液相色譜法和質譜法分析。
21.用于檢測抗體或抗體片段的試劑盒，其特征在于該試劑盒包含i)來自化膿鏈球菌的IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶IdeS，和 )來自腦膜炎膿毒性黃桿菌的糖苷酶N-糖苷酶F。
22.檢測樣品中修飾的抗體形式的方法，其特征在于該方法包括下列步驟a)提供包含抗體和/或其切割產物的樣品，b)將a)項中提供的樣品與下列物質溫育 i) IgG-特異性半胱氨酸蛋白酶， )糖苷酶， iii)還原劑，c)將b)項中溫育的樣品通過疏水相互作用色譜法分析，從而檢測樣品中修飾的抗體 形式。
全文摘要
抗體是生物學大分子，其可能進行修飾和降解過程。本申請中描述了新的基于LC/MS的方法，該方法用于分離和表征抗體特異性降解產物，其包括酶消化步驟以應用IdeS酶切割重鏈。
文檔編號G01N33/68GK101903401SQ200880122074
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月18日 優先權日2007年12月21日
發明者B·埃澤爾, H·科爾, J·T·雷古拉, P·松德爾曼 申請人:羅切格利卡特公司