內毒素的測定方法和內毒素的測定用試劑盒的制作方法

專利名稱：內毒素的測定方法和內毒素的測定用試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測內毒素或測定其濃度的方法，以及用于其檢測或濃度測定的試劑盒。
背景技術：
內毒素是在革蘭氏陰性菌的細胞壁中存在的脂多糖，是最具代表性的熱源。如果 被內毒素污染的輸液、注射藥劑、血液等進入人體，則存在引起發熱或休克等重度副作用的 可能。因此，有義務管理上述的藥劑、器具等，以使其不被內毒素污染。在鱟的血細胞提取物(以下，也稱作“LAL 鱟變形細胞裂解物”)中，存在被內毒 素活化的絲氨酸蛋白酶。并且，在LAL與內毒素反應時，對應于內毒素的量所活化的絲氨酸 蛋白酶引起酶的級聯，由此在LAL存在的凝固蛋白原水解為凝固素并發生聚集，生成不溶 性的凝膠。作為測定該內毒素的濃度的方法，具有半定量的凝膠化法將與LAL混合的樣品 靜置，在一定時間后翻轉容器，根據樣品有無垂落判斷是否發生凝膠化，確定在樣品中是否 含有一定濃度以上的內毒素。另外，作為內毒素的其它高靈敏度定量法，具有隨著LAL和內 毒素反應引起的凝膠的生成，經時性地測定樣品的混濁并進行解析的比濁法，或使用由酶 的級聯引起水解并發色的合成基質的比色法。在上述的定量法中，比濁法存在在使低濃度的內毒素作用時，由于被活化的酶少 因此到檢測出凝膠的生成為止需要非常長的反應時間的情況。另一方面，比色法存在容易 受樣品的混濁(血脂等)或混入的色素(溶血所致的血紅蛋白等)影響的不良情況。由于 這些情況，特別是在急救時測定患者血液中的內毒素，或在人工透析時測定透析液或血液 中的內毒素時，不能說上述比濁法或比色法是最合適的方法。另外，提出激光散射粒子測量法通過攪拌使LAL和內毒素混合得到的樣品使微 粒迅速生成，同時由被凝膠微粒散射的激光的強度解析凝膠微粒的大小和數量，測定凝聚 初期的凝膠微粒生成。有報告稱，根據該方法，與比濁法相比，可以使測定時間縮短至三分 之一，且可以降低樣品的混濁或顏色的影響。但是，即使使用上述的激光散射粒子測量法，在1EU(內毒素單位)/L左右的低濃 度的內毒素的測定中，也需要40 50分鐘的測定時間。另外，在激光散射粒子測量法中， 由于觀察微小空間區域的粒子，因此存在光學體系變得復雜，難以進行多樣本測定的不良 情況。專利文獻1 日本專利第2667695號公報

發明內容
本發明是鑒于上述問題作出的發明，其目的在于，提供一種不易受樣品混濁或顏 色的影響、能夠迅速且簡便地進行內毒素檢測或濃度測定的技術。本發明所述的內毒素的測定方法以以下方面為最大特征。即，制作在LAL中所含的蛋白質吸附或結合在預先準備且分散于藥液中的微粒之上的試劑。并且，通過使含有內 毒素的樣品作用于該試劑，使微粒彼此聚集，迅速地生成大的凝聚體，檢測該凝聚體的生 成，由此進行內毒素的測定。更具體地，是檢測樣品中的內毒素或測定樣品中的內毒素的濃度的內毒素的測定 方法，其特征在于，使在鱟的血細胞提取物中所含的規定蛋白質結合或吸附在可分散于試劑中的微 粒的表面，使結合或吸附上述蛋白質的上述微粒分散得到的試劑和樣品混合，通過檢測上述試劑和上述樣品的混合液中的凝膠生成，進行內毒素的檢測，或通 過測定上述凝膠的生成程度，測定內毒素的濃度。在此，通過申請人的深入研究，可知如果在LAL中所含的蛋白質結合或吸附在例 如樹脂制的微粒上的狀態下，使內毒素起作用，則與使含有內毒素的樣品作用于LAL單體 的情況相比，可以迅速地生成更大的凝聚體。這是由于，微粒上的凝固蛋白原通過LAL中的 酶的級聯水解，生成凝固素，這些微粒彼此聚集的原因。另外，還明確了該凝集反應不易受 樣品混濁或顏色的影響，而且，該凝集反應與用LAL單體引起的凝集反應相比，非常強大。在本發明中，利用這種現象，制作LAL中所含的蛋白質結合或吸附在微粒上的試 劑，使含有內毒素的樣品作用于該試劑(以下，也稱為“LAL試劑”)，由此使微粒彼此聚集， 而迅速地生成更大的凝聚體，促進LAL試劑和樣品的混合液中的凝膠的生成。這樣，在內毒 素的檢測和濃度測定(以下，也將這些合并稱為“內毒素的測定”)中，可以降低樣品混濁或 顏色的影響，另外，可以更加迅速且簡便地進行檢測和濃度測定。應予說明，上述的規定蛋白質是具有與內毒素反應并生成凝膠的特性的物質，至 少含有凝固蛋白原。另外，也可以含有絲氨酸蛋白酶等其它的蛋白質。另外，在本發明中， 凝膠的生成的意思是指，包含上述的微粒彼此聚集引起的凝聚體的生成，未結合或吸附至 微粒的凝固素聚集引起的凝膠粒子的生成，LAL試劑和樣品的混合液的凝膠化中的至少任
一現象。另外，在本發明中，凝膠生成的程度的意思是指，例如，上述微粒彼此聚集引起的 凝聚體，和未結合或吸附至微粒的凝固素聚集引起的凝膠粒子的大小或數目的增加。或者， 意思是LAL試劑和樣品的混合液的凝膠化引起的混合液的物理、化學特性(例如，濁度)的 變化。此處，上述規定蛋白質可以是由鱟的血細胞提取物純化得到的凝固蛋白原。如上所述，在使內毒素作用于LAL時的凝集反應中，凝固蛋白原通過LAL中的酶的 級聯水解，生成凝固素，這些微粒彼此聚集。因此，通過預先純化LAL中的蛋白質，只提取凝 固蛋白原并事先結合或吸附至微粒，可以更有效地使微粒彼此聚集，可以更迅速地生成凝 聚體。另外，在本發明中，在上述規定蛋白質含有絲氨酸蛋白酶和凝固蛋白原時，在上述 規定蛋白結合或吸附的上述微粒分散的試劑中，在試劑的制備過程中，還可以添加抑制該 試劑中的絲氨酸蛋白酶和凝固蛋白原反應的抑制劑。其中，在LAL中所含的蛋白質結合或吸附于微粒上時，首先，使能夠結合、吸附蛋 白質的官能團存在于微粒的表面。并且，在該狀態下使LAL試劑起作用，使蛋白質化學結合至微粒表面，或使其靜電性地、親水性地、疏水性地吸附。此時，認為由于LAL中的蛋白質和 微粒的結合、吸附反應需要長時間，在微粒或使用的試劑類、水等中微量混有的內毒素與蛋 白質中的絲氨酸蛋白酶反應，將凝固蛋白原水解為凝固素，結果微粒開始凝聚。并且在此 時，認為酶的活化引起試劑中的凝固蛋白原水解而消耗。與此相對，在本發明中，在上述規定蛋白質含有絲氨酸蛋白酶和凝固蛋白原時，在 結合或吸附上述規定蛋白質的上述微粒分散得到的試劑中，添加抑制該試劑中的絲氨酸蛋 白酶和凝固蛋白原反應的抑制劑。由此，抑制在試劑的制備過程中的微粒的凝聚，同時抑制 酶的活化導致凝固蛋白原水解而消耗。具體地，上述抑制劑可以是已知具有使內毒素失活作用的鐵離子或鋁離子。另外， 也可以是使LAL中的絲氨酸蛋白酶不活化的酶抑制劑。另外，在本發明中，將結合或吸附上述規定蛋白質的上述微粒分散得到的試劑進 一步與鱟的血細胞提取物混合，在與上述混合同時或在混合后，可使上述試劑和上述樣品混合。由此，相對于結合或吸附蛋白質的微粒分散得到的試劑，可以進一步預先補給LAL 中的蛋白質。這樣，在與含有內毒素的樣品混合時，可以更可靠地使內毒素作用于試劑中的 絲氨酸蛋白酶，將結合或吸附在微粒上的凝固蛋白原和混合的LAL中的凝固蛋白原水解， 生成凝固素。結果，可以更可靠地使結合或吸附在微粒上的凝固蛋白原之間，或者結合或吸 附在微粒上的凝固蛋白原和混合的LAL中的凝固蛋白原聚集，可以促進以微粒為中心的凝 聚體的生成。這樣，可以在更短的時間進行內毒素的測定。另外，據此，預先純化LAL中的蛋白質并只提取凝固蛋白原，使其結合或吸附至微 粒的情況，或者在上述試劑的制備過程中，添加抑制試劑中的絲氨酸蛋白酶和內毒素的反 應的抑制劑的情況也是有利的。即，在這些情況下，在將上述試劑和含有內毒素的樣品混合 時，可以更可靠地使內毒素作用于絲氨酸蛋白酶。應予說明，在上述中，將結合或吸附上述規定蛋白質的上述微粒分散得到的試劑 進一步與鱟的血細胞提取物混合，之后再與含有內毒素的樣品混合時，該混合時期可以在 與上述血細胞提取物混合后，也可以與混合同時。但是，從使補給至試劑中的凝固蛋白原或 絲氨酸蛋白酶更均勻地分散的觀點考慮，優選與含有內毒素的樣品的混合在由上述試劑和 上述血細胞提取物混合時開始經過規定時間后進行。另外，本發明可以是內毒素測定用試劑盒，其特征在于，使鱟的血細胞提取物中所 含的規定蛋白質結合或吸附在可分散在試劑中的微粒的表面而制備。其中，規定蛋白質是具有與內毒素反應并生成凝膠的特性的蛋白質，至少含有凝 固蛋白原。另外，還可以含有絲氨酸蛋白酶等其它蛋白質。另外，在本發明所述的內毒素測定用試劑盒中，規定蛋白質可以是由鱟的血細胞 提取物純化的凝固蛋白原。另外，在本發明所述的內毒素測定用試劑盒中，規定蛋白質含有絲氨酸蛋白酶和 凝固蛋白原，可以在結合或吸附上述規定蛋白質的上述微粒分散得到的試劑中，進一步添 加抑制上述絲氨酸蛋白酶和凝固蛋白原反應的抑制劑。此處，如上所述，認為在使鱟的血細胞提取物中所含的規定蛋白質結合或吸附在 可分散于試劑中的微粒的表面來制備試劑盒時，在微粒或使用的試劑類、水等中微量混有的內毒素與蛋白質中的絲氨酸蛋白酶反應。這樣，認為在試劑制備過程中，將凝固蛋白原水 解為凝固素并開始微粒的凝聚，結果消耗試劑中的凝固蛋白原。與此相對，在本發明所述的內毒素測定用試劑盒中，在上述規定蛋白質含有絲氨 酸蛋白酶和凝固蛋白原時，在結合或吸附上述規定蛋白質的上述微粒分散得到的試劑中， 進一步添加抑制上述絲氨酸蛋白酶和內毒素反應的抑制劑。這樣，可以抑制在試劑的制備 過程中的微粒的凝聚，同時可以抑制酶的活化導致凝固蛋白原水解而消耗。此處，上述抑制 劑可以是鐵離子或鋁離子，還可以是酶抑制劑。另外，在本發明所述的內毒素測定用試劑盒中，可以將結合或吸附上述規定蛋白 質的上述微粒分散得到的試劑進一步與鱟的血細胞提取物混合而制備。應予說明，對于解決上述本發明的問題的方法，可以盡可能地組合使用。本發明可以不易受樣品混濁或顏色的影響、能夠迅速且簡便地進行內毒素檢測或 濃度測定。


圖1是用于說明本發明的實施例中的LAL結合珠的凝聚機制的圖。圖2是用于說明在將本發明的LAL結合珠試劑與含有內毒素的樣品混合時，LAL結 合珠的量與混合液的透射光強度的變化的關系的圖。圖3是用于說明在將本發明的LAL結合珠試劑與含有內毒素的樣品混合時，內毒 素的濃度與混合液的透射光強度的變化的關系的圖。圖4是用于說明在使用LAL結合珠法時和使用激光散射粒子測量法時，在LAL中 的蛋白質和內毒素的反應中，比較內毒素的濃度與凝膠凝聚開始時間的關系的圖。符號說明1...珠2...凝固蛋白原3···凝固蛋白原10. . . LAL 結合珠
具體實施例方式詳細地研究LAL和內毒素反應生成凝膠的過程。即，認為如果內毒素結合至LAL 中作為絲氨酸蛋白酶的C因子，則C因子活化，活化的C因子使LAL中的其它的作為絲氨酸 蛋白酶的B因子水解并活化。該活化的B因子直接將LAL中的凝固酶前體水解并形成凝固 酶，進一步地，該凝固酶將LAL中的凝固蛋白原水解，生成凝固素。并且，生成的凝固素彼此 聚集，進一步生成不溶性的凝膠。這一系列反應與可見于哺乳動物中的介由凝血因子IX或凝血酶等的絲氨酸蛋白 酶的纖維蛋白凝膠的生成過程類似。這樣的酶級聯反應即使有極少量的活化因子，也由于 連鎖其后的級聯而活化，因此具有非常強的放大作用。因此，根據使用LAL的內毒素測定 法，能夠檢測亞皮克/mL級別的極其微量的內毒素。作為可以定量內毒素的測定方法，如上所述，列舉比濁法以及激光散射粒子測量 法。這些測定方法可以將通過該LAL酶級聯反應生成的凝固素的聚集物在前者作為樣品的混濁，在后者作為體系內生成的凝膠微粒進行檢測，由此可以進行高靈敏度的測定。但是，在比濁法中，由于每個凝固素都是納米級別的微小粒子，因此即使它們逐漸 聚集，如果不成長至可光學檢測的大小，也無法作為濁度進行檢測。另外，在比濁法中，一 般將樣品靜置，等待全體體系中凝膠的生成，因此凝固素彼此的碰撞概率低，聚集速度未必 快。因此，在使用比濁法時，存在到可以檢測內毒素或濃度測定為止需要相當長的時間的不 良情況。與此相對，在激光散射粒子測量法中，由于直接測定在體系內生成的凝膠的微粒， 因此較比濁法的靈敏度要高，且由于一般強制攪拌包含LAL和樣本的樣品，因此與比濁法 相比可以在短時間檢測凝膠的生成。但是，在激光散射粒子測量法中，由于觀察微小空間區域的粒子，因此存在光學系 統變得復雜，難以通過簡便的裝置進行測定的不良情況。另外，作為其它的內毒素測定法，有比色法。這是利用LAL的酶級聯反應的同時， 不測定凝固蛋白原所致的樣品的混濁，而是利用受凝固酶水解而發色的合成基質，使含有 合成基質的LAL和樣本反應，測定其吸光度變化的方法。在該比色法中，由于測定在體系內 生成的發色物質的濃度，因此，與測定在樣品中的凝膠生成的比濁法和激光散射粒子測量 法相比，可以在短時間測定低濃度的內毒素。但是，發色合成基質在405 410nm附近處有吸收峰，該波長與伴隨溶血而混入樣 品中的血紅蛋白的吸收峰(410nm)重疊。另外，由于血液中的乳糜等白色散射體對越短的 光波長越產生散射，因此發色合成介質的吸收峰即使位于可見光區域，最短波長側(紫)的 光也特別容易受到白色散射體的影響。這樣，雖然比色法的測定時間為極短的時間，但在另 一方面，對于以血液為主體的樣本的測定，存在精度方面的問題。在本發明中，將降低樣品的濁度或顏色對測定的影響作為目的之一。因此，不是 比色法這樣的使用發色合成基質的方法，而是利用LAL的酶的級聯引起的凝固素的生成過 程。進一步地，還將下述測定方法的確立作為目的之一，該測定方法雖然與比濁法類似，但 可以比激光散射粒子測量法在更短時間內進行測定，且裝置構成容易。因此，不利用被動地 等待由LAL的酶級聯引起的由凝固蛋白原到凝固素的水解和逐漸的聚集過程的方法。以下，參照附圖，示例性地詳細說明用于實施本發明的最佳實施方式。實施例1在本實施例中，預先使凝固蛋白原結合至用比濁法或激光散射粒子測量法可檢測 的、或者比可檢測的界限小若干尺寸的微粒的表面。并且，在將其與LAL試劑混合而制備的 試劑中混合含有內毒素的樣品。由此，使得在LAL中生成的凝固素和在微粒上生成的凝固 素聚集，或者，使得在微粒上生成的凝固素聚集，在短時間生成可用比濁法或激光散射粒子 測量法檢測的尺寸的凝聚體。結果，通過比濁法或激光散射粒子測量法，可以更加迅速地進 行內毒素的測定。在圖1中，表示本實施例引起的微粒的凝膠機制。在圖1中，中央箭頭的左側是與 內毒素反應前的試劑的示意圖。箭頭的右側是與內毒素反應后的試劑的示意圖。如圖1所示，反應前，本實施例中的作為微粒的珠1、結合在微粒表面的凝固蛋白 原2和未結合在微粒表面的凝固蛋白原3是分散的狀態。應予說明，以下為了方便，將使凝 固蛋白原2結合至珠1的狀態的微粒稱為LAL結合珠10。
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在作為結合凝固蛋白原2的載體的珠1上，可以吸附、擔載或結合LAL中蛋白質所 含的凝固蛋白原2，能在反應體系內均勻分散，且選擇既不妨礙內毒素引起的凝膠生成過程 又不使其亢進的物質。珠1的材料沒有特別限定，但可以示例聚苯乙烯膠乳樹脂、二氧化 硅、有機硅樹脂、纖維素樹脂、聚乙烯醇樹脂、羥基磷灰石等，優選聚苯乙烯膠乳樹脂、二氧 化硅、纖維素樹脂。珠1的大小從可通過凝聚提前進行光學檢測的條件、制備時的操作的容易程度、 在體系內分散的容易程度等出發，使用0.05μπι 50μπι范圍的珠。并且，進一步優選 0. 1 30 μ m的范圍。在使凝固蛋白原2結合至珠1的表面中，可考慮親電性地、親水性地 或疏水性地使凝固蛋白原2吸附的方法，和使其化學結合的方法。為使凝固蛋白原2親電性地、親水性地或疏水性地吸附于珠1，在珠1的表面必須 存在可以擔載凝固蛋白原2的官能團。作為這樣的官能團，可以列舉氨基、羧基、磷酸基、羥
基、磺酸基、巰基、醇基 、焼基等。另一方面，在使凝固蛋白原2化學性地結合至珠1表面時，必須存在可以與凝固蛋 白原2的側鏈中所含的氨基、羧基、巰基等化學結合的官能團。作為這樣的官能團，可以列 舉羧基、氨基、乙烯基、環氧基、苯乙烯基、甲基丙烯酰氧基、丙烯酰氧基、酰脲基、巰基、硫醚 基、異氰酸酯基、異硫氰酸酯基等。使LAL試劑或由LAL試劑等制備、純化的凝固蛋白原作用于在表面具有這些官能 團的聚苯乙烯膠乳樹脂、二氧化硅、有機硅樹脂、纖維素樹脂、聚乙烯醇樹脂、羥基磷灰石等 的珠1。由此，使凝固蛋白原2靜電性地、親水性地或疏水性地吸附、擔載在珠1的表面。另 外，珠1上的反應性官能團和凝固蛋白原2經由凝固蛋白原2中的氨基、羧基或者巰基等進 行化學結合。由此，可以制備LAL結合珠10。此時的反應溫度和反應時間由能否進行吸附、擔載決定，或由能否進行化學結合 決定，但優選反應溫度為0°c 45°C，進一步優選為4°C 37°C。另外，反應時間優選為10 分鐘 64小時，進一步優選為2小時 24小時。另外，優選將樣品進行充分攪拌，以使在 反應時發生均勻的反應。應予說明，在珠1上吸附、擔載、結合凝固蛋白原2時，可以使LAL中所含的蛋白質 無區別地吸附、擔載、結合至珠1，也可以將LAL中的凝固蛋白原純化來進行吸附、擔載、結 合。在采用使在LAL中所含的蛋白質無區別地吸附、擔載、結合至微粒的方法時，在珠1上 也吸附、擔載、結合凝固蛋白原2以外的蛋白質，但由于可以省略純化LAL中的凝固蛋白原 的工序，因此可以降低試劑的制備、純化涉及的成本。應予說明，此時，在圖1中，在珠1上 和珠1的周圍的試劑中，除了凝固蛋白原2、3以外，更多地存在LAL中所含的其它的蛋白質 (未示出)。另外，在上述中，凝固蛋白原或LAL中的蛋白質和珠1的吸附、擔載、結合的反應是 長時間的。因此，認為在珠1自身或使用的試劑類、水等中混入即使微量的內毒素時，在試 劑完成前，因混入的內毒素而活化的凝固酶使凝固蛋白原水解并生成凝固素，在體系內凝 聚。為了將其抑制，可以在體系內添加已知具有使內毒素失活作用的鐵離子或鋁離子。優 選此時添加的鐵離子或鋁離子的濃度為IOOmM以下。另外，為了不使LAL中的絲氨酸蛋白酶活化，還可以添加各種酶抑制劑。作為這樣 的酶抑制劑，可以示例二異丙基氟磷酸酯、芐脒、苯基甲磺酰氟、4-(2_氨乙基)苯磺酰氟、6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲磺酸酯、對脒苯基甲磺酰氟、抑酶酞、抗蛋白酶、亮抑 蛋白酶肽、大腸桿菌素(Ecotin)、PPACK(苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-氯甲酮)、α 2-巨 球蛋白、胰蛋白酶抑制劑等。這些酶抑制劑的濃度可以為IOOmM以下。并且，進一步優選為 20mM以下。在此狀態下，LAL結合珠10彼此可以完全獨立地分散。另外，通過吸附、擔載或化 學結合的作用，在LAL結合珠10的一部分或全部中，多個珠可以交聯。這樣制備的LAL結合 珠10之后以除去未結合至珠1的過量LAL中的蛋白質或凝固蛋白原，還有鐵離子、鋁離子 或酶抑制劑等的添加物的目的出發，用不含內毒素的純化水或生理鹽水等進行洗滌。并且， 使其在這些純化水或生理鹽水等中再懸濁，以形成符合最終使用目的的濃度，供給使用。以 下，將該狀態的試劑稱為LAL結合試劑。其次，說明本實施例中的利用LAL結合珠試劑的實際的內毒素的檢測或濃度測 定。在本實施例中，對于以下的情況進行說明對于上述LAL結合珠試劑，進一步混合LAL 試劑，使混合后的試劑與含有內毒素的樣本樣品混合。應予說明，在以下的說明中，在制備 上述LAL結合珠試劑時，以添加酶抑制劑為前提。其中，如上所述，在LAL結合珠試劑的制備階段，通過洗滌除去未結合至珠1的過 量的LAL中的蛋白質、或由LAL中蛋白質純化得到的凝固蛋白原3。另外，吸附、擔載、結合 至珠1的絲氨酸蛋白酶由于酶抑制劑的添加而被不可逆地抑制。因此，即使將該狀態的LAL 結合珠試劑單獨與含有內毒素的樣品混合，也不能期待LAL結合珠10的凝聚。因此，在本實施例中，將LAL結合珠試劑進一步與LAL試劑混合后，與含有內毒素 的樣品混合，使LAL結合珠10凝聚。由此，可以對LAL結合珠試劑補給以絲氨酸蛋白酶為 代表的LAL中的蛋白質的各成分。這樣，在與含有內毒素的樣品混合時，可以更可靠地使內 毒素作用于試劑中的絲氨酸蛋白酶，可以更可靠地水解凝固蛋白原并生成凝固素。結果，可 以更可靠地使LAL結合珠10凝聚，進行迅速的內毒素測定。另外，此時，由于經補給的LAL試劑中含有凝固蛋白原，因此通過來自經補給的 LAL試劑中的凝固蛋白原的凝固素，還可以期待促進LAL結合珠10的凝聚的效果。另外，在本實施例中，即使LAL結合珠10上的絲氨酸蛋白酶失活，由于在混合的 LAL試劑中存在過量的絲氨酸蛋白酶，因此也可以使用在制備LAL結合珠試劑時具有不可 逆的、且強作用的酶抑制劑。如上所述制備的LAL結合珠試劑為了謀求測定的便利性，還可以進行以下制備 通過使規定量的LAL結合珠試劑冷凍干燥，只加入樣本樣品就可以測定。另外，在此時，可 以將冷凍干燥的LAL試劑和同樣冷凍干燥的LAL接合珠試劑以任意比例混合，或者也可以 將LAL結合珠試劑和LAL試劑以任意比例混合后進行冷凍干燥。(制造例1)其次，說明在珠表面具有羧基的聚苯乙烯膠乳粒子和LAL試劑，在使不可逆的 酶抑制劑起作用的環境下結合的LAL結合珠試劑的實際制造例。作為在表面具有羧基 的珠 1，使用 Polyscience 公司制的粒徑 0. 45 μ m 或 1. 0 μ m 的 Polybead Calboxylate Microsphere (以下簡稱為 “PCM”)。作為LAL試劑，使用和光純藥制的內毒素檢測試劑，即'J幻B HS-T ν > ^ ^ r ^卜7 ^ —(以下簡稱為“LAL試劑”)。將1. OmL的PCM置入最大容量2. OmL的離心管，進一步加入PH 9. 6的0. IM碳酸緩沖液至最大容量，充分混合后，用臺式離心機以12500rpm 進行5分鐘離心，使PCM沉淀除去上清液。進一步重復兩次這樣的與碳酸緩沖液的混合、離 心、除去上清液的一系列的操作，接著，在沉淀的PCM中加入pH 4. 5的0. 02M的磷酸緩沖液 至最大容量，使其混合后，同樣地進行總共3次離心、除去上清液的操作。
在得到的PCM沉淀物中加入在此使用的磷酸緩沖液0. 75mL,進一步地，加入 0. 75mL的2. 0%碳二亞胺水溶液(水溶性碳二亞胺，同仁化學制)，在室溫使用翻轉攪拌法 攪拌3小時，使PCM上的羧基活化。反應后的PCM離心并除去上清液后，再次，用同樣的磷 酸緩沖液洗滌3次，在最后得到的PCM沉淀物中加入pH 8. 5的0. 2M硼酸緩沖液0. 5mL并 使其懸濁后，接著，準備在LAL試劑中加入硼酸緩沖液0. 25mL并使其溶解得到的LAL試劑 溶液2支，將它們與PCM懸濁液混合，使容量為1. OmL0進一步地，在其中加入作為絲氨酸蛋 白酶抑制劑的PMSF(苯基甲磺酰氟)，以使最終濃度為4mM。在室溫反應2小時后，在4°C反 應過夜，以使混合溶液中PCM上存在的活化的羧基與LAL中的各蛋白質具有的氨基形成酰 胺鍵。將混合溶液離心除去上清液后，在1. 2mL的硼酸緩沖液中再懸濁，進一步地，在該 溶液中加入50 μ L的0. 25Μ的2-氨基乙醇/硼酸緩沖液，在室溫翻轉攪拌30分鐘后，用氨 基乙醇消耗PCM上未反應的活化羧基。最后，在離心PCM懸濁液并得到PCM沉淀物后，總計 進行3次用注射用生理鹽水(大冢制藥制)再次懸濁、離心、除去上清液的一系列操作，進 行洗滌，得到LAL結合珠試劑。(測定例1)接著，對于實際使用在上述制造例1得到的LAL結合珠試劑的測定例1進行說明。 在注射用生理鹽水中使在制造例1得到的LAL結合珠試劑懸濁，形成10mL。將各種量的LAL 結合珠懸濁液與注射用水(大冢制藥制)混合，形成100 μ L0進一步地，將其與LAL試劑 ('J ^^ ^ HS-T * >夕‘義〒；^卜7 ^ —)混合，進一步加入2EU/L的濃度的內毒素水溶液 IOOuL0將該合計200 μ L的混合液轉移至外徑7mm、在內部具有磁力攪拌器、且干熱滅菌 (250°C，5小時)處理的玻璃制測定小杯，用可以邊攪拌樣品邊隨時間記錄濁度變化的血小 板凝聚測定裝置PA-200 (興和制)，記錄隨著LAL結合珠10的凝聚，透射光強度的時間變 化。在圖2中，表示通過上述測定得到的透射光強度的時間變化。在圖2中，橫軸為時 間，縱軸為混合液的透射光強度。在圖2中，記錄的數據以攪拌開始5分鐘后的透射光強度 為100%，表示出在LAL結合珠10的添加量不同時的各樣品的透射光強度的變化。根據圖 2判定，添加的LAL結合珠10的量越多，則變化量可以越大，且凝聚的開始時間越早。其中，在將本實施例中的LAL結合珠試劑用于內毒素檢測時，例如在圖2中透射光 強度達到規定值，可以判斷樣品含有內毒素。此時，根據本實施例，添加的LAL結合珠10的 量越多，內毒素的檢測所需要的時間可以越短。其中，在圖2中透射光強度達到規定值，判 斷樣品含有內毒素，這在混合液中的凝膠生成檢測中相當于進行內毒素檢測。(測定例2)接著，對于使用在制造例1得到的LAL結合珠試劑的其它的測定例進行說明。在 本測定中，在注射用生理鹽水中使在制造例1得到的LAL結合珠試劑懸濁，形成20mL。由其 中取出100 μ L，在LAL試劑中混合，進一步地，與含有各種濃度的內毒素水溶液100 μ L混
10合，使總計容量為200 μ L。并且，與上述測定例1相同地，對于各種樣品，記錄以攪拌開始5 分鐘后的透射光強度為100%的透射光強度的變化。在圖3中，表示通過本測定得到的透射光強度的時間變化。在圖3中，橫軸為時間， 縱軸為混合液的透射光強度。如圖3所示，樣品中內毒素的添加濃度越高，透射光強度的上 升越劇烈，凝聚開始時間越短。即，在將本實施例的LAL結合珠試劑用于內毒素的濃度測定 時，例如在圖3中，可以基于透射光強度到達規定值所需要的時間(凝聚開始時間)，進行濃 度測定。另外，在本發明中，這在測定凝膠的生成程度中，相當于內毒素濃度的測定。接著，將此時得到的內毒素濃度和凝聚開始時間的關系與不使用LAL結合珠10時 在激光散射粒子測量法得到的內毒素的濃度和凝聚開始時間的關系進行比較。比較結果在 圖4表示。如圖4所示，在使用LAL結合珠10時(在圖4中，為了簡便，記載為“LAL結合 珠法”)，雖然使用比濁法，與使用激光散射粒子測量法時相比，凝聚開始時間縮短。由此可 知，通過使用LAL結合珠10，與使用激光散射粒子測量法時相比，可以迅速地檢測內毒素。應予說明，在本實施例的制造例1中，使在LAL中所含的蛋白質無區別地結合至珠 1，制備LAL結合珠試劑。但是，如本實施例所述，在將LAL結合珠試劑進一步與LAL試劑混 合后，與含有內毒素的樣品混合，使LAL結合珠10凝聚時，優選在形成LAL結合珠10的珠1 上盡可能多地吸附、擔載、結合凝固蛋白原。因此，在生成LAL結合珠10時，與其使LAL中 所含的蛋白質無區別地結合至珠1，不如使純化的凝固蛋白原吸附、擔載、結合至珠1。另外，如本實施例所述，在使LAL中的各蛋白質無區別地吸附、擔載、結合至珠1， 制備LAL結合珠試劑時，可以存在至少1中以上的酶抑制劑，以及至少1種以上的具有使內 毒素自身機能衰減的作用的鐵離子或鋁離子，進行制備，以使凝固蛋白原不水解為凝固素。 另外，可以單獨添加鐵離子或鋁離子的至少一種以上。另外，在上述實施例中，將LAL結合珠試劑和LAL試劑混合，進一步與內毒素水溶 液混合，邊攪拌混合液邊測定濁度隨時間的變化，但混合液的攪拌未必是必須的。通過不攪 拌混合液而靜置，同時測定濁度隨時間的變化，也可通過使用LAL結合珠試劑，期待迅速地 測定內毒素。另外，在上述實施例中，可以將LAL結合珠試劑與LAL試劑混合，進一步與內毒素 水溶液混合，邊攪拌混合液邊通過激光散射粒子測量法測定凝膠的生成(LAL結合珠10彼 此的聚集導致凝聚體的生成)。這樣，通過LAL結合珠法和激光散射粒子測量法的協同效 果，可以期待更加迅速地進行內毒素的測定。實施例2其次，對于本發明的實施例2進行說明。在本實施例中，對于將LAL結合珠試劑單 獨與含有內毒素的樣本樣品混合進行使用的例子進行說明。在將LAL結合珠試劑單獨與含有內毒素的樣本樣品混合進行使用時，由于可以省 略LAL結合珠試劑和LAL試劑的混合的工序，因此可以更簡便地進行內毒素的測定。另一 方面，在此時，由于對于LAL結合珠試劑，不能進一步添加LAL試劑，因此不能對LAL結合珠 試劑進行LAL中的蛋白質補給。因此，在此時，優選在LAL結合珠10上吸附、擔載、結合凝固蛋白原和絲氨酸蛋白 酶兩者。這樣，即使不將LAL結合珠試劑進一步與LAL試劑混合，通過LAL結合珠試劑單體 與含有內毒素的樣品混合，也可以使內毒素作用于在LAL結合珠試劑中含有的絲氨酸蛋白酶。這樣，可以將LAL結合珠試劑中所含的凝固蛋白原水解為凝固素，結果，可以使LAL結 合珠試劑中的LAL結合珠10彼此聚集并提前凝聚。這樣，在本實施例中，在制備LAL結合珠試劑時，在珠1的表面不是僅吸附、擔載、 結合純化的凝固蛋白原，而期望在珠1的表面吸附、擔載、結合LAL中的各種蛋白質。接著，在本實施例中，考慮對于珠1，結合凝固蛋白原和以絲氨酸蛋白酶為代表的 LAL中的蛋白質的凝固蛋白原以外的各成分的情況。即使在這種情況下，在本實施例中，在 LAL結合珠試劑的制備過程中，在絲氨酸蛋白酶的活性被添加的酶抑制劑不可逆地抑制的 狀態下，即使將LAL結合珠試劑和含有內毒素的樣品混合，也不能期待LAL結合珠10的凝 聚ο因此，在本實施例中，優選采用不會使酶功能被不可逆地抑制或失活的酶抑制劑 的選擇或制備法。例如，在LAL結合珠試劑的制備過程中，為了使內毒素的作用減弱，可以 添加過量的鐵離子或鋁離子，以不抑制酶功能地防止凝固蛋白原水解為凝固素。另外，例 如，在LAL結合珠試劑的制備過程中，也可以通過非不可逆的酶抑制劑(可逆性抑制劑)，來 抑制絲氨酸蛋白酶的活性。此時，存在通過洗滌來解除酶的失活的可能。這樣，可以抑制吸附、擔載、結合在珠1上的LAL中蛋白質的酶功能被不可逆地抑 制或失活。結果，即使不在LAL結合珠試劑中進一步混合LAL試劑，通過與含有內毒素的樣 品的混合，也可以進行高靈敏度的內毒素的測定。應予說明，在上述實施例中，制備的LAL結合珠試劑相當于本發明的內毒素測定 用試齊U盒。
權利要求
內毒素的測定方法，其是檢測樣品中的內毒素或測定樣品中的內毒素的濃度的內毒素的測定方法，其特征在于，使鱟的血細胞提取物中所含的規定蛋白質結合或吸附在可分散于試劑中的微粒的表面，使結合或吸附上述蛋白質的上述微粒分散得到的試劑和樣品混合，通過檢測上述試劑和上述樣品的混合液中的凝膠生成，進行內毒素的檢測，或通過測定上述凝膠的生成程度，測定內毒素的濃度。
2.根據權利要求1所述的內毒素的測定方法，其特征在于，上述規定蛋白質是由鱟的 血細胞提取物純化的凝固蛋白原。
3.根據權利要求1或2所述的內毒素的測定方法，其特征在于，將結合或吸附上述規定 蛋白質的上述微粒分散得到的試劑進一步與鱟的血細胞提取物混合，在與上述混合同時或在混合后，使上述試劑和上述樣品混合。
4.內毒素測定用試劑盒，其特征在于，使在鱟的血細胞提取物中所含的規定蛋白質結 合或吸附在可分散于試劑中的微粒的表面而制備。
5.根據權利要求4所述的內毒素測定用試劑盒，其特征在于，上述規定蛋白質是由鱟 的血細胞提取物純化的凝固蛋白原。
6.根據權利要求4所述的內毒素測定用試劑盒，其特征在于，上述規定蛋白含有絲氨酸蛋白酶和凝固蛋白原，在結合或吸附上述規定蛋白質的上述微粒分散得到的試劑中，進一步添加抑制上述絲 氨酸蛋白酶和凝固蛋白原反應的抑制劑。
7.根據權利要求4 6任一項所述的內毒素測定用試劑盒，其特征在于，將結合或吸附 上述規定蛋白質的上述微粒分散得到的試劑進一步與鱟的血細胞提取物混合而制備。
全文摘要
本發明提供一種不易受樣品混濁或顏色的影響、能夠迅速且簡便地進行內毒素檢測或濃度測定的技術。制作使LAL中所含的蛋白質吸附或結合在預先準備且分散于藥液中的微粒上的試劑，使該試劑與含有內毒素的樣品混合。由此，使內毒素作用于微粒上的蛋白質，使微粒彼此聚集，迅速地生成大的凝聚體。對該凝聚體的生成進行光學測定，由此進行內毒素的檢測或濃度測定。
文檔編號G01N33/579GK101903776SQ200880121670
公開日2010年12月1日 申請日期2008年12月18日 優先權日2007年12月19日
發明者藪崎克己 申請人:興和株式會社