專利名稱：與風濕性關節炎自身抗體發生免疫反應的合成肽的制作方法
與風濕性關節炎自身抗體發生免疫反應的合成肽發明概述本發明的具體實施方式
與合成肽有關，所述的合成肽優先被從具有風濕性關節炎 風險或者患有風濕性關節炎的患者中檢測到的自身抗體、特別是自身免疫抗體所識別，所 述合成肽能夠提高對癥狀發生前的患者以及表現出風濕性關節炎癥狀的患者中的這些自 身抗體進行檢測的特異性和敏感性。本發明的肽具有獨特序列且在天然中沒有發現，其包括沿著肽鏈上選定位點的一 系列瓜氨酸殘基以及這些瓜氨酸殘基間優化數量的殘基。所選氨基酸殘基的組裝和序列賦 予最優的電荷和疏水性，以提高與自身免疫抗體的反應性。進一步地，所述各個肽還可被環 化。這些環化的合成肽還可以進一步以單體、二聚體、三聚體以及多聚體的形式被多聚化。 意想不到的是，設計的合成抗原模擬肽序列中的瓜氨酸殘基間距的組合、以及根據本發明 實施方式的多聚體混合物被證明非常適用于提高風濕性關節炎的診斷。這些合成肽優選具 有下面的通式[X(aa)nX]m，其中X =瓜氨酸殘基，aa =具有η = 0-8的氨基酸，m彡1。根據本發明的一個方面，提供了一種合成肽，其由選自下列的氨基酸序列構成 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、 SEQ ID NO :19、SEQ IDNO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 25、SEQID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID N0:31、SEQ ID NO :32和SEQ ID NO :33。在進一步的實施方式中，這些肽可以被環化。根據本發明的另一個方面，提供了一種用于檢測具有風濕性關節炎風險或者患有 風濕性關節炎的患者所表達的自身免疫抗體的組合物，該組合物含有至少一個肽，所述肽 由選自下列的氨基酸序列構成:SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、 SEQ ID NO 17,SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ IDNO :23、 SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQID NO :28、SEQ ID NO 29,SEQ ID NO 30,SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO 33 以及它們的組合。進一步 的實施方式中，組合物中的肽可以被環化。進一步的實施方式中，肽可以被環化為單體、二 聚體、三聚體和多聚體等一系列形式。根據本發明的另一個方面，提供了含有至少兩個肽的組合物，所述肽含有選自下 述組中的一個氨基酸序列SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO :1U SEQ ID N0:12、SEQ ID NO : 13、SEQ ID N0:14、SEQ ID NO : 15、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、 SEQ IDNO 24,SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQID NO :29、
4SEQ ID NO 30, SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32 禾口 SEQ ID NO :33，其中至少兩個所述的至少 兩個肽是環化的。進一步的實施方式中，肽可以被環化為單體、二聚體、三聚體和多聚體等 一系列形式。根據本發明的另一個方面，提供了選自以下組的一種合成肽，包括a)含有兩個 或兩個以上被0-8個氨基酸殘基分隔開的瓜氨酸殘基的合成肽；b)含有衍生自含有兩個或 兩個以上被0-8個氨基酸殘基分隔開的瓜氨酸殘基的蛋白的氨基酸序列的合成肽，以及c) 含有下述通式的瓜氨酸殘基的肽[X(aa)nX]m，其中X =瓜氨酸殘基，aa =具有η = 0-8的氨基酸，m彡1。根據本發明的另一個方面，提供了一種檢測由具有風濕性關節炎風險或者患有風 濕性關節炎的患者表達的自身免疫抗體的方法，該檢測方法包括將本發明的合成肽與病人 的血漿或血清樣品接觸并檢測抗原_抗體復合物的存在的步驟，其中該復合物的存在表明 自身免疫抗體的存在，而其中自身免疫抗體的存在則表明該患者具有風濕性關節炎風險或 者患有風濕性關節炎。根據本發明的另一個方面，提供了一種以微陣列形式診斷風濕性關節炎的方法， 該方法包括以下步驟制備本發明的合成肽序列；提供用于診斷風濕性關節炎的生物樣 品；在允許與生物樣品中可能存在的風濕性關節炎特異性自身抗體形成抗原-抗體復合物 的條件下，將所述的生物樣品與所述的人工抗原接觸；以及檢測任何可能形成的抗原-抗 體復合物。附圖簡述
圖1是與本發明實施方式對應的9個闡述一系列綴合殘基的示例性肽序列的描 述，表明序列中瓜氨酸的數量和特異性位點以及瓜氨酸殘基之間的示例性間隔。圖2是表示本發明的6個示例性合成肽在風濕性關節炎和非風濕性關節炎患者血 清樣品中形成合成肽/自身抗體復合物存在的信號強度柱狀圖。圖3是表示在一系列梯度稀釋的多重抗原中檢測時與合成肽/抗體復合物的存在 直接成比例的信號強度的圖表。圖4是表示風濕性關節炎患者和非風濕性關節炎患者血清樣品中合成肽/抗體復 合物存在的信號強度比較的柱狀圖。圖5是描述本發明的示例性肽的表格。優選實施方式的描述風濕性關節炎是一種系統性自身免疫疾病，同時也被認為是最為常見的慢性炎癥 性風濕病。受影響的患者血清中含有自身抗體，其中的一部分特異性地構成該疾病的標識 物，從而使得對該疾病即使進行早期診斷也成為可能。已經發表了多種方法在研究中發現 并鑒別被這些抗體識別的抗原，以及可用于傳統免疫診斷技術的純化的抗原制劑。分析物_抗體的蛋白相互作用在信號傳導相關的分子事件控制中起到了關鍵性 作用。這些蛋白質-蛋白質界面上較大的表面輪廓使得小分子活性位點的設計和可及性 (accessibility)存在空間位阻問題。有效調節蛋白質-蛋白質界面的活性殘基使用蛋 白質表面上相對小的區域。正確選擇模擬表面表位的蛋白表位模擬(protein epitope mimetic,PEM)分子提供了一種在相對較小的、合成的、分子(水平)的、具有空間容納性的 三維大分子識別位點中模擬整個蛋白質活性的方法。肽模擬設計始于肽的三維結構和它們
5形成的偶聯模擬復合物，并需要了解其中殘基基質結構的類型和定位。這代表了根據基質 構象和結合機理確定設計方案并合成具有生物活性的有機分子基質的有機化學領域。因此需要能夠和自身抗體、特別是從患有風濕性關節炎的患者中檢測到的自身免 疫抗體以高度敏感性結合的合成肽，其能夠提高對癥狀發生前的患者以及表現出風濕性關 節炎癥狀的患者中的這些自身抗體進行檢測的特異性和敏感性。對于這種被風濕性關節 炎特異性自身免疫抗體識別的肽存在需求。此外還需要通過新的、多樣化設計的肽對于 抗_瓜氨酸化風濕性關節炎的自身抗體進行檢測，以提供更高的敏感性和特異性用于自身 抗體濃度更加準確的定量化相對測量。本發明的實施方式涉及合成肽模擬表位的合成。一個選擇為，有效抗原決定簇可 以被集中到包含這些決定簇的肽基質中；在一個線性排列中的毗鄰氨基酸序列(連續表 位)以及在折疊蛋白中非常近、而在非折疊時遙遠的氨基酸(非連續表位)的敏感性和特 異性形成了用于模擬免疫顯性抗原表位的肽基質。在某些實施方式中，表位可以是能夠引 起免疫反應的、位于抗原表面的一個集中區域。本發明的合成肽具有獨特序列，其在肽鏈上特定位點處含有多個瓜氨酸殘基，并 且也可以在瓜氨酸殘基間含有優選數量的殘基。令人驚奇的是，對所選氨基酸殘基的組合 和排序得到了優化的電荷和疏水性，提高了它與自身免疫抗體的反應性。在進一步的實施 方式中，所述各肽可以單體、二聚體、三聚體和多聚體的形式發生環化。在某些實施方式中， 設計的不同肽序列可以適用于風濕性關節炎的診斷。環化肽的方法是本領域眾所周知的。舉例來說，這樣的方法在Cline D. J. ,Thorpe C. ,Schneider J. P. General method for facile intramolecular disulfide formationin synthetic peptides, Analytical Biochemistry, 335 168-170 (2004)中有所描述,在此整 合到本發明中作為參考。二聚體和多聚體的構建方法也屬于本領域所熟知的技術。例如這些方法在Marini M. A. ,Moore G. L. ,Christensen S. M,Fishman R. M. , Jessee R. G. ,Medina F. , Snell S. Μ., Zegna, Α. I. Reexamination of the polymerization of pyridoxylatedhemoglobin with glutaraldehyde, Biopolymers 29:871-882(1990)中有所描述，在此整合到本發明中作為參考。本發明的具體實施方式
中，合成肽符合下述通式[乂(脅)』111，其中乂=瓜氨酸殘基，脅=具有11 = 0-8的氨基酸，111彡1。符合上述通式的示例性肽包括但不限于SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :33。圖1顯示了根據本發明的具體實施方式
的9個示例性肽。每個肽都被編號，而且 其中的瓜氨酸殘基都以字母X標注。一系列綴合的殘基顯示χ在序列中的特定位點重復出 現，而且各X之間有一定距離的間隔。肽SEQ ID NO 30,SEQID NO 19、SEQ ID NO 22,SEQ ID N0:28和SEQ ID NO :8各自的X-X之間的間隔分別是3、0、1-1和2個氨基酸，當它們以 約11的比例形式在肽混合物中被使用的時候會產生強自身抗體信號。在進一步的實施方式中，肽還可以進一步含有可選的殘基，例如那些帶有固有的 二硫鍵的，其能夠使這些肽發生環化，或者以分子間的方式連接從而使結構和化學穩定性 最大化。環化還具有為肽提供空間透視的額外優勢。本發明的另一個具體實施方式
是一種提供與風濕性關節炎自身抗體發生優化的
6抗原結合的組合物，該組合物包含以大約1 1的比例混合的肽SEQ ID NO 30, SEQ ID NO: 19、SEQ ID N0:22、SEQ ID NO 28 禾口 SEQ ID NO :23。這些合成抗原模擬肽設計時確保在瓜氨酸殘基的周邊插入一些柔性殘基，例如甘 氨酸、絲氨酸或者蘇氨酸，同時包含一些更小的殘基以保持肽的柔性。這樣的殘基包括甘氨 酸和絲氨酸，它們常用于包括單鏈抗體在內的蛋白結構域之間的接頭。這些肽應該包括可 溶性殘基，例如精氨酸、谷氨酰胺和亮氨酸來保持平衡的電荷和保持相對非中性的PH。令人 驚奇的是，當本發明實施方式的多重合成抗原模擬抗原用于微陣列檢測形式時，肽的環化 還改進了這些肽捕獲抗原的穩定性和它們固定在測試基質上的性能。本發明進一步具體實施方式
是以單體、二聚體、三聚體和多聚體形式存在的合成 肽的組合物。這些組合物有利于提高檢測效率。例如組合物中可以含有按照下列用氨基酸 單字符表示的單體的合成肽CKDNSDXSTYXWTRCK。二聚體的例子如下CKDNSDXSTYXWTRCK+ CKDNSDXSTYXffTRCK。三聚體的例子如下CKDNSDXSTYXWTRCK+CKDNSDXSTYXWTRCK+CKDNSDXST YXWTRCK。多聚體的例子如下[CKDNSDXSTYXWTRCK]+Xn。在進一步的實施方式，本發明的肽可作為組合物的組分與病人的液體樣品接觸來 檢測病人是否患有風濕性關節炎或者有患病傾向。組合物可以包括SEQID NO :1至SEQ ID NO :33中一種或以上的合成肽。例如組合物包含按照重量比大約1 1 3 3 3比例 混合的 SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO :30。總的來說，本發明的合成肽序列在組合物中都可以按照重量比大約1-3，優選重量 比大約1-1的比例進行混合。在某些具體實施方式
中，肽序列在組合物中的濃度可以是大約10mg/ml至大約 1 μ g/ml，優選濃度約為3mg/ml。—旦來自病人的血漿或者血清樣品與含有本發明合成肽的混合物接觸，其形成的 抗體/肽復合物就能夠按照本領域公知的方法檢測到。舉例來說，復合物可以被熒光標記， 然后測量熒光的強度。熒光水平將被直接按比例換算成結合到由風濕性關節炎引起的自身 免疫抗體上的合成肽的水平。本發明的具體實施方式
可以進一步通過下列實施例加以解釋和例證。材料和方法通過氧化肽鏈中的半胱氨酸殘基形成分子內二硫鍵環化肽。環化后，將肽通過戊 二醛促進的多聚化處理12-20小時進行綴合。然后通過與硼氫化鈉的反應除去多余的戊二 醛。然后將綴合的肽通過膜旋轉過濾柱加以純化。最后以分光光度法對純化后的肽定量。綴合肽既可以單獨制備，也可以混合在微陣列的點樣緩沖液中。得到的溶液通過 非接觸性微陣列點樣器點樣。產生的微陣列通過改變條件來優化點樣的肽并進行封閉。然 后檢測點樣后的微陣列對合成抗原模擬肽的反應性，特別是它們用微陣列檢測方式捕獲 抗_瓜氨酸化蛋白抗體的能力。測試中，將不含或者含有低、中、高含量的抗瓜氨酸化蛋白抗體的血清樣品上樣到 微陣列上并加入到微量滴定樣式的每個微陣列板的96個反應孔中。溫育30分鐘后，去除 過多的血清樣品，在洗板器上洗滌微陣列。隨后，加入帶有標記的抗人IgA、IgG和IgM抗體 并繼續溫育30分鐘。再進行一次洗板過程后干燥微陣列孔，并用微陣列讀取器進行熒光讀 數。
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在某些測試中，為了同時檢測抗風濕因子IgA、風濕因子IgG、風濕因子IgM和抗瓜 氨酸化蛋白抗體，除瓜氨酸化的肽外，每個孔里也會對風濕因子試劑進行點樣。對于所有檢 測，使用專用測試數據分析軟件整合每個點的強度，并且任選地，將信號標準化轉換為濃度值。MM檢測的單個肽按照上述方法準備六個合成肽，肽8B、8、10B、10、11B和11[SEQ ID NO 23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO 29 和 SEQ IDNO :30]，再使用 24 個樣品
對得到的微陣列板進行檢測。將每個樣品對于各個肽的響應進行分析并進行標繪。結果得 到每個樣品的熒光強度值相對于各樣品的標繪(圖)。如圖2所示，粗線表明切分閾值。津立多聚體混合物定量響應的測試由兩個樣品形成的混合池(mixed pool)用標注的稀釋因子進行稀釋，并用上述分 析方法進行檢測。結果得到每個樣品的熒光強度值相對于各樣品的標繪(圖)。觀察到從 最大稀釋度的樣品到最小稀釋度的樣品的響應的累進增強，如圖3所示。用CCP混合物對IH常和患者樣品小組的檢測將通過商業化ELISA試劑盒檢測正常的12個來自于健康志愿者的樣品和用若干 個ELISA試劑盒檢測確認的12個已知的風濕性關節炎患者的樣品用于檢測。結果得到每 個樣品的熒光強度值相對于各樣品的標繪(圖)。粗線表明用于區別樣品進入最終檢測結 果的切分閾值。如圖4所示，12個正常樣品的檢測結果都被發現為正常，12個樣品中的9 個顯示抗瓜氨酸化蛋白抗體陽性。雖然參考了如圖表所示的本發明實施方式的細節對本發明進行了描述，但是這些 細節并不意味著對如附加權利要求所述的本發明的范圍進行限制。
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權利要求
一種合成肽，其由選自下列的氨基酸序列構成SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ IDNO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32和SEQ ID NO33。
2.如權利要求1所述的合成肽，其中所述肽是環化的。
3.一種組合物，包括載體和由選自下列的氨基酸序列構成的肽SEQ IDNO=U SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO: 8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10, SEQ ID NO =IUSEQ ID NO : 12、SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO :15、SEQ IDNO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO 20,SEQID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO:33以及它們的組合。
4.如權利要求3所述的組合物，其中該組合物包括由下述氨基酸序列構成的肽SEQ ID N0:19、SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23、SEQ ID NO :28 禾口 SEQ ID NO :30。
5.如權利要求4所述的組合物，其中肽具有約為1 1 3 3 3的重量比。
6.如權利要求3所述的組合物，其中組合物包括如權利要求1中定義的任何氨基酸序 列的二聚體。
7.如權利要求3所述的組合物，其中組合物包括如權利要求1中定義的任何氨基酸序 列的三聚體。
8.如權利要求3所述的組合物，其中組合物包括如權利要求1中定義的任何氨基酸序 列的多聚體。
9.如權利要求3所述的組合物，其中所述肽是環化的。
10.一種組合物，包括由選自下列的氨基酸序列構成的至少兩個肽SEQID NO SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ IDNO 11, SEQ ID N0:12、SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO 14,SEQ ID NO 15,SEQID NO 16,SEQ ID NO :17、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO 19,SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID N0:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO :32 禾口 SEQ ID NO :33，其中所述的至少兩個肽是環化的。
11.一種檢測具有風濕性關節炎風險或患有風濕性關節炎的患者表達的自身免疫抗體 的方法，包括以下步驟將權利要求1所述合成肽與來自于患者的樣品接觸，檢測抗體_抗 原復合物的存在，其中所述抗體-抗原復合物的存在表明自身免疫抗體的存在。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述抗原-抗體復合物的存在表明所述患者具有 風濕性關節炎風險或患有風濕性關節炎。
13.如權利要求11所述的方法，其中所述來自于患者的樣品選自血漿和血清。
14.如權利要求11所述的方法，進一步包括對具有自身免疫抗體的合成肽的免疫反應 定量的步驟。
15.如權利要求14所述的方法，其中對至少三種免疫球蛋白定量。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述的至少三種免疫球蛋白是免疫球蛋白IgG、免 疫球蛋白IgA和免疫球蛋白IgM。
17.如權利要求15所述的方法，其中定量包括使用酶聯免疫吸附測定免疫化學 (ELISA)。
18.—種檢測具有風濕性關節炎風險或患有風濕性關節炎的患者表達的自身免疫抗體 的方法，包括以下步驟將權利要求3所述的組合物與來自于患者的樣品進行混合，檢測抗 體_抗原復合物的存在，其中該抗體_抗原復合物的存在表明自身免疫抗體的存在。
19.根據權利要求18的方法，其中組合物包括由下列氨基酸序列構成的肽SEQID N0:19、SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 23,SEQ ID NO 28 禾口 SEQ IDNO 30。
20.權利要求1的合成肽用于診斷患者風濕性關節炎的用途。
全文摘要
本發明的實施方式涉及一種選定的合成肽模擬序列的三維基質，所述的合成肽模擬序列優先被從患有風濕性關節炎的患者中檢測到的自身抗體、特別是自身免疫抗體所識別，所述合成肽模擬序列能夠提高對癥狀發生前的患者、表現出風濕性關節炎癥狀的患者以及確診為風濕性關節炎陽性的患者中的這些自身抗體進行檢測的特異性和敏感性。
文檔編號G01N33/564GK101918432SQ200880118998
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月3日 優先權日2007年12月3日
發明者M·凌, P·利 申請人:Sqi診斷系統公司