專利名稱：使用標記粒子測量流體中分子的方法
技術領域：
本發明涉及一種使用標記粒子測量流體中分子的濃度的改進方法。
背景技術：
生物感測，即確定待分析物中特異性分子的量，越來越受到關注。通常，待分析物 的量，具體而言，感興趣分子的量非常少。因此，要使用標記粒子，以便可視化這些分子。例 如，在WO 2005/010543A1和W02005/010542A2中描述了基于對存在于傳感器表面的超順磁 珠的磁檢測的生物傳感器。可是，如果存在感興趣的特異性分子，那么標記珠結合到所述傳 感器的表面。因此，所結合的標記珠的量與待分析物中特異性分子的量有關。這些標記粒子可以以溶液形式或以干燥形式提供。像免疫測定之類的實驗輸出強 烈依賴于與不同測定步驟(像抑制和/或結合)相關的標記粒子或磁珠的數目。例如，在 抑制步驟期間，或多或少的磁珠確實會影響測量(或多或少有一些抗體)的敏感度。另一 實例是在結合步驟期間或多或少的磁珠的作用，其理所當然會導致可能的結合的數目的增 加或減少。例如，可以使用具有很好的結合可能性的更少的磁珠實現端點信號(在抑制性 測定的情況下低靶粒子濃度)或使用具有較低結合可能性的(在抑制性測定的情況下 高靶粒子濃度)數目較高的磁珠。這說明當相關的磁珠濃度未知時，可以使用相似的值測 量信號，但依然具有不同的靶(粒子)濃度。然而，很難適當地控制存在的標記粒子的量以進行結合。例如，如果以干燥形式提 供粒子，那么在測定開始時可能并不是所有粒子都再分散。
發明內容
因此，本發明的目的是克服該缺點并提供一種用于測量待分析物或樣品液體中分 子濃度的改進方法。本發明是基于這樣的思想，即測量樣品體積或盒內存在或可獲得的標記粒子的實 際數目。這是通過至少兩次測量靠近傳感器表面的粒子的量來實現的在一次測量中，僅僅 檢測結合的粒子(正如通常所做的)。在第二測量中，檢測所有的粒子。因此，本發明提供一種用于測量樣品液體或待分析物中預定分子的濃度的方法。 所述方法包括向具有標記粒子的盒中添加樣品液體的步驟，其中，所述標記粒子適于捕獲 所述預定分子并結合到所述盒的傳感器表面上。然后，允許標記粒子與傳感器表面進行反 應并測量靠近傳感器表面的標記粒子的量。隨后，未結合到所述表面的標記粒子在“沖洗” 步驟中被去除，并且最終再次測量靠近傳感器表面的標記粒子的量。優選地，所述方法還包 括如下步驟處理測量步驟的結果以及計算所述樣品液體中預定分子的濃度。使用所述兩次測量的結果，人們可以計算結合的標記粒子和未結合的標記粒子的 量(以及標記粒子的總量)。這使得可以獲得對于這些實驗(例如，免疫測定)正確計算待 測分子濃度所必須的重要參數。所描述的方法可以應用于不同的已知技術以執行生物傳感。例如，可以通過受抑全內反射(FTIR)測量靠近傳感器表面的標記粒子的量。或者，通過使用磁阻傳感器測量標 記粒子的雜散磁場來測量靠近傳感器表面的標記粒子的量。然而，根據本發明的方法并不 局限于任意特定的感測技術或傳感器。所述傳感器可以是基于(磁性)粒子的任意性質檢 測在傳感器表面上或附件是否存在所述粒子的任意合適的傳感器，例如，它可以經由磁方 法(例如磁阻、霍爾、線圈)、光學方法(例如成像、熒光、化學發光、吸收、散射、漸逝場技術、 表面等離子體共振、拉曼等等)、聲學檢測(例如表面聲波、體聲波、懸臂、石英晶體、等等)、 電學檢測(例如導電性、阻抗、電流、氧化還原循環)，以及這些方法的組合等進行檢測。一般而言，標記粒子優選的是超順磁的。在那種情況下，可以通過磁致動而將標記 粒子朝向傳感器表面致動。此外，“沖洗”步驟，即從傳感器表面去除未結合的標記粒子也可 以通過使用磁場來實現。當然，通過重復對傳感器表面的若干特異性結合點處的粒子的量的測量步驟，本 發明可以普遍適用于大規模或陣列實驗。這也可以針對若干結合點同時完成。這些結合點 可以包含不同的結合或捕獲分子，以便在同一待分析物中執行大量不同的實驗。基于所述測定，如果正在捕獲待測分子，那么標記粒子可以僅結合到傳感器表面。 反之亦然，在抑制測定中，如果沒有正在捕獲的分子，那么標記粒子可以僅結合到傳感器表 面。一般而言，根據本發明的方法可以用于若干生化測定類型，例如結合/未結合測定、夾 心測定、競爭測定、變位測定、酶測定、等等。本發明的這些和其他方面將從下文描述的實施例中變得明顯，并且參考這些實施 例來對其進行闡述。
圖1示意性地示出了 FTIR的原理；圖2描繪出示出了根據本發明的測量結果的圖表。
具體實施例方式圖1示意性地示出了 FTIR的功能原理。在盒7中提供標記粒子2。所述盒7具 有傳感器表面1，其使用激光或LED 3a進行照射。光在傳感器表面1處被反射并通過檢測 器4a進行檢測，所述檢測器4a可以是(例如)光電二極管或CCD相機。選擇入射光的光 學路徑3，使得可以滿足全內反射的條件。在該情況下，生成具有IOOnm到IOOOnm的典型漸 逝衰減長度的漸逝光學場5。因此，只要標記粒子2充分靠近傳感器表面1，光在這些粒子 處被散射，如箭頭所指示的，并且漸逝場被干擾導致反射光強度的降低。一旦將(樣品)液體提供給傳感器表面1或提供給臨近所述傳感器表面1的(盒) 體積，之前已經以干燥形式提供的標記粒子2再分散到溶液中。一旦優選為超順磁的粒子2 被完全分散，可以利用磁體6使它們朝向傳感器表面1進行加速，其中，如果液體樣品中存 在待檢的特異性分子，那么這些粒子可以結合到所述表面。為此，可以在所述傳感器表面上 提供特異性結合部位。在進行結合的足夠時間后，在“沖洗”步驟中從傳感器表面1上去除 未結合的粒子。優選地，這是通過由第二磁體(未示出)所生成的磁場來實現的。在常規 FTIR測量中，結合到所述傳感器表面(或其結合部位)的粒子的量隨后在沖洗步驟之后進 行測量。由于傳感器表面上存在粒子，因此入射光3的一部分在傳感器表面處(具體而言，在結合的粒子處)被散射，從而導致檢測器4a處的反射光的強度降低。因而，對所述強度 降低進行測量允許估計結合的粒子的量。然而，根據本發明，執行沖洗之前的測量，并且將參考圖2進行描述。圖2描繪出示出了根據本發明的FTIR測量的輸出的圖表。其中，反射光的強度被 示為任意單位隨時間的變化。三條曲線對應于未結合(10)、中度結合(11)以及高度結合 (12)。所有的曲線在t = 0時，S卩，在測定開始時以100開始，此時在傳感器表面處不存在 粒子。因此，100的信號對應于沒有受到粒子的任何抑制的全內反射。隨后，通過磁體將粒子朝向傳感器表面吸引大約220秒。因此，粒子漸漸靠近傳感 器表面并且使得反射光的強度降低。以脈沖方式朝向所述表面吸引粒子，這樣通常，它們在 接通磁場期間被拉向所述表面，而在關閉所述磁場時，它們趨向于再次擴散到大的體積中。 因此，未結合的粒子在漸逝場中的平均駐留時間十分低，從而導致相當低的信號貢獻。然 而，粒子中的一些在接觸到所述表面時能夠進行結合，并且這些粒子仍留在所述表面上。這 些結合的粒子被固定在所述表面上，因此，它們持續與漸逝場作用，從而導致比未結合的粒 子有更高的信號貢獻。在本文所應用的漸逝波檢測的情況下，結合的粒子和未結合的粒子之間的信號差 十分高，這是因為漸逝場的檢測深度是如此之小(大約50-150nm)。粒子僅是輕微移入大體 積中已經使得它們對于FTIR傳感器不可見。當采用具有更大感測深度的其他傳感器原理 時，該效果不再那么明顯，并且未結合的粒子的信號貢獻將更加相似。在實驗的最初階段期間，在所述表面附近收集更多的粒子。這可以在傳感器信號 10中明顯地看出，其中沒有發生結合。在大約2分鐘之后，已經收集到了大多數粒子，并且 信號10保持平緩。對于其他的曲線11和12，粒子的收集過程與結合過程同時進行。信號 10和其他曲線之間的差別是由于結合的粒子的信號貢獻而導致的。因為在實驗的最初階段 期間在所述表面附近收集更多的粒子，所以結合過程的速度將開始增加。在大約2分鐘之 后，已經收集了所述表面附近的所有粒子，并且結合率相當恒定。可以明顯地看出，結合的 粒子的平均信號貢獻比來自未結合的粒子的信號貢獻高得相當多。在給粒子總夠時間以便結合到傳感器表面后，使用第二磁體以從傳感器表面去除 未結合的超順磁粒子。在圖2中，這發生在大約tA = 220秒時，從而導致反射光強度的陡 增，這是因為從傳感器表面去除了一些引起受抑全內反射的粒子。當去除所有未結合的粒 子后，曲線在時刻tB飽和。在沒有發生結合的情況下，如曲線10所示，所述信號明顯在初始值100處飽和 (10b)，這是因為所有通過磁場吸引到所述表面的粒子再次被磁場去除。然而，如果發生了 結合，如通過曲線11和12所指示的，那么初始值再次不能被滿足，這是因為在這種情況下， 吸引到所述表面的一些粒子結合、因而駐留在那里。結合的越多，tB時的最終信號越小。從tA和tB時的反射強度的信號中，人們分別獲得關于傳感器表面處的粒子x+y 的總數目以及結合的粒子y的數目的信息。必須考慮到，未結合粒子的信號貢獻比結合粒 子的信號貢獻低得多，這是因為相對于結合粒子而言，在所述傳感器的敏感區域中的未結 合粒子的平均駐留時間相當低。因此，必須考慮到校正因子，以補償該效果。因此，人們可以獲得在某一傳感器上的結合過程中參與的粒子的通常未知的數 目。一般而言，該數目依賴于溶解干燥粒子中的變化以及溶解的速度。對于變化的進一步原因是關于傳感器芯片的致動磁體的沒有對準和/或不均勻的磁場梯度。在抑制過程的情況下，人們對參與抑制過程的數目感興趣，即對樣品體積中粒子 的總數目感興趣。如果存在若干傳感器n，人們可以為每個傳感器i計算每個傳感器的粒子 數目Xi+yi，如以所述，然后加和這些數目，以便獲得在樣品體積中粒子的總數目X+Y :X+Y = XjyjXjyA-JXjy1^傳感器數目η越大，對粒子的總數目的估計將越精確。在不同傳感器上的粒子的數目的變化也可以產生對于每個傳感器的抑制的額外 校正因子。此時，我們假設小靶分子的擴散快到足以忽略該現象，但將來的實驗將顯示對該 假設的確認。即使當不需要額外的校正因子時，該空間粒子數目變化可以用作一種用于測 試的可靠性檢查。所有的測量可以用作一種用于測試的可靠性檢查。如果在某一傳感器上 的粒子總數目非常低，那么它將使得測試非常不可靠。當然，盡管本發明所描述的方法是參考FTIR傳感器描述的，其并不限于FTIR。所 述傳感器可以是基于粒子的任意性質檢測在傳感器表面上或附近是否存在磁性粒子的任 意合適的傳感器，例如，它可以經由磁方法(例如磁阻、霍爾、線圈)、光學方法(例如成像、 熒光、化學熒光、吸收、散射、漸逝場技術、表面等離子體共振、拉曼、等等)、聲學檢測(例如 表面聲波、體聲波、懸臂、石英晶體等等)、電學檢測(例如導電性、阻抗、電流、氧化還原循 環)，以及這些方法的組合等進行檢測。如果使用其他傳感器，那么可以針對特定實現執行某一測量。例如，在磁阻傳感器 的情況下，通常使用載流導線以便產生磁場，所述磁場在超順磁粒子中感生出雙極，這些雙 極場可以隨后使用磁阻傳感器進行測量。這些載流導線產生粒子的橫向高濃度。高濃度的 發生僅僅對于未結合的粒子而言的，這意味著所測量的未結合粒子的數目相對于結合粒子 而言太高。因此，將高濃度因子A添加到所述方法中，在沒有高濃度時所述高濃度因子A為 1。除分子測定之外，也可以檢測更大的分子，例如細胞、病毒、或細胞或病毒的片段、 組織提取物，等等。所述檢測可以在有或沒有關于傳感器表面掃描傳感器元件的情況下發 生。測量數據被導出作為端點測量，以及通過動力學地或間歇地記錄信號來導出。標記粒 子可以直接通過感測方法來進行檢測。以及，粒子可以在檢測之前進行進一步處理。進一 步處理的實例是添加材料或修改標記粒子的(生物)化學或物理性質以便有利于檢測。根 據本發明的方法可以用于若干生化測定類型，例如結合/未結合測定、夾心測定、競爭性測 定、變位測定、酶測定、等等。本發明的方法適于傳感器復用(即不同傳感器和傳感器表面 的并行使用)、標記復用(即不同類型標記的并行使用)以及室復用(即不同反應室的并行 使用)。本發明中所描述的方法可以用于針對小樣品體積的快速、魯棒、易于使用的床旁生 物傳感器。反應室可以是在緊湊型讀取器中使用的一次性部件，所述緊湊型讀取器包含一 個或多個磁場產生裝置以及一個或多個檢測裝置。同時，本發明的方法能夠用于自動高吞 吐量測試。在這種情況下，反應室例如是填充到自動儀器中的孔盤或小管。雖然在附圖和說明書中已經詳細舉例說明和描述了本發明，但是此舉例說明和描 述應當被理解為是舉例說明性和示例性的，而不應是限制性的；本發明并不限于所公開的 實施例。本領域技術人員在根據對附圖、說明書和權利要求書的研究來實踐所要求的發明 時能夠想到并實現所公開的實施例的其他變型。在權利要求書中，詞語“包括”并不排除其 他元件或步驟，并且不定冠詞“一”或“一個”并不排除多個。單一處理器可以實現權利要求書中記載的若干項的功能。起碼的事實是，在相互不同的權利要求中記載的特定手段并 不代表使用這些手段的組合不能帶來益處。權利要求中的任何附圖標記不能解釋為是對范 圍的限制。
權利要求
一種用于測量樣品液體中預定分子的濃度的方法，包括如下步驟a)向存在標記粒子的盒中添加所述樣品液體，使得所述標記粒子能夠與液體反應，其中，所述標記粒子適于捕獲所述預定分子并且適于結合到所述盒的傳感器表面上；b)允許所述標記粒子與所述傳感器表面進行反應；c)測量靠近所述傳感器表面的標記粒子的量；d)去除未結合到所述傳感器表面上的標記粒子；以及e)測量靠近所述傳感器表面的標記粒子的量。
2.如權利要求1所述的方法，還包括如下步驟處理步驟c)和e)的結果以及計算所 述樣品液體中所述預定分子的濃度。
3.如權利要求1或2所述的方法，還包括計算結合的標記粒子和未結合的標記粒子的 量的步驟。
4.如權利要求1或2所述的方法，其中，靠近所述傳感器表面的標記粒子的量是通過 FTIR測量的。
5.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述標記粒子是超順磁性的。
6.如權利要求5所述的方法，其中，步驟b)是通過所述標記粒子朝向所述傳感器表面 的磁致動進行加速的。
7.如權利要求5所述的方法，其中，靠近所述傳感器表面的標記粒子的量是通過使用 磁阻傳感器測量所述標記粒子的雜散磁場來測量的。
8.如權利要求5所述的方法，其中，未結合到所述表面的標記粒子是通過磁場來去除的。
9.如權利要求1或2所述的方法，其中，步驟c)是在所述傳感器表面的若干特異性結 合點處執行的，并且隨后，步驟e)是在所述傳感器表面的若干特異性結合點處執行的。
10.如權利要求1或2所述的方法，其中，步驟c)和e)分別在所述傳感器表面的若干 特異性結合點處同步進行。
11.如權利要求9或10所述的方法，還包括計算每個結合點的結合的標記粒子和未結 合的標記粒子的量的步驟。
12.如權利要求1或2所述的方法，其中，如果正在捕獲所述分子，那么所述標記粒子僅 結合到所述傳感器表面。
13.如權利要求1或2所述的方法，其中，如果沒有正在捕獲的分子，那么所述標記粒子 僅結合到所述傳感器表面。
全文摘要
本發明提供了一種用于測量樣品液體或待分析物中分子濃度的方法。所述方法包括在盒內用標記粒子混合所述液體的步驟，其中，所述標記粒子適于捕獲所述分子并且適于結合到所述盒的傳感器表面。然后，所述標記粒子沉積到所述傳感器表面上，并且測量靠近所述傳感器表面的標記粒子的量。隨后，在“沖洗”步驟中去除未結合到所述表面上的標記粒子，最后，再次測量靠近所述傳感器表面的標記粒子的量。
文檔編號G01N33/543GK101932937SQ200880118968
公開日2010年12月29日 申請日期2008年11月28日 優先權日2007年12月4日
發明者J·H·尼烏文赫伊斯, P·J·W·范蘭卡威爾特 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司