用于抗炭疽毒素的g免疫球蛋白的制作方法

專利名稱：用于抗炭疽毒素的g免疫球蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及針對細菌炭疸芽孢桿菌(Bacillus anthraCis)PA亞基(保護性抗原) 的靈長源化G免疫球蛋白。
現有技術炭疽是由革蘭氏陽性細菌炭疽芽孢桿菌引起的傳染病。該細菌是非運動性的，其 形成具有高度抗性的孢子，在例如人或動物血液或組織的環境中存在時萌發形成營養體 型。盡管非常具有抗性，所述孢子不復制，但是另一方面它們可在土壤中存活數十年。炭疽毒素介導的感染可以下列三種形式發生皮膚、肺或消化道。肺感染是最常 致命的。一旦吸入，炭疽芽孢桿菌孢子穿過肺泡，特別地，在那里它們被巨噬細胞和樹突狀 細胞所吞噬。在這些細胞中所述孢子萌發，營養體型在淋巴結中擴增。然后，細菌進入血液 循環，連續復制并產生毒素，部分地對該疾病的致命特性負責。炭疽毒素由三種不同的蛋白 質組成保護性抗原(PA，在細胞內酶切割之前為83kDa，切割后為63kDa)，致死因子(LF， 90kDa)和水腫因子(EF,89kDa)。致死毒素由PA和LF形成；水腫毒素由PA和EF形成，在 疾病病理中的作用較不顯著。這些蛋白質通過細菌作為無毒單體分泌，聚集在靶細胞表面上形成有毒復合物。到目前為止，已經使用多種抗生素比如青霉素、多西環素和氟喹啉酮類(例如環 丙沙星)治療炭疽感染。但是，這些抗生素中的一些可能對一些對抗生素有抗性的菌株無效。特別地，這些 治療中的一些可能不可用于對抗恐怖主義或者細菌戰爭，在這些情況下可故意傳播抗生素 抗性株。另外，因為抗生素不能抑制炭疽毒素作用，有必要將這些抗生素在感染的早期階 段施用，但是由于最初癥狀是非特異性的，所以很難建立早期診斷。已經開發出主要成分是保護性抗原PA的疫苗，但是僅用于強烈懷疑接觸過炭疽 芽孢桿菌的人。另外，由于獲得足夠的免疫性需要幾個月的時間，所以這些疫苗不能用于緊 急情況。目前在法國，這些疫苗中沒有一種被批準用于人體。因此，需要開發不同于抗生素 的新的治療和預防方法。通過抗體的被動免疫是中和所述毒素的有效策略。已經進行了一些努力來使用針 對保護性抗原(PA)和致死因子(LF)的單克隆抗體中和炭疽致死毒素。通過使用抗體中和 炭疽致死毒素，例如可通過抑制PA與其細胞受體的結合、通過抑制PA切割、通過抑制PA與 LF的結合或者通過抑制LF作用來實現。因此，開發能夠中和炭疽毒素的新型抗體以預防和有效治療炭疽受到普遍關注。在最近的工作中，已經用保護性抗原PA83免疫短尾猴，獲得用于治療炭疽毒素介 導的人感染的抗體。本發明人從骨髓擴增了編碼PA83-特異抗體片段的基因，并對其克隆 以構建文庫。已經分離出稱為35PA83的高親和性(Kd = 3. 4nM)和強中和的片段(50%抑制濃5. 6+/~0. 13nM) (Laffly ^Α antimicrobial agents andchemotherapy, 2005,49 (8) 3414-3420)。免疫球蛋白片段35PA83通過抑制PA與其細胞受體的任何相互作用來中和炭疽毒但是，在準備用于將此免疫球蛋白片段用于醫學(預防或治療)用途時，改善其親 和性可有利地降低施用給患者的量以及治療費用。另一方面，因為該免疫球蛋白片段的猿 來源，其可帶來免疫原性的風險以及人生物利用率的變化。

發明內容
因此，本發明的一個目的是提供獲得自所述免疫球蛋白片段35PA83的針對抗原 PA的IgGl或IgG2同種型的完全免疫球蛋白，其經過預先修飾使得對抗原的親和性提高，并 具有與人抗體更大的相似性。因此，本發明的一個目的是提供針對炭疽毒素的保護性抗原(PA)的G類免疫球蛋 白(IgG)，其包含抗體35PA83的可變區，其已突變了少數殘基，以及一些人來源的恒定區。本發明的另一個目的是提供編碼本發明IgG的核酸，以及包含這些核酸的載體和 含有該載體的宿主細胞。本發明的另一個目的是提供包含本發明IgG的組合物以及包含所述IgG的藥物組 合物。本發明的另一個目的是提供本發明的IgG在制備用于治療或預防炭疽芽孢桿菌 感染的藥物中的用途。本發明還涉及炭疸毒素檢測試劑盒，體外檢測炭疽毒素的方法，以及含有本發明 IgG的免疫綴合物。發明詳述因此本發明的一個目的是提供針對炭疽毒素的保護性抗原(PA)的G類免疫球蛋 白(IgG)，其包含-輕鏈可變區，其包含與序列SEQID NO=I有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序 列，和-重鏈可變區，其包含與SEQID NO :2有至少90%氨基酸同一性的氨基酸序列，并 且包含分別對應于25位絲氨酸殘基、54位賴氨酸殘基和60位精氨酸殘基的氨基酸殘基，其 特征在于由IgGl或IgG2組成。根據本發明，具有與參考的第二核酸至少90%同一性的第一核酸將具有與所述參 考的第二核酸至少 90%、優選至少 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,97. 5%,98%, 98. 3%,98. 6%,99%,99. 6%的核苷酸同一性。根據本發明，具有與參考的第二多肽至少90%同一性的第一多肽將具有與所述參 考的第二多肽至少 90%、優選至少 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,97. 5%,98%, 98. 3%,98. 6%,99%,99. 6%的氨基酸同一性。由通過比較窗口比較兩個最佳比對序列來確定如本文使用的兩個核酸序列或兩 個多肽序列之間的“同一性百分比”。因此，所述比較窗口中核苷酸或氨基酸序列的部分可包含相比于參考序列(其不
5包含這些添加或缺失)的添加或缺失(例如“缺口”)，從而獲得兩個序列之間的最佳比對。通過下述步驟來計算同一性百分比確定相同的核酸堿基或相同氨基酸殘基位置 的數目，其可標注于兩個比較的序列，然后將觀察到兩者的核酸堿基或兩者的氨基酸殘基 之間相同的位置的數目除以比較窗口中位置的總數，之后將結果乘以100，獲得兩個序列之 間核苷酸同一性的百分比或者兩個序列之間氨基酸同一性的百分比。可通過計算機使用已知算法來進行所述序列最佳比對的比較。最優選地，使用CLUSTALW軟件(1. 82版)確定序列同一性百分比，其參數設 置如下(I)CPU MODE = Clustalff mp ； (2)ALIGNMENT = “ full “ ； (3)OUTPUT FORMAT =〃 aln w/numbers“ ； (4)OUTPUT ORDER = " aligned" ； (5)COLOR ALIGNMENT = " no"； (6)KTUP(word size) = “ default “ ； (7)WINDOW LENGTH = “ default “ ； (8)SCORE TYPE = “ percent “ ； (9)T0PDIAG = “ default “ ； (lO)PAIRGAP = “ default “ ； (11) PHYL0GENETIC TREE/TREE TYPE=" none" ； (12) MATRIX = 〃 default" ； (13) GAP OPEN ="default" ； (14) END GAPS = " default" ； (15) GAP EXTENSION = " default"； (16) GAP DISTANCES=" default" ； (17) TREE TYPE=" cladogram 〃禾口(18)TREE GRAP DISTANCES=" hide"。關于本發明抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區上突變的注釋，以及更一般性地補充 本發明抗體一些實施方案的說明，本領域技術人員可查閱2007年9月26日提交的法國專 利申請No. FR 07/06744 “用于抗炭疽毒素的抗體”的說明書，其內容附在本說明書的最后， 從48頁至75頁。序列SEQ ID NO 2的25位絲氨酸殘基的存在對應于圖11的“35H”部分上標記為 “31A”的突變，在那里此突變也可稱為“G/S(31A) ”。序列SEQ ID NO 2的54位賴氨酸殘基的存在對應于圖11的“35H”部分上突變 “66”，在那里此突變也可稱為“R/K(66) ”。序列SEQ ID NO 2的60位精氨酸殘基的存在對應于可稱為“K/R(73) ”的突變，并 對應于圖11的“35H”部分上73位精氨酸殘基。根據本發明，“對應于”25位絲氨酸殘基、54位賴氨酸殘基和60位精氨酸殘基的殘 基組成上文所述的殘基，以及(i)其位于與序列SEQ ID NO 2具有至少90%同一性的序列中的相同位置，或(ii)其位于不同的位置，例如由于相比于作為參考的序列SEQ IDNO :2，與序列 SEQ ID NO :2具有90%同一性的序列包含一個或多個氨基酸缺失或添加。本發明的另一個目的是提供如上文定義的G類免疫球蛋白(IgG)，其特征在于含 有-具有序列SEQID NO 1所示氨基酸序列的輕鏈可變區，和
-具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重鏈可變區。已經通過用炭疽的保護性抗原PA83免疫短尾猴獲得由Fd片段的輕鏈構成的免疫 球蛋白片段35PA83，如Laffly等人(2005)所述。可通過本領域技術人員已知的常規方法測定抗體的親和性“K/。親本非修飾抗體(即非突變的)35PA83具有3. 4 10_9M的親和KD。已經從通過表 面等離振子共振實時測量的結合和解離常數計算得到此親和常數，如實施例中所述。
本發明IgG的輕鏈可變區(SEQ ID NO 1)來自于免疫球蛋白片段35PA83的輕鏈 可變區，其序列可獲得自計算機數據庫，如Genbank，登錄號為CAH17921和AJ810487。有利地，具有序列SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的本發明IgG的輕鏈可變區另外 包含至少一個選自下列的突變-無/A(I)-無/I (2)-無/Q(3)-無/L(4)-Y/S(14)-K/R(18)-H/R(24)-L/V(124)。突變無/A(I)表示氨基酸“Α”添加在圖11 “35L”部分的序列1位處，以及序列 SEQ ID NO :1的-4位處，即如果存在的話殘基N°-3緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°-2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基N°-l緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°1緊接著的上游。突變無/I⑵表示氨基酸“I”添加在圖11 “35L”部分的序列的2位處，以及序列 SEQ ID NO :1的-3位處，即如果存在的話殘基N°-2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基 N0-I緊接著的上游，或者如果不存在的話殘基N°1緊接著的上游。突變無/Q(3)表示氨基酸“Q”添加在圖11 “35L”部分的序列3位處，以及序列 SEQ ID NO :1的-2位處，S卩如果存在的話殘基N°-l緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°1緊接著的上游。突變無/L(4)表示氨基酸“L”添加在圖11 “35L”部分的序列4位處，以及序列 SEQ ID NO 1的-1位處，即殘基N°1緊接著的上游。突變Y/S(14)表示位于圖11 “35L”部分的序列14位以及序列SEQ IDNO :1的10
位的氨基酸"Y"替換為氨基酸“S”。突變K/R(18)表示位于圖11 “35L”部分的序列18位以及序列SEQ IDNO :1的14 位的氨基酸"K"替換為氨基酸“R”。突變H/R(24)表示位于圖11 “35L”部分的序列24位以及序列SEQ IDNO :1的20 位的氨基酸"H"替換為氨基酸“R”。突變L/V(124)表示位于圖11 “35L”部分的序列124位以及序列SEQ IDNO 1的 100位的氨基酸"L"替換為氨基酸“V”。優選地，添加這些突變中至少一個能夠使得相比于其所來源的片段35PA83降低 本發明IgG輕鏈可變區的免疫原性。特別有利地，具有序列SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的本發明IgG的輕鏈可變區 包含下列的突變-無/A(I)-無/I (2)-無/Q(3)
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-無/L (4)。特別有利地，具有序列SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的本發明IgG的輕鏈可變區 包含下列的突變-無/A(I)-無/I(2)-無/Q(3)-無/L(4)-Y/S(14)-K/R(18)-H/R(24)-L/V(124)。優選地，添加這些殘基能夠使得相比于其所來源的片段35PA83降低本發明IgG輕 鏈可變區的免疫原性。本發明IgG的重鏈可變區(SEQ ID NO 2)來自于免疫球蛋白片段35PA83的Fd 片段的可變區，其序列已在計算機數據庫中登記，如Genbank，可通過登錄號CAH17920和 AJ810486 獲取。有利地，具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重鏈可變區另外包含至少一個 選自下列的突變-無/Q(I)-無/V ⑵-無/Q(3)-無/L(4)-無/Q(5)-無/E (6)-L/V(12)-Α/Τ (24)-Α/Τ (122)-V/L(123) ο突變無/Q⑴表示氨基酸“Q”添加在圖11上“35H”部分的序列1位處，以及序列 SEQ ID NO :2的-6位處，S卩如果存在的話殘基N°-5緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°-4緊接著的上游，或者如果不存在的話殘基N°-3緊接著的上游，或者如果不存在的話 殘基N°-2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基N°-l緊接著的上游，或者如果不存在的話 殘基N°1緊接著的上游。突變無/V⑵表示氨基酸“V”添加在圖11上“35H”部分的序列2位處，以及序列 SEQ ID NO :2的-5位處，S卩如果存在的話殘基N°-4緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°-3緊接著的上游，或者如果不存的話殘基N°-2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基 N0-I緊接著的上游，或者如果不存在的話殘基N°1緊接著的上游。突變無/Q(3)表示氨基酸“Q”添加在圖11上“35H”部分的序列3位處，以及序列 SEQ ID NO :2的-4位處，S卩如果存在的話殘基N°-3緊接著的上游，或者如果不存在的話殘基N°_2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基N°_l緊接著的上游，或者如果不存在的話殘 基N°1緊接著的上游。突變無/L(4)表示氨基酸“L”添加在圖11上“35H”部分的序列4位處，以及序列 SEQ ID NO :2的-3位處，S卩如果存在的話殘基N°-2緊接著的上游，或者如果不存的話殘基 N0-I緊接著的上游，或者如果不存在的話殘基N°1緊接著的上游。突變無/Q (5)表示氨基酸“Q”添加在圖11上“35H”部分的序列的5位處，以及序 列SEQ ID NO :2的-2位處，S卩如果存在的話殘基N°-l緊接著的上游，或者如果不存在的話 殘基N°1緊接著的上游。突變無/E(6)表示氨基酸“Ε”添加在圖11上“35Η”部分的序列的6位處，以及序 列SEQ ID NO 2的-1位處，即殘基N0I緊接著的上游。突變L/V(12)表示位于圖11上“35H”部分的序列的12位處以及序列SEQ ID NO 2的5位處的氨基酸"L"替換為氨基酸V。突變A/T(24)表示位于圖11上“35H”部分的序列的14位處以及序列SEQ ID NO 2的17位處的氨基酸"A"替換為氨基酸T。突變A/T(122)表示位于圖11上“35H”部分的序列的122位處以及序列SEQ ID NO :2的113位處的氨基酸〃 A"替換為氨基酸T。突變V/L的(123)表示位于圖11上“35H”部分的序列的123位處以及序列SEQ ID NO 2的114位處的氨基酸〃 V"替換為氨基酸L。優選地，添加這些突變中至少一個能夠使得相比于其所來源的片段35PA83降低 本發明IgG重鏈可變區的免疫原性。本發明IgG的重鏈可變區(SEQ ID NO 2)來自于免疫球蛋白片段35PA83的Fd 片段的可變區，其序列已經在計算機數據庫中登記，如Genbank，可通過登錄號CAH17920和 AJ810486獲取。與免疫球蛋白片段35PA83的可變區相比，本發明的重鏈可變區(SEQ ID NO 2)經過修飾，因為其包含三個下列突變:G/S(31A)、R/K(66)和K/R(73)。有利地，相比 于免疫球蛋白片段35PA83可變區，這三個突變使得能夠改善根據本發明IgG重鏈可變區的 親和性。特別有利地，具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重鏈可變區另外包含下列 的突變-無/Q(I)-無/V ⑵-無/Q(3)-無/L(4)-無/Q(5)-無/E(6)。特別有利地，具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重鏈可變區另外包含下列 的突變-無/Q(I)-無/V ⑵-無/Q(3)
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-無/L(4)-無/Q(5)-無/E(6)-L/V(12)-Α/Τ (24)-Α/Τ (122)-V/L(123) ο優選地，添加這些突變中至少一個能夠使得相比于其所來源的片段35PA83降低 本發明IgG輕鏈可變區的免疫原性。在本發明的一個特定實施方案中，所述抗體的輕鏈可變區(SEQ IDNO=I)包含下 列突變-無/A(I)-無/I(2)-無/Q(3)-無/L(4)，以及，所述抗體的重鏈可變區(SEQ ID NO 2)包含下列突變-無/Q(I)-無/V ⑵-無/Q(3)-無/L(4)-無/Q(5)-無/E(6)。有利地，本發明IgG的輕鏈恒定區包含包含序列SEQ ID NO 3的氨基酸序列，重鏈 恒定區包含包含序列SEQ ID NO 4的氨基酸序列。出于說明本發明的目的，術語“免疫球蛋白”旨在表示具有特異性結合特定抗原能 力的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子片段。公知的免疫球蛋白片段為例如F(ab' )2、 Fab、Fv、scFv 禾口 Fd 片段。G型免疫球蛋白(IgG)是由通過二硫鍵彼此結合的2條重鏈和2條輕鏈組成的異 二聚體。每個鏈由N端位置的所述免疫球蛋白針對的抗原特異性的可變區或結構域(輕鏈 由重排的基因V-J編碼，重鏈由V-D-J編碼)以及C端位置的恒定區構成，所述恒定區對輕 鏈來說由單個結構域CL或者對重鏈來說由三個結構域(CHpCH2和CH3)組成。重鏈和輕鏈 的可變結構域以及CH1和CL結構域的相互作用形成Fab部分，其通過非常柔性的鉸鏈區與 Fc區域連接，使得每個Fab結合其抗原靶標，同時介導所述抗體效應子性質的Fc區域保持 可接近免疫效應子、吞噬細胞或殺傷細胞以及補體；這些恒定區不參與抗原的結合。由2個 球形結構域CH2和CH3構成的Fc區域在CH2結構域上糖基化，在兩條鏈的每一條上存在結 合于Asn 297的乳糖胺類型的雙天線N-聚糖。關于可變區，其涉及所述抗體與其表位的結合。恒定區(Fe)已經過酶促切割使得從其中保留絞鏈區的抗體稱為F(ab' )2片段， 其保留兩個抗原結合位點。
類似地，其恒定區的絞鏈區已經過酶促切割或者產生沒有該區域的恒定區的抗體 稱為Fab片段，其保留兩個抗原結合位點中的一個。Fd片段由VH和CH1區域形成。決定互補性的區域(⑶R，互補決定區)位于可變區中，也稱為高變區，其直接與抗 原相互作用。對CDR進行修飾使得有可能修飾抗體的親和性。位于可變區中的第二種類 型區域稱為構架區(FR)，其保留CDR的三級結構。這些構架區對抗體來源的物種來說是相 對特異性的。有四個構架區(FRl至FR4)位于在重鏈和輕鏈的Fd片段中，其分別由三個 CDR(CDR1 至 CDR3)所隔開。根據上文對本發明抗PA IgG的重鏈可變區和輕鏈可變區氨基酸的描述，本領域技 術人員能夠合成或使得合成編碼這些氨基酸序列的核酸。有利地，本發明IgG的每個輕鏈和重鏈的恒定區是人恒定區。優選地，本發明IgG每個輕鏈的恒定區是κ類型。任何同種異型可適用于實施本 發明，例如Km(1)、Km(1，2)、Km(1，2，3)或Km(3)，盡管優選的同種異型是Km(3)。每個抗體重鏈的恒定區可以是Yl型、Y 2型或Y 3型，這三種類型的恒定區具有 附著人補體的特征，或者Y 4型。優選地，每個抗體重鏈的恒定區是Yl型，因為此類抗體能夠在最大量的個體 (人)中誘導ADCC活性。在這方面，任何同種異型可適用于實施本發明，例如Glm(3)、 Glm(l，2，17)、Glm(l，17)或 Glm(l，3)。優選地，同種異型是 Glm(l，17)。有利地，本發明IgG的每個重鏈恒定區是Y 1型，包含SEQ ID NO 4的氨基酸序 列，本發明IgG的每個輕鏈恒定區包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列。有利地，本發明的IgG的每個輕鏈包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列，本發明IgG的 每個重鏈包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列。本發明的另一個目的是提供編碼本發明IgG的核酸。本發明IgG的每個輕鏈可變區由核酸序列SEQ ID NO 7編碼，根據本發明的每個 抗體重鏈的可變區由小鼠核酸序列SEQ ID NO 8編碼。在本發明的一個特定方面，本發明IgG的每個重鏈恒定區由人核酸序列SEQ ID NO :9編碼，其每個輕鏈恒定區由人核酸序列SEQ ID N0:10編碼。更特定地，根據本發明的每個抗體輕鏈由核酸序列SEQ ID NO 11編碼，每個重鏈 由核酸序列SEQ ID NO 12編碼。本發明的另一個目的是提供包含編碼本發明IgG的核酸的載體。本文使用的“載體”表示可通過限制性酶切然后連接插入目的序列的核酸，其用于 轉移到多種遺傳環境及其中或者用于在宿主細胞中表達。載體例如是質粒、粘粒、酵母人工 染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)和來源于噬菌體Pl的人工染色體(PAC)、病毒來源的 載體。克隆載體是能夠在宿主細胞中復制的載體，其另外的特征在于存在一個或多個核酸 內切酶限制性位點。表達載體是其中通過限制性酶切或連接的方法插入了目的DNA序列使 得能夠復制和/或轉錄成RNA的載體。所述載體可另外含有一個或多個標志物，用以選擇 或鑒定已經被所述載體轉化或轉染的細胞。這些核酸可引入到重組載體中，用以克隆或表達本發明的抗體。本發明包括所有用于真核或原核細胞轉化、轉染或基因治療的含編碼序列的重組載體。根據分子生物學的常規方法制備這些載體，其還包含合適的啟動子，任選地用于輸出 或分泌的信號序列以及所述核苷酸序列轉錄所需的調節序列。純化本發明抗體可能需要融合多肽。所述融合結構域可包含例如多組氨酸尾，其 使得能夠在M2+柱上純化或者絲狀噬菌體膜錨，其特別可用于根據稱為“噬菌體展示”的技 術篩選文庫。適用于本發明背景的載體有適于接受和表達第一和第二 DNA序列的重組DNA分 子，使得能夠表達異二聚化抗體，例如根據本發明的全長抗體或F(ab' )2或Fab片段。這 些載體提供了在載體中所存在的兩個分開的盒中獨立克隆兩種DNA序列的系統，使得形成 表達所述異二聚體抗體的第一和第二多肽的兩個分離的順反子。這些表達載體稱為雙順反 子載體。本發明的經修飾抗體可在真核細胞比如CHO細胞或者人或小鼠雜交瘤細胞例如 以及轉基因植物和動物細胞中產生。本發明的另一個目的是提供原核或真核的宿主細胞，其包含根據本發明的載體。有利地，本發明表達載體使得能夠表達本發明IgG的輕鏈。在此特定實施方案中， 所述載體是核酸分子，其中插入了編碼每個IgG輕鏈的可變區的核酸序列SEQ ID N0:7以 及編碼每個抗體輕鏈的恒定區的核酸序列SEQ ID NO :10，從而將它們引入宿主細胞并保持 于其中。其使得能夠在宿主細胞中表達這些核酸外源片段，因為其具有此表達所需的序列 (啟動子、多腺苷化序列、選擇基因)。這些載體是本領域技術人員公知的，可以是腺病毒、 逆轉錄病毒、質粒或噬菌體，此列表是非限制性的。另外，任何哺乳動物細胞可用作宿主細 胞，也就是說表達本發明IgG輕鏈的表達載體所攜帶的核酸片段的細胞，例如YB2/0、CH0、 CHO dhfr-(例如 CHO DXBl 1、CHO DG44)、CHO Lecl3、SP2/0、NS0、293、BHK 或 COS。有利地，本發明的表達載體使得能夠表達本發明IgG的重鏈。在此特定實施方案 中，所述載體是使得能夠表達本發明IgG的分子，其重鏈由核酸序列SEQ ID N0:12所編 碼。此載體是核酸分子，其中已經插入編碼每個IgG重鏈的可變區的核酸序列SEQ ID NO 8以及編碼每個抗體重鏈的恒定區的核酸序列SEQ ID NO :9，使得將它們引入宿主細胞并 將其保持在那里。其使得能夠在宿主細胞中表達這些核酸外源片段，因為其具有此表達所 需的序列(啟動子、多腺苷化序列、選擇基因)。如上所述，所述載體可以是例如質粒、腺 病毒、逆轉錄病毒或噬菌體，并且宿主細胞可以是任何哺乳動物細胞，例如YB2/0、CHO、CHO dhfr- (CHO DX Bll、CH0DG44)、CHO Lecl3、SP2/0、NS0、293、BHK 或 COS。本發明的載體可包含編碼本發明免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈的序列。實現本發明IgG重鏈和輕鏈表達的載體實例在實施例2中給出。此載體是含有針 對本發明IgG的重鏈和輕鏈的兩個轉錄單元的獨特載體。本發明的另一個目的是提供包含例如如上所述定義的載體的宿主細胞。有利地，本發明宿主細胞選自SP2/0，YB2/0, IR983F，Namalwa人骨髓瘤， PERC6, CHO 細胞系，特別是 CH0-K-1，CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec 13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, ffil-2, Jurkat, Vero, Molt-4，C0S-7，293-ΗΕΚ，BHK, Κ6Η6, NSO, SP2/0_Ag 14 和 P3X63Ag8. 653。在一個優選實施方案中，在YB2/0大鼠雜交瘤(YB2/3HL.P2.G11. 16Ag. 20細胞，其 以登錄號ATCC CRL-1662提交于美國典型培養物保藏中心)中產生所述抗體。選擇該細胞系是因為其能夠產生具有ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)活性的抗體，其相比于 在例如CHO細胞中獲得的類似一級結構的抗體有改善。在本發明的一個特定方面，表達本發明抗體的穩定細胞系，更特別地選自上述的 那些群體，整合了例如上述的重鏈和輕鏈的表達載體之一或之二。本發明的另一個目的是提供包含至少一種本發明IgG的組合物。本發明的另一個目的是提供包含至少一種本發明IgG的藥物組合物。所述藥物組合物優選地包含可藥用載體。本文使用的這些載體旨在表示不干擾所 述組合物活性組分生物活性效力的無毒材料。表述“可藥用”指與生物學體系例如細胞、細 胞培養物、組織或有機體相容的無毒材料。所述載體的特征依賴于施用方法。本發明涉及至少一種本發明的IgG在制備用于治療或預防炭疽芽孢桿菌感染的 藥物組合物或藥物中的用途。本文使用的術語“預防”意為在個體特別是人中疾病尚未出現之前防止所述疾病 的發生。本文使用的術語“治療”對應于對該疾病的抑制，即停止其發展、消退、或者疾病的 癥狀和后果消失、或者疾病的原因消失。可標記本發明的IgG。合適標志物的例子包括酶、放射性同位素、熒光化合物、膠體 金屬、化學發光化合物和生物發光化合物。標志物與抗體的結合方法是本領域技術人員公知的。另一種標記方法為將所述抗體與低分子量半抗原偶聯，所述半抗原可通過第二反 應進行具體修飾。合適半抗原的例子包括生物素，其與親和素反應，或者二硝基酚、吡哆醛 或熒光素，其與抗半抗原特異性抗體反應。本發明的一個目的是提供含PA炭疽毒素檢測試劑盒。該試劑盒包含-包含至少一種本發明抗PAIgG的容器，該抗體帶有標記或未帶標記，-任選地，包含緩沖溶液的容器，-和任選地包含帶標記IgG檢測工具的容器，例如與報告分子如熒光或酶標記物 相結合的生物素-結合蛋白，如親和素或鏈霉親和素。此容器還可包含非標記的IgG檢測 工具，即基本上的抗體或抗體片段。本發明的IgG可用于體外，例如在免疫學測定中，其中它們在液相中或者固定于 固相載體上使用。公知載體的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖、尼龍、淀粉 酶、天然或改性纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖或磁鐵。使用本發明抗PA IgG的免疫學測定的 實例有放射性免疫測定、組織免疫學標記技術、ELISA、蛋白質印跡、免疫沉淀測定、免疫擴 散測定、補體固定測定、熒光激活細胞分選測定(Fluorescence-activatedCell Sorting, FACS)或者蛋白質芯片分析。本發明的另一個目的是提供用于體外檢測生物樣品中含PA炭疽毒素的方法，其 包括下列步驟-將所述樣品與包含至少一種本發明抗PAIgG相接觸，和-檢測所述抗體的結合，作為所述炭疽毒素的存在的指示。生物樣品可以是液體例如唾液、尿、腦脊液、血清或血液，或者固體或半固體，例 如組織或糞便或實體組織例如常規用于組織學診斷的。
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本發明的另一個目的是提供用于體內檢測含PA炭疽毒素的方法，其中向個體施 用帶標記的本發明IgG。帶標記IgG的施用量應足以使得所述抗體結合待檢測的毒素。帶 標記IgG的施用量取決于一些因素，例如個體的年齡和性別，以及疾病的階段。所述施用量 可以為 0. 01mg/kg 至 50mg/kg 不等，優選 0. lmg/kg 至 20mg/kg，更優選 0. lmg/kg 至 2mg/kg。為了實施體內診斷，本發明經修飾的抗PA IgG應直接或通過官能團間接與放射性 同位素相連。通常使用的官能團包括例如二亞乙基-三胺-五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙 酸(EDTA)。放射性同位素金屬離子的例子包括mIn，97Ru, 67Ga, 68Ga, 72As,89&和2Q1T1。為了使用磁共振成像(MRI)或者通過電子自旋共振(ESR)進行診斷，經修飾的本 發明抗PA IgG也可用順磁同位素標記。還可使用發射正電子的Y放射性同位素，例如 157Gd, 55Mn, 162Dy, 68Ga, 52Cr 和 56Fe0本發明的IgG也可用于體外或體內監測疾病治療的發展，例如通過確定炭疽毒素 靶向的細胞數增加或減少，或者生物樣品中PA毒素濃度的變化。本發明的一個目的是提供治療可能被炭疽芽孢桿菌感染的個體、優選人的方法， 其中向所述個體施用治療有效量的根據本發明修飾的抗PA抗體。本文使用的表述“治療有效量”旨在表示在施用給需要治療的個體時足以實施該 治療的量。治療有效量取決于個體、所治療疾病的階段以及施用方法，其由本領域技術人員 通過常規程序確定。本文使用的術語“炭疽，，旨在表示任何由炭疽芽孢桿菌感染直接地或間接地造成 的疾病。吸入感染的最初癥狀與鼻炎類似(發燒、肌肉痛)。數天后，這些癥狀發展為呼吸 困難和膿毒性休克的嚴重問題。吸入炭疽細菌通常是致命的。在細菌通過之前存在的皮膚間隙穿透皮膚時，發生炭疽皮膚感染。此感染最初導 致形成丘疹，其在兩到三天內發展成小泡，之后發展為1至3厘米直徑的潰瘍，中心有壞死 區域。炭疽腸胃傳染是由攝入受污染的肉引起的，其特征在于腸道急性炎癥。治療有效量對應于足以減輕少疾病癥狀和感染發展的量。該量根據個體的年齡和 性別以及疾病階段而不同，由本領域技術人員所決定。治療有效量可以是每天一劑或多劑 中 0. 0lmg/kg 至 50mg/kg 不等，優選 0. lmg/kg 至 20mg/kg,更優選 0. lmg/kg 至 2mg/kg,持 續一天或更長。施用方法可以是注射或逐漸輸注。注射可以是靜脈內、腹膜內、肌內、皮下或者透 皮類型。用于胃腸外施用的制劑可包含無菌水溶液或非水溶液、混懸液或乳劑。非水溶劑 的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖或者可注射有機酯例如油酸乙酯。水載體包 括水、醇/水溶液、乳劑或混懸液。本發明的另一個目的是提供免疫綴合物，其包含與治療劑直接或間接相結合的本 發明IgG。這些治療劑包括化學劑、放射性核素、免疫治療劑、細胞因子、趨化因子、毒素或酶 抑制劑。毒素的例子有白喉毒素A鏈、外毒素A鏈、篦麻毒蛋白A鏈、紅豆堿A鏈、蒴蓮根 毒蛋白A鏈、α-帚曲毒素、Aleurite fordii蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白、石堿草(sapaonaria officinalis)抑制劑、多花白樹毒蛋白、mitogelline、局限曲菌素(restrictocine)、酚霉
14素(phenomycine)、enomycine 禾口 tricothecenes。放射性核素的例子包括 212Bi, 1311，131In, 90Y 和 186Re。有利地，本發明IgG與基于四環素的預防性治療相結合。通過在基于四環素的快 速治療(“短期治療”)之后注射本發明IgG，本發明IgG通過在暴露風險之后以安全的方 式停止使得能夠縮短基于四環素的預防。有利地，本發明IgG與使用環丙沙星的治愈性治療相結合。使用下列有關抗PA IgG制劑例子的補充描述更容易理解本發明。


在下列實施例中，將提及下文以舉例形式給出的附圖圖1 區域VKV2(本發明IgG的輕鏈可變區，其包含表1所述的突變)的擴增示意 圖。圖2 區域VHV2 (本發明IgG的重鏈可變區，其包含表2所述的突變)的擴增示意 圖。圖 3 載體 CHK463-23 的圖。圖 4 載體 HK558-12 的圖。圖5 使用IgG 35PA83v2(包含表1和表2所述突變的本發明IgG)的預防性治療。 2mg/kg的IgG 35PA83v2使得能夠獲得60%的存活率，5mg/kg使得能獲得100%的存活。直 至第30天，未觀察到新事件。圖6 使用四環素的預防性治療。在第7天后停止四環素施用，該治療停止后第4 至第7天之間所有小鼠死亡。圖7:使用多西環素的預防性治療，補充或不補充IgG 35PA83。在A/J小鼠中起 始基于四環素的治療(5mg/kg的每日劑量)。12小時后，用10 OOOLD50的Sterne菌株孢子 感染動物。在注射或不注射35PA83(1或2mg/kg)的情況下，在治療的第7天停止四環素注 射。超過圖上所示時間段未觀察到特殊事件(第500小時)。在圖上用符號"指示 出高度顯著的作用。圖8:基于環丙沙星的治療，IgG 35PA83v2或其兩者。單獨使用環丙沙星或IgG 35PA83v2基本上沒有存活，而兩種分子的組合實現了 80%的存活率。直至第30天，未觀察 到新事件。圖9 使用補充或未補充IgG 35PA83的環丙沙星的治療。用IOOOLD5q的Steme孢 子感染A/J小鼠。感染后12小時，在兩個獨立的組中(每組10只動物)，開始單獨的基于 環丙沙星的治療(每天兩次25mg/kg)，持續5天，或者注射單劑IgG 35PA83 (10mg/kg)。在 感染后的三個不同時間(12、24或48小時)，每次由不同組的動物參加，小鼠接受聯合的基 于環丙沙星的治療(每天兩次25mg/kg，共5天)加一次注射IgG 35PA83 (lOmg/kg)。超 過圖上所示時間段未觀察到特殊事件(第150小時)。在圖上用符號"*" (ρ = 0.03) 或"(ρ = 0. 0007)指示出顯著作用。圖10 使用IgG 35PA83的被動預防性治療。感染(IOOOOLD5q)之前12小時施用一 次35PA83注射(2mg/kg或5mg/kg)。在第30天，對30天后仍然存活的小鼠再次感染(10 OOOLD5tl)。超過圖上所示時間段未觀察到特殊事件(第40天)。在圖上用符號〃 ***〃指示出高度顯著的作用(P = 0. 0001)。圖11 非突變35PA83抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的珍珠串構型。IMGT珍珠串構型是與IMGT命名法一致的。點表示非常類似于35PA83的人基因與 35PA83的差異。陰影環對應于根據IMGT命名法的缺失位置。
實施例實施例1 構津Fab(35PA83)突變體文庫材料和方法大腸桿菌菌株使用下列大腸桿菌菌株-XLl (Stratagene, the jolla, CA) :recAl, endAl, gyrA96 thi-1 hsdR17sup E44 relAl lac[F' proAB lacIqZAM15 TnlO(Tetr)].-SURE(Stratagene) :el4(McrA) Δ (mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endAlsupE44 thi-1 gyrA96 relAl lac recB recj sbcC umuC::Tn5(Kanr)uvrC[F ' proAB IacIqZ Δ M15 TnlO(Tetr)]-HB2151 (Carte 等人，1985)，用于表達可溶性 Fab。毒素炭疽毒素(PA83，LF和EF)獲得自List實驗室。構建35PA83突變體文庫構建免疫球蛋白片段35PA83的突變體以人源化。通過實施如表3和4中所述的 突變獲得該突變體表1 為了人源化35PA83輕鏈的突變
權利要求
針對炭疽毒素保護性抗原(PA)的G類免疫球蛋白(IgG)，其包含 輕鏈可變區，其包含與序列SEQ ID NO1有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，和 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO2有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，并且包含對應于25位絲氨酸殘基、54位賴氨酸殘基和60位精氨酸殘基的氨基酸殘基，其特征在于它由IgG1或IgG2組成。
2.根據權利要求1的G類免疫球蛋白，其特征在于它包含 -具有序列SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的輕鏈可變區，和 -具有序列SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的重鏈可變區。
3.根據權利要求1的IgG，其特征在于輕鏈可變區(SEQID No 1)包含選自下列的至 少一個突變-無/A⑴ -無/I⑵ -無/Q⑶ -無/L (4) -Y/S(14) -K/R(18) -H/R(24) -L/V(124)。
4.根據權利要求3的IgG，其特征在于輕鏈可變區(SEQID No 1)包含下列突變 -無/A⑴-無/I⑵ -無/Q⑶ -無/L (4) -Y/S(14) -K/R(18) -H/R(24) -L/V(124)。
5.根據前述權利要求任一項的IgG，其特征在于重鏈可變區(SEQIDNo 2)包含選自下 列突變的至少一個突變-無/Q⑴ -無/V⑵ -無/Q⑶ -無/L (4) -無/Q (5) -無/E (6) -L/V(12) -Α/Τ (24) -Α/Τ(122) -V/L(123)。
6.根據權利要求4的IgG，其特征在于具有序列SEQID NO :2所示氨基酸序列的重鏈 可變區包含下列突變-無/Q⑴ -無/V⑵ -無/Q⑶ -無/L (4) -無/Q (5) -無/E (6) -L/V(12) -Α/Τ (24) -Α/Τ(122) -V/L(123)。
7.根據前述權利要求任一項的IgG，其特征在于其輕鏈恒定區包含序列SEQID NO 3 所代表的氨基酸序列，并且重鏈恒定區包含由序列SEQID NO :4代表的氨基酸序列。
8.根據前述權利要求任一項的IgG，其特征在于其每個重鏈的恒定區為Yl型。
9.根據前述權利要求任一項的IgG，其特征在于其每個重鏈的恒定區為Yl型并且包 含氨基酸序列SEQ ID NO :7，并且其每個輕鏈的恒定區包含氨基酸序列SEQ ID No :8。
10.根據前述權利要求任一項的IgG，其特征在于其每個輕鏈包含氨基酸序列SEQID NO :9，并且其每個重鏈包含氨基酸序列SEQ ID NO :10。
11.編碼權利要求1至10任一項抗體的核酸。
12.包含權利要求11的核酸的載體。
13.包含權利要求12的載體的宿主細胞。
14.根據權利要求13的宿主細胞，其特征在于它是選自SP2/0，YB2/0,IR983F， Namalwa 人骨髓瘤，PERC6, CHO 細胞系，特別是 CHO-K-l，CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec 13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, ffil-2, Jurkat, Vero, Molt-4，C0S-7，293-ΗΕΚ，BHK, Κ6Η6, NS0, SP2/0-Ag 14 和 P3X63Ag8. 653 的細胞。
15.包含至少一種根據權利要求1至10任一項的人IgG的組合物。
16.包含至少一種根據權利要求1至10任一項的人IgG的藥物組合物。
17.根據權利要求1至10任一項的人IgG在制備用于治療或預防炭疽芽孢桿菌感染的 藥物中的用途。
18.用于檢測含PA炭疽毒素的試劑盒，所述試劑盒包含-包含至少一種標記的根據權利要求1至10任一項的IgG的容器，和 -包含檢測此經標記的IgG之工具的容器。
19.體外檢測生物學樣品中含PA炭疽毒素的方法，其包括下列步驟 -將所述樣品與至少一種根據權利要求1至10任一項的IgG相接觸，和 -檢測所述IgG的結合，作為所述炭疽毒素存在的指示。
20.免疫綴合物，其包含與治療劑結合的根據權利要求1至10任一項的IgG。
全文摘要
本發明涉及針對炭疽毒素保護性抗原(PA)的G類免疫球蛋白(IgG)，其包含輕鏈可變區，其包含與如說明書中所定義的序列SEQ ID NO1有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，和重鏈可變區，其包含與如說明書中所定義的SEQ ID NO2有至少90％氨基酸同一性的氨基酸序列，其特征在于它由IgG1或IgG2組成。
文檔編號G01N33/569GK101952311SQ200880118635
公開日2011年1月19日 申請日期2008年11月28日 優先權日2007年11月29日
發明者C·貝朗, P·蒂利耶 申請人:Lfb生物技術公司;由軍事總代理代表的法國國家