專利名稱：：提取體液樣本中低分子量蛋白/肽的方法
技術領域：
：本發明涉及從哺乳動物，包括人類的體液樣本，特別是血清和血漿中提取低分子量蛋白/肽的方法，并涉及用于該提取方法的試劑盒。
背景技術：
：近些年來，采用蛋白組學的研究已經作為后基因組研究被積極開展。這是由于與基因相比，作為基因產物的蛋白可能更直接的與疾病狀態相關。因此，人們期待蛋白組學能夠發現許多未能通過基因組學分析發現的病原性蛋白或疾病相關因子。例如，蛋白組學分析促進特定疾病誘導或刪除的生物標記蛋白的發現。該生物標記的表現與疾病狀態相關，因此極有可能用作診斷標記或者藥物開發/發現中的靶標。此外，該生物標記為患者帶來直接的益處，例如藥物應答的評估或不良反應發生的預測。最近，由于質譜儀(MS)性能的改善，基體輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)、MS/MS質譜儀(串聯質譜儀)、液相質譜儀(LC-MS質譜儀)等已被實際使用。利用這些先進的技術，蛋白組學分析已經實現了蛋白等的高速結構分析，以及多肽的高通量超微量分析或者之前無法檢測的、極低豐度蛋白的鑒定，并成為疾病相關因子研究的強力工具。然而，體液樣本(特別是血清和血漿)的蛋白組學分析盡管具有巨大的臨床優勢，但落后于針對生物組織的分析。這是由于，例如，主要蛋白如白蛋白或球蛋白的豐度超過所有血清或血漿蛋白的99%(非專利文獻1)，隨著這些蛋白的去除，大部分低分子蛋白/肽成分同樣會損失。已經開發了從血清或血漿去除主要蛋白的預處理技術，包括通過去除過量的妨礙低豐度成分檢測的蛋白來獲得溶液的方法(專利文獻1和2)；使用多個電極濃縮分級蛋白溶液的方法(專利文獻3)；以及去除血清中主要蛋白的方法，其包括使用有機溶劑沉淀大蛋白，并由此分離低分子量蛋白(非專利文獻2)。然而，隨著主要蛋白的去除，與其相互作用的低分子量蛋白/肽也會損失。因此，依然需要開發高效和高重現性且不受主要蛋白影響的濃縮體液樣本(特別是血清或血漿)中低分子量蛋白/肽的方法。專利文獻1日本專利公開號2005-126376專利文獻2日本專利公開號2005-156249專利文獻3日本專利公開號2007-139759非專利文獻1:Tirumalai等人，Mol.Cell.Proteomics2.10，1096-1103，2003非專禾O文獻2=Merrell等人，JournalofBiomolecularTechniques15238-248,200
發明內容本發明要解決的問題本發明的目的是提供提取體液樣本，特別是血清或血漿中的低分子量蛋白/肽的方法，以及提供用于該方法的試劑盒，其中該方法為高效和高重現性的，且不受大豐度蛋白的影響。解決該問題的手段本發明人已經開發了搜索疾病相關的肽的方法，并建立了高效和高重現性的提取組織中肽成分的方法。該方法包括兩個步驟，并實現了包含在正常和疾病組織中的300-500種主要的肽的提取，并采用二維HPLC分離進行了定量比較。隨后，本發明人成功地分離并鑒定了糖尿病模型小鼠的腎皮質中存在的糖尿病特異性肽。然而，即便可以檢測到組織中的診斷標記物，但當該方法被應用至人類疾病時，這種針對組織的方法會在考察過程中引起患者的大量疼痛或負擔。因此，該方法難以實際使用。相反地，如果在體液樣本，特別是血清或血漿中檢測診斷標記物，則僅施加采集血液的少量疼痛便可對患者進行診斷。此外，該種診斷標記物可用于醫學檢查，極有可能導致對疾病的早期檢測。因此，基于組織肽分析方法的建立獲得的技術訣竅，本發明人開發了針對血清的提取低分子量蛋白/肽的方法。與該方法的開發相關的最大問題在于大部分低分子量蛋白/肽成分隨著主要蛋白的去除而損失。這可能是由于這些低分子量蛋白等與載體蛋白，例如白蛋白或球蛋白等(血清中的主要蛋白)結合。因此，本發明人研究了各種條件，然后成功開發了從血清或血漿中提取低分子量蛋白等的方法，該方法是高效和高重現性的，且不受載體蛋白的影響。因此，本發明提供了提取包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽的方法，該方法包括如下的步驟(a)至(f)(a)向該體液樣本中添加含有脲和硫脲的試劑1和含有還原劑的試劑2，將其混合，然后將該混合物滴入含有90%或更多有機溶劑的試劑3，將其混合；(b)低溫攪拌步驟(a)中所得的混合溶液；(c)低溫離心步驟(b)中所得的攪拌溶液并去除上清液；(d)將含有有機溶劑和酸的試劑4添加至步驟(C)中所得的沉淀，將其混合；(e)低溫攪拌步驟(d)中所得的混合溶液；以及(f)低溫離心步驟(e)中所得的攪拌溶液并回收上清液。本發明提供了提取包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽的方法，其進一步包括步驟(g)凍干步驟(f)中回收的上清液。此外，本發明提供了制備分析樣本的方法，其中所述分析樣本為包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽，該方法包括向通過該提取方法獲得的凍干產品中添加含有成分的試劑5，所述成分選自TFA、氫氯酸、甲酸、乙酸和TCA。此外，本發明提供了用于提取包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽的試劑盒，該試劑盒包含了含有脲或硫脲的試劑1、含有還原劑的試劑2、含有90%或更多的有機溶劑的試劑3、以及含有有機溶劑和酸的試劑4。定義本文所用的“低分子量蛋白”指分子量為30，000或更低，優選20，000或更低的蛋白。此外，除非另行指明，“低分子量蛋白等”既指低分子量蛋白又指低分子量肽。其例子包括極低豐度的生物活性蛋白(例如，肽激素、白介素和細胞因子)、具有不特定功能的極低豐度生物標記蛋白，以及肽。這些蛋白或肽經腎部分地排泄至尿液。因此，除了血液，尿液也可用作測試的分析物。本文所用的“血漿”指通過離心添加了EDTA或肝素等的血液所獲得的上清液，其極少或不受血液凝結系統的作用。本文所用的“血清”指從血液中去除凝結成分后獲得的部分。新鮮血液在分離后凝結，并且血細胞和血纖蛋白隨后收縮形成凝塊，釋放透明的琥珀色血清。該血清基本由不含纖維蛋白原的血漿組成。本文所用的血清等中“主要蛋白”和“載體蛋白”指血清中所含的相對大分子量的蛋白。其例子包括白蛋白(分子量66kDa)、免疫球蛋白(150-190kDa)、轉鐵蛋白(SOkDa)、觸珠蛋白(>85kDa)以及脂蛋白(數百kDa)。本文所用的縮寫“SDS”指十二烷基硫酸鈉。本文所用的縮寫“PAGE”指聚丙烯酰胺凝膠電泳。發明效果本發明可以除去體液樣本，特別是血清或血漿中包含的相對大分子量蛋白，并可高效和高重現性地提取(或富集)低分子量蛋白/肽。此外，本發明可從高含量主要蛋白(例如，白蛋白)分離未通過試劑1-4去除的中至高分子量(分子量20000-100000或更高)蛋白，并可將這些中至高分子量蛋白轉化成為可通過電泳、蛋白組學分析等進行檢測和/或定量的形式。實施本發明的最優選實施方式本發明所用的體液樣本指從哺乳動物的血清、血漿、尿液、唾液、淚液、腦脊髓液、腹水、腹膜積液以及各種細胞中獲得的，并且包含低分子量蛋白和/或肽的溶液等。特別地，該體液樣本優選血清或血漿。本發明的步驟(a)是向該體液樣本中添加含有脲和硫脲的試劑1和含有還原劑的試劑2，將其混合，然后將該混合物滴入含有90%或更多有機溶劑的試劑3，將其混合。試劑1具有脲濃度l-8mol/l(下文縮寫為M)，優選3_8M，且硫脲濃度為0.5_3M，優選1-3M。此外，試劑2包含還原劑，其量優選使得在體液樣本、試劑1和試劑2的混合物中的還原劑濃度為lmM-20mM。這樣，試劑2包含的還原劑的濃度至少比該混合物中高10-100倍。例如，該還原劑濃度優選為10mM-200mM、10mM-lM、10mM-2M或10mM-10M。試劑2中的還原劑可不受特定限制進行使用，只要它可用于蛋白等生物材料的一般還原。其例子包括選自二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、三(2-羧乙基)膦HCl(TCEPHCl)、三正丁基膦(TBP)、2_巰基乙醇(2-ME)及其混合物的還原劑。當試劑2中的還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、2_巰基乙醇(2-ME)或2-巰基乙醇胺(2-MEA)時，試劑2包含還原劑的量優選使該還原劑在體液樣本、試劑1和試劑2的混合物中的濃度為5mM-20mM。這樣，試劑2中的還原劑濃度為50mM_10M、優選50mM-lM、更優選50mM-100mM。當試劑2中的還原劑為三(2-羧乙基)膦HCl(TCEPHCl)或三正丁基膦(TBP)時，試劑2包含還原劑的量優選使該還原劑在體液樣本、試劑1和試劑2的混合物中的濃度為ImM-lOmM。這樣，試劑2中的還原劑濃度為10mM-10M、優選10mM-lM、更優選10mM-200mMo試劑3是包含選自丙酮、乙醇、甲醇、2-丙醇、乙腈及其混合物，優選丙酮的有機溶劑的溶液。試劑3中的有機溶劑的濃度通常為90%或更高、優選95%或更高、更優選98%或更高。滴加中所用的試劑3的體積是該體液樣本以及試劑1和2的混合溶液的至少10倍或更多、優選20倍或更多、特別優選30倍或更多。在步驟(a)中，液體樣本中的蛋白和肽通過添加試劑1和2進行處理，然后將該混合物滴加至含有90%或更多的有機溶劑(遠高于常規丙酮方法或類似方法中的丙酮濃度(50-70%))的試劑3中。通過該步驟，體液樣本中的主要蛋白變性，以破壞其原始結構。另一方面，即使試劑3包含了90%或更多的有機溶劑，也沒有或極少引起低分子量蛋白/肽的變性。由此，該低分子量蛋白等和該高分子量主要蛋白被認為以易于分離的狀態沉淀。本發明的步驟(b)為低溫攪拌步驟(a)中所得的混合溶液。步驟(b)中的低溫并無特別限制，只要樣本中的蛋白等成分在該溫度下保持穩定。該低溫為，例如，_20°C至10°C、優選0°C至5°C。此外，該攪拌進行1分鐘或更長時間、優選60分鐘至120分鐘、更優選60分鐘至90分鐘。此外，該攪拌可通過攪拌機械，例如各種渦流混合器和攪拌器進行。本發明的步驟(C)為低溫離心步驟(b)中所得的攪拌溶液并去除上清液。步驟(c)中的低溫并無特別限制，只要樣本中的蛋白等成分在該溫度下保持穩定。該低溫為，例如，0°c至10°C、優選0°C至5°C。該離心優選在能夠沉淀該體液樣本中的蛋白和肽的條件下進行，例如，在3000Xg至30000Xg,優選10000Xg至25000Xg下離心1分鐘或更長時間、優選5分鐘至30分鐘。本發明的步驟(d)為將含有有機溶劑和酸的試劑4添加至步驟(c)中獲得的沉淀物中，并將其混合。在試劑4中的有機溶劑選自乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇及其混合物，并優選乙腈。該有機溶劑的濃度為50-99%，優選60-80%。該酸選自氫氯酸、TFA、甲酸、乙酸和TCA，并優選氫氯酸。此外，該酸的濃度為使得主要蛋白通過酸變性而難以溶解的濃度。例如，在使用氫氯酸時，其濃度通常為ImM或更高，優選lmM-300mM，優選5mM-500mM，更優選5mM-25mM。在上下文中，0.1-500體積份數，優選1-200體積份數，更優選10-100體積份數的試劑4可被添加至一(1)體積份數的體液樣本中。本發明的步驟(e)為低溫攪拌步驟(d)中所得的混合溶液。步驟(e)中的低溫并無特別限制，只要樣本中的蛋白等成分在該溫度下保持穩定狀態。該低溫為，例如，-20°C至10°C、優選0°C至5°C。此外，該攪拌進行1分鐘或更長時間、優選60分鐘至120分鐘、更優選60分鐘至90分鐘。此外，該攪拌可通過攪拌機械，例如各種渦流混合器和攪拌器進行。步驟(d)中試劑4的添加以及步驟(e)中的攪拌可溶解體液樣本，特別是血清或血漿中的低分子量蛋白/肽，但不溶解高含量蛋白。這是由于如上文所述，含有90%或更多的有機溶劑的試劑3在步驟(a)中使主要蛋白變性以破壞它們的原始結構，而添加試劑3沒有或極少引起低分子量蛋白/肽的變性。因此，兩種這些蛋白可以容易地彼此分離。然后，添加試劑4處理可溶解該低分子量蛋白等，而不溶解主要蛋白，從而允許彼此分離。此夕卜，在步驟(a)和(d)中被試劑1-4溶化的中至高分子量蛋白也與高含量主要蛋白分離，從而可被分析。本發明的步驟(f)為低溫離心步驟(e)中所得的攪拌溶液并回收上清液。步驟(f)中的低溫并無特別限制，只要樣本中的蛋白等成分在該溫度下保持穩定狀態。該低溫為，例如，0°c至10°C、優選0°C至5°C。該離心優選可在能夠沉淀該體液樣本中的蛋白和肽的條件下進行，例如，在3000Xg或更高、優選10000Xg至25000Xg下離心1分鐘或更長時間，優選5分鐘至30分鐘。步驟(f)中獲得的上清液是通過本發明的方法從體液樣本中所獲得的低分子量蛋白等的提取物。該上清液可直接用于蛋白組學分析等。本發明的步驟(g)為附加步驟，其為將步驟(f)中回收的上清液凍干的步驟。通過凍干，來自該體液樣本的該低分子量蛋白等可被穩定地貯存，同時它們可根據分析方法以期望的濃度溶解在所期望的溶劑中并進行分析。該凍干的使用可不受特定的限制，只要其不破壞本發明提取的該低分子量蛋白等。本發明進一步提供了制備分析樣本的方法，所述分析樣本為包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽，該方法包括向通過該方法獲得的凍干產品中添加含有成分的試劑5，所述成分選自TFA、氫氯酸、甲酸、乙酸和TCA。優選地，試劑5含有0.1-20%的TFA。可選擇地，試劑5優選含有0.1-20%的甲酸、乙酸、TCA或其混合物。試劑5可包含各種溶劑，包括水、乙醇、甲醇、乙腈、丙醇、丙酮及其混合物。在該制備方法中，可向1體積份數的體液樣本中添加0.01-100體積份數、優選0.1-100體積份數、更優選5-100體積份數的試劑5。此外，本發明提供了用于提取包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽的試劑盒。該試劑盒包括含有脲和硫脲的試劑1、含有還原劑的試劑2、含有90%或更多的有機溶劑的試劑3以及含有有機溶劑和酸的試劑4。該試劑盒中所用的試劑與上述本發明的方法中所用的試劑1-4相同。具體地，本發明的試劑盒包括試劑1，其具有脲濃度1-8M并且硫脲濃度為0.5-3M；試劑2，其含有上文所述濃度的還原劑；試劑3，其含有90%或更多、優選95%或更多的選自丙酮、乙醇、甲醇、2-丙醇、乙腈及其混合物的有機溶劑；以及試劑4，其含有50-99%的選自乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇及其混合物的有機溶劑以及選自氫氯酸、TFA、甲酸、乙酸和TCA的酸。此外，本發明的試劑盒包括試劑1，其含有濃度為3-8M的脲和濃度為1-3M的硫脲；試劑2，其含有濃度為10-300mM的還原劑；試劑3，其含有濃度為98%或更高的作為有機溶劑的丙酮；以及試劑4，其含有濃度為60-80%的作為有機溶劑的乙腈。此外，本發明提供了用于制備分析樣本的試劑盒，其中所述分析樣本為包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽，該試劑盒包含了試劑1-4和試劑5，即含有成分的試劑5，其中試劑5被添加至提取的低分子量蛋白等的凍干產品中，且該成分選自TFA、氫氯酸、甲酸、乙酸和TCA。接下來，本發明將通過實施例進行詳細和具體的描述。下文的實施例目的在于描述本發明，且不以任何方式限制本發明的保護范圍。本發明的保護范圍通過本申請的權利要求書的描述進行定義。實施例實施例1低分子量蛋白等的提取在本實施例中，采用人血清按照本發明來進行低分子量蛋白等的提取。圖1顯示了本實施例步驟的流程圖。此處所述的“低分子量蛋白等”是指血清中分子量為20，000或更低的蛋白/肽，以及未通過本發明的方法去除的中至高分子量蛋白，且不包括大多數高分子量主要蛋白，如白蛋白。在本實施例中，20μ1的血清被用作體液樣本。向該血清中添加36μ1試劑1(7Μ脲和2Μ硫脲)以及4μ1的試劑(200mMDTT)，然后渦流混合。為進行該步驟，所有的血清、試劑1和試劑2被冷卻至4°C后使用。然后將該混合的溶液滴入1.8ml的冷卻至4°C的試劑3中，所述試劑3含有高純度丙酮，隨后立即渦流混合，并在4°C環境下攪拌1小時。攪拌后，使用冷凍離心機在4°C下將該混合溶液離心(19，OOOXg)15分鐘，完全去除所得的上清液。在4°C下，向殘留的沉淀中添加400μ1試劑4(70%乙腈，12mM氫氯酸，平衡水)，并在4°C下攪拌1小時。然后，使用冷凍離心機在4°C下將該混合溶液離心(19，OOOXg)15分鐘，并回收所得的上清液，作為低分子量蛋白等的溶液。然后，將提取的溶液凍干，并通過添加80μ1的試劑5(99.9%H2O和0.1%TFA)來溶解所獲得的凍干產品。通過上述相同的方式，分別處理5μ1血清和4μgSPM的混合物、10μ1血清以及5μ1血清以得到樣本用于分析。對于不同量的處理血清，改變該溶劑1-5的量以實現與20μ1血清相同的比例。例如，對于10μ1血清，試劑1-5的每一種的量為18μ1的試劑1、2μ1的試劑2、0.9ml的試劑3、200μ1的試劑4禾口80μ1的試劑5。實施例2通過Tricine-SDS-PAGE來檢測本發明實施例1中獲得的提取溶液可作為樣本來進行檢測，其通過低分子量的電泳(Tricine-SDS-PAGE)來分離溶液，并隨后進行考馬斯染色來檢測。所用的樣本為通過實施例1的方法獲得的血清提取溶液、未處理的血清、標準肽混合物(SPM)以及未處理血清和SPM的混合溶液。本文所用的SPM為馬心臟球蛋白的溴化氰降解產物，它是含有分子量為16，949、14，404、10，700,8,159,6,214和2，512的6種肽片段的混合物。SPM是在電泳中被用作分子量標記的試劑(由GEHealthcareBioScience生產)。本Tricine-SDS-PAGE中使用的凝膠具有下文表1所述的組成。[表1]Tricine-SDS-PAGE凝膠的組成分離膠(底層)~1.5MTris-HClpH8.453.3ml~48%丙烯酰胺(3%雙丙烯酰胺)3.3ml甘油1.0ml蒸餾水2.4ml~<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>此外，該Tricine-SDS-PAGE在參考文獻7所述的條件下進行。然后，取下含有展開樣本的凝膠并進行考馬斯染色。考馬斯染色采用如下試劑和方法進行試劑1(染色溶液30%甲醇、10%乙酸、0.[w/v]考馬斯R-350、平衡水)試劑2(脫色溶液30%甲醇、10%乙酸、平衡水)在染色步驟中，從電泳后的凝膠板中取出該凝膠并轉移至具有光滑表面的清潔容器中。然后，將試劑ι添加至該容器中以將該凝膠浸泡在試劑1中，并振蕩20分鐘。振蕩后，去除試劑1。然后加入試劑2以將該凝膠浸泡在試劑2中，然后振蕩至背景顏色適當變淺。所得的結果顯示于圖2。泳道(a)顯示了由4μgSPM所得到的結果；泳道(b)顯示了由0.5μ1未處理的血清所得到的結果；泳道(C)顯示了由按照實施例1的方法處理的5μ1血清和4μgSPM的混合物所得到的結果；泳道(d)顯示了由通過實施例1的方法處理的5μ1血清所得到的結果；而泳道(e)顯示了由通過實施例1的方法處理的10μ1血清所得到的結果。電泳圖上方的表顯示了血清的量、SPM的量以及是否經過實施例1的處理。泳道(d)顯示了按照本發明方法進行處理，多數蛋白成分已被去除，盡管泳道(d)以5μ1血清作為分析物，其中泳道(d)為泳道(b)體積的10倍。此外，在泳道(d)中比泳道(b)中檢測到了更高強度的低分子量蛋白等。在泳道(e)中顯示了通過本發明方法處理的體積為泳道(d)兩倍的血清的結果，低分子量蛋白等的成分檢測到的強度約為泳道(d)的兩倍。泳道(c)顯示了由4ygSPM(與泳道(a)的體積相等)禾Π5μ1實施例1中提取的血清的混合物所得的結果。在比較泳道(c)和(a)的SPM條帶時，所有的條帶測得了基本相同的強度。這可以證明本發明的方法具有接近幾乎100%的低分子量蛋白等的提取效率。由這些結果可知，本發明的方法能夠有效回收SPM，并能夠高效提取血清中的低分子量蛋白等。此外，通過倍增提取的血清量，提取物中低分子量蛋白等的成分也幾乎倍增，這表明樣本中的肽可以維持它們的數量信息的方式被提取。因此，本發明的方法表現為一種高效并能保持其數量信息，且不被載體蛋白影響的方式來提取低分子量蛋白等的方法。實施例3通過反相HPLC對本發明進行檢測圖3顯示了通過反相HPLC分析采用實施例1的方法提取的低分子量蛋白等的樣本的結果。圖㈧顯示了在保留時間為20-70分鐘時的分析結果，圖⑶顯示了在圖㈧中保留時間為30-40分鐘時的色譜峰強度的5X放大圖。此外，色譜圖中的黑線代表了0.5μ1未處理血清的分析結果，色譜圖中的灰線代表了由通過實施例1的方法處理的5μ1血清所得的樣本的分析結果。在反相HPLC中，低分子量蛋白等傾向于在較早的保留時間(40分鐘或更早)被提取，而高分子量蛋白等傾向于在較晚的保留時間(40分鐘或更晚)被提取。色譜圖中的灰線顯示了低分子量蛋白等的結果，所述低分子量蛋白是從5μ1血清中按照實施例1的方法來提取的，其比色譜圖中黑線的體積高10倍。比較色譜圖㈧中灰線和黑線，在40分鐘或更晚的保留時間中灰線上幾乎沒有可見的峰。該結果證實了大部分高分子量主要蛋白等(例如白蛋白)已被去除。此外，在色譜圖(B)中，在黑線上幾乎沒有可測的峰，而在灰線上測得了多個峰。該結果證明了血清中的低分子量蛋白等被提取了。實施例4本發明方法的重現性確認為了確認本發明方法對于低分子量蛋白等的濃縮重現性，參照實施例1的方法分別對10μ1每種相同的血清提取6次，所得的提取物分別通過TriCine-SDS-PAGE進行分析。該結果顯示于圖4。如圖4可見，測得的條帶在所有的泳道中均相同，且在泳道中的相應條帶測得了幾乎相同的強度和厚度。該結果證實了本發明的方法可以較高的重現性來提取低分子量蛋白等。實施例5通過本發明的方法提取的低分子量蛋白等的鑒定通過實施例的方法提取的低分子量蛋白等用Tricine-SDS-PAGE顯影，并鑒定可作為區分條帶檢測的主要肽和未去除蛋白。該方法和結果在下文顯示。低分子量蛋白等的分離首先，通過Tricine-SDS-PAGE分離由實施例1的方法處理10μ1血清樣本所獲得的提取溶液。在考馬斯染色后，切下待鑒別的條帶以獲得多個凝膠片。該凝膠片采用含50%乙腈的50mM重碳酸銨進行脫色。用蒸餾水洗滌該凝膠片，然后在100%乙腈中脫色15分鐘，并在離心蒸發器中干燥60分鐘。向該干燥的凝膠片中添加溶解于25mMTris-HCl(pH9.0)中的10-30μ1的0.5ng/μ1胰蛋白酶(RocheDiagnosticsGmbH)，其在冰上于45分鐘內吸收至凝膠片中。然后去除過量的胰蛋白酶溶液，并向其添加50mMTris-HClpH9.0從而將該凝膠浸泡在該溶液中，然后在37°C下凝膠內消化18小時。酶消化完全后，回收該凝膠片周圍的所有溶液，并臨時儲存在冰上。為了進一步回收仍然殘留在凝膠中的肽片段，向其添加含50%乙腈的5%甲酸溶液從而將該凝膠浸泡在溶液中，并將該混合物在室溫下攪拌20分鐘。攪拌后，將上清液添加至事先貯存的前一溶液中。用LC-MS*裝置檢測該溶液，使用蛋白鑒定軟件(SEQUESTSEARCH=ThermoFisherScientificInc.)進行數據庫檢索。IX-MS液相色譜_質譜液相色譜NanospaceSI-2(ShiseidoFinChemicals)質譜LCQ-DECA(由ThermoFisherScientificInc.生產)分析結果分離的低分子量蛋白等的條帶顯示于圖5，鑒定結果顯示于表2。圖5左側顯示了條帶中低分子量蛋白等的分子量，右側顯示了鑒定的蛋白等的條帶號。表2中的條帶數量與表5中的對應。在表2中，分子量代表了鑒定的蛋白/肽在數據庫中所示的分子量，而蛋白等的名稱代表了鑒定的蛋白/肽的名稱。如圖5的Tricine-SDS-PAGE結果所示，鑒定得到了分子量為20，000或更高的蛋白，以及分子量為20，000或更低的低分子量蛋白等。[表2]血清中肽等的鑒定結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如表2所示，在每個切除的凝膠片中存在多個實際得到鑒定的蛋白/肽，盡管它們在圖5中顯示為一個條帶。該結果表明所得的提取物包含了大量的低分子量蛋白等。此外，從右側分子量估計，圖5中11號條帶表示的分子量應該為約11，000。然而，在該條帶號鑒定的多個蛋白包括了分子量47，000的蛋白，其事實上大于估計的分子量。這表明鑒定得到了裂解的蛋白片段。該結果顯示在低分子量蛋白等范圍內的多數條帶包含了裂解的蛋白片段。該蛋白片段包括由于細胞壞死或凋亡而釋放到血液中的蛋白片段(參考文獻2)。因此，該蛋白片段可反映不同的體內信息。圖5中的2號條帶通過條帶強度證實為約2μg，并含有作為鑒定蛋白的白蛋白。每10μ1健康人體的血清中發現的白蛋白的量約為600μg(參考文獻2)。該結果表明約99.7%的作為典型蛋白的白蛋白被去除。此外，表2中低分子量蛋白等區域的條帶號13處的載脂蛋白C-II在10μ1健康人體的血清中發現的量僅為約0.3μg(參考文獻3)。因此，該載脂蛋白C-II不是血清中的主要成分(參見圖1)。在血清中白蛋白和載脂蛋白C-II之間的濃度比較中，白蛋白存在的濃度為載脂蛋白C-II濃度的約2，000倍。作為采用本發明的方法濃縮的結果，濃度相差約2，000倍的白蛋白和載脂蛋白C-II可同時被電泳測得。這表明了大部分白蛋白已被去除，而載脂蛋白C-II被有效地提取。比較實施例1與常規方法(丙酮沉淀法)的比較通過與作為常規的一般肽提取方法(提取方法)的(1)丙酮沉淀和(2)超濾法比較，評估了本發明方法的蛋白去除效率和肽提取效率。丙酮沉淀法在丙酮沉淀法中，蛋白分子表面的結合水由于丙酮的溶解而損失，從而導致蛋白的溶解度迅速下降，并通過蛋白間的結合而沉淀。蛋白通過與溶劑的水合形成了穩定的三維結構，因而易于通過采用高濃度有機溶劑沉淀。相反，肽通常呈不具有三維結構的溶解形式，因而很難沉淀。丙酮沉淀法是一種通過利用有機溶劑存在下的溶解度差異，僅將肽作為可溶組分提取的方法。因此，當血清滴入丙酮溶劑時，蛋白被沉淀。因而僅有肽作為可溶組分被回收。丙酮沉淀法的步驟在本比較實施例中，該丙酮沉淀法可參照Matsuo或Chertov等人(參考文獻4和5)的方法實施。圖6顯示了丙酮沉淀法的流程圖。混合SPM的血清和未混合的血清被用作評估肽提取效率的樣本。首先，通過11的比例混合血清和7M脲/2M硫脲來稀釋血清。將稀釋的血清(10μ1)緩慢滴入冷卻至4°C的90μ1的75%丙酮，并將混合物在4°C下攪拌1小時。通過4°C下19，OOOXg離心15分鐘回收可溶組分，并凍干。將凍干的產物溶解于20μ1用于PAGE的樣本緩沖液中，并通過Tricine-SDS-PAGE分析。該用于PAGE的樣本緩沖液的組成為50mMTris-HCl(pH6.8)、50mMDTT、0.5%SDS和10%甘油。用7M脲/2M硫脲稀釋血清可使血清所含的蛋白變性。這還使蛋白酶滅活，從而減少它的影響(參考文獻5)。此外，載體蛋白結合肽的回收被認為是可能的，因為載體蛋白也被變性。結果和評價圖7顯示了通過丙酮沉淀法從血清提取的肽經Tricine-SDS-PAGE分離后考馬斯染色的結果。泳道(a)顯示了由8ygSPM得到的分析結果；泳道(b)顯示了由0.5μ1未處理的血清得到的分析結果；泳道(c)顯示了由經過丙酮沉淀法處理的5μ1血清和8μgSPM的混合物得到的分析結果；泳道(d)顯示了由經過丙酮沉淀法處理的5μ1血清得到的分析結果；而泳道(e)顯示了由經過丙酮沉淀法處理的8ygSPM得到的分析結果。電泳圖上方的表顯示了血清的量、SPM的量以及是否經過丙酮沉淀法處理。泳道(d)顯示了多數蛋白(分子量20，000或更高)通過丙酮沉淀法的處理而被去除，盡管泳道(d)顯示了由5μ1血清(是泳道(b)的體積的10倍)得到的分析結果。該結果進一步表明肽成分(分子量20，000或更低)被提取，因為這些肽成分在泳道(d)中測得的強度高于泳道(b)。另一方面，由于丙酮沉淀，在泳道(d)中缺失了泳道(b)中分子量14，000-17，000范圍內觀察到的兩條條帶。此外，泳道(a)、(c)和(e)包含了相同量(Syg)的SPM。僅泳道(c)的樣本中添加了5μ1血清。泳道(e)顯示了由通過丙酮沉淀法處理的SPM的結果，其證實了所有的SPM成分被有效去除。然而，在顯示了添加SPM的血清的結果的泳道(c)中，除了SPM中分子量6，000的成分以外的成分也由于丙酮沉淀法而缺失，從而未被測得。這提示SPM結合至載體蛋白并與其一同被去除，盡管血清已經通過7M脲/2M硫脲稀釋。如圖5所示，血清中兩種主要的肽(分子量14，000和17，000)以及事先添加至血清的SPM由于采用丙酮沉淀法進行的肽提取而損失，這表明載體蛋白結合的肽無法通過丙酮沉淀法提取。特別地，丙酮沉淀法已顯示難以以保留其數量信息的方式提取血清中存在的肽。比較實施例2與常規方法(超濾法)的比較超濾法是一種采用允許等于或小于特定大小的分子通過而更大的分子無法通過的超濾膜提取肽的方法。當血清通過超濾膜過濾時，理想情況下蛋白不能通過該過濾膜而被提取，而僅有肽通過該膜。因此，僅有肽成分可作為濾出液被分離。超濾法是一種便捷的高通量方法，因此常用于血清和血漿的肽提取。超濾法步驟在本比較實施例中，該超濾法可參照Tirumalai等人或Harper等人(參考文獻2和6)的方法來實施。圖8顯示了超濾法的流程圖。該超濾膜在洗滌后使用。洗滌可通過如下方式進行將25mM重碳酸銨/20%乙腈放在超濾膜(MICR0C0NYM-30,由Millipore公司生產，截留分子量30，000)上，并輕柔攪拌該混合物，然后3，OOOXg離心5分鐘，隨后去除濾出液。混合SPM的血清和未混合的血清被用作評估肽提取效率的樣本。通過將血清與25mM重碳酸銨/20%乙腈按15的比例混合來稀釋血清。將稀釋的血清放置在如上洗滌的超濾膜上，并在4°C下3，OOOXg離心15分鐘。回收所得的濾出液并凍干。將凍干的產物溶解于20μ1用于PAGE的樣本緩沖液中，并通過Tricine-SDS-PAGE分析。該用于PAGE的樣本緩沖液的組成為50mMTris-HCl(pH6.8)、50mMDTT、0.5%SDS和10%甘油。用25mM重碳酸銨/20%乙腈稀釋血清的目的在于減少血清的粘度，并減少肽在過濾膜上的吸附(參考文獻6)。結果和評價圖9顯示了通過超濾法從血清提取的肽的Tricine-SDS-PAGE分析結果。圖9(A)顯示了考馬斯染色結果，而圖9(B)顯示了銀染色結果。銀染色的靈敏度比考馬斯柒色高20-30倍。泳道(Al)和(Bi)分別顯示了由4μgSPM得到的分析結果；泳道(A2)和(B2)分別顯示了由0.5μ1未處理血清得到的分析結果；泳道(A3)顯示了由通過超濾法處理的5μ1血清和4μgSPM的混合物得到的分析結果；泳道(A4)和(B3)分別顯示了由通過超濾法處理的5μ1血清得到的分析結果；泳道(Α5)和(Β4)分別顯示了由通過超濾法處理的10μ1血清得到的分析結果；而泳道(Α6)和(Β5)分別顯示了由通過超濾法處理的100μ1血清得到的分析結果。電泳圖上方的表顯示了血清的量、SPM的量以及是否經過超濾法處理。(A)基于考馬斯染色的評價泳道(A3)顯示了由經超濾處理的4μgSPM(與泳道(Al)的體積相等)和5μ1血清(是泳道(Α2)體積的10倍)的混合物得到的結果。它顯示了蛋白和SPM被完全去除，因為它們未被測得。此外，泳道(Α4)、(Α5)和(Α6)分別顯示了經過超濾法處理的5μ1、10μ1和100μ1血清所得的結果。在所有這些泳道(Α4)、(Α5)和(Α6)中，蛋白和肽均未被測得。這些結果證實了超濾法具有極高的蛋白去除效率，但具有極低的肽提取效率。(B)基于銀染色的評價泳道(Β3)、(Β4)和(Β5)分別顯示了經過超濾法處理的5μ1、10μ1和100μ1血清所得的結果。肽僅在泳道(Β5)中的100μ1處理的血清中測得。通過泳道(Β5)和泳道(Β2)(0.5μ1未處理血清)的比較，可以看到泳道(Β5)中的蛋白被完全去除。此外，對肽成分進行比較時，在體積為泳道(Β5)血清體積1/200的泳道(Β2)中測得了更多的條帶，顯示超濾法的肽提取效率為0.5%或更低。(A)和⑶的結果證明超濾法可以完全去除蛋白，但僅有0.5%或更低的極差的肽提取效率。已知蛋白會由于吸附至超濾膜而損失。因此，超濾法極差的肽提取效率可能的原因是大部分肽由于吸附至超濾膜而無法通過超濾膜以及載體蛋白結合肽與載體蛋白在膜上的濃縮而導致的。討論(本發明方法、丙酮沉淀法和超濾法的比較)從血清和SPM的混合物提取肽，然后通過Tricine-SDSPAGE分析，以考察肽提取法的蛋白去除效率，并基于SPM殘留量評估它們的肽提取效率。在常規丙酮沉淀和超濾法中，盡管這些常規方法具有高蛋白去除效率，但除了通過丙酮沉淀法提取了SPM中分子量6，000的肽這一唯一例外，大部分SPM成分都損失了。損失SPM的可能原因在于，在丙酮沉淀法中，載體蛋白吸收的肽無法回收，而在超濾法中，大部分肽由于超濾膜以及無法回收的情況而損失。為了解決這些問題，開發了本發明的方法并通過(I)Tricine-SDS-PAGE和(2)反相HPLC評估了它的蛋白去除效率和肽提取效率。此外，通過(3)Tricine-SDS-PAGE評估了本發明的方法的重現性。此外，進行了(4)通過本發明方法提取的主要的肽的鑒定。如(I)Tricine-SDS-PAGE的結果所示，本發明的方法具有高蛋白去除效率，并可以回收通過常規方法無法回收的所有SPM成分。這證明了本發明的方法可以高效提取肽，而不受載體蛋白影響。(2)反相HPLC的結果還證明了本發明的方法具有高蛋白去除效率，并可以檢測許多肽峰并有效地提取肽。此外，(3)Tricine-SDS-PAGE的結果證明了本發明的方法可以以高重現性提取肽。此外，(4)通過本發明方法提取的主要的肽的鑒定證明了即使僅就主要的成分而言，許多肽存在于通過本發明方法獲得的提取物中，且該提取物包含了具有不同體內信息的蛋白片段。進一步證明了本發明的方法可以去除99.7%的白蛋白(血清的主要蛋白成分)，并可有效提取僅有血清中白蛋白體積1/2000的載脂蛋白C-II。由于本發明采用了有機溶劑和酸，人們擔心蛋白可被本發明的方法裂解而人工形成其片段。然而，由于SPM可以極高效率提取，這種可能性并不存在。此外，試劑4中的氫氯酸的可能影響也被消除了，因為即使在120mM的氫氯酸濃度下也未觀察到裂解。這些結果表明，根據本發明獲得了具有高蛋白去除效率并以保留肽的定量信息的方式高效高重現性地提取肽(包括載體蛋白吸附的肽)的方法。這些結果總結于圖10中。通過泳道3、8和13之間的比較可見，即使SPM也可通過本發明的方法有效回收。相反地，SPM幾乎無法通過丙酮沉淀(A)和超濾(F)法回收。此夕卜，血清中載體蛋白吸附的SPM可能被丙酮沉淀和超濾法隨該載體蛋白一同去除。還顯示在本發明的方法中，提取了SPM以外的大量血清衍生肽。此外，由泳道4、9和14之間的比較可見，本發明的方法具有比丙酮沉淀或超濾法高得多的血清衍生肽回收率。參考文獻[1]Fukutomi等人“Asimplemethodforpeptidepurificationasabasisforpeptidomeanalysis，，，(J.Electrophoresis4915,2005)[2]TirumalaiRS,ChanKC,PrietoDA,IssaqHJ,ConradsTP,VeenstraTD."CharacterizationoftheLowMolecularWeightHumanSerumProteome.，，(M01.Cell.Proteomics2003；21096-103)[3]KogaS,JapaneseJournalofClinicalMedicine,53,extraissue,654,1995[4]MatsuoT禾口NishiN,LectureonNewChemicalExperiments,1,ProteinISeparation/Purification/Properties,3章ExtractionMethodsforUnconventionalProteins禾口第7章FractionalPrecipitation[5]ChertovO,BiragynA,KwakLW,SimpsonJT,BoroninaT,HoangVM,PrietoDA,ConradsTP,VeenstraTD,FisherRJ.“Organicsolventextractionofproteinsandpeptidesfromserumasaneffectivesamplepreparationfordetectionandidentificationofbiomarkersbymassspectrometry.，，(Proteomics2004；41195-203)[6]HarperRG,WorkmanSR,SchuetznerS,TimpermanAT,SuttonJN.“Low-mo1ecu1ar~weighthumanserumproteomeusingultrafiltration,isoelectricfocusing,andmassspectrometry.，，(Electrophoresis2004；251299-306)[7]SchaggerH,vonJagow,G.“Tricine-sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1to1OOkDa".(Anal.Biochem.1987；166368-379)工業適用性本發明的方法可以有效提取那些難以提取的載體蛋白所結合的低分子量蛋白/肽。因此，本發明的方法允許通過各種色譜技術、質譜、電泳、NMR、ESR、各種光譜技術等來分析體液樣本，特別是血清和血漿中的低分子量蛋白等。特別地，本發明地方法可廣泛應用于醫療領域，例如針對血清或血漿等中的低分子量蛋白等的診斷、診斷標記物篩選以及藥物開發。此外，本發明的方法可容易地進行自動化，從而允許開發用于血液中的低分子量蛋白等的自動化分析儀。圖1為顯示實施實施例1的步驟的流程圖；圖2為顯示了用Tricine-SDS-PAGE分離實施例1所得的提取溶液，隨后進行考馬斯染色的結果的圖；圖3為顯示了通過實施例1的方法提取的樣本經反相HPLC分析的結果的數據；圖4為顯示了體現本發明方法的提取重現性的Tricine-SDS-PAGE的圖；圖5為顯示了用Tricine-SDS-PAGE分離實施例1的方法處理的血清樣本所得的提取溶液，隨后進行考馬斯染色的結果的圖；在每個條帶中鑒定了肽等；圖6顯示了比較實施例1中開展的丙酮沉淀法的流程圖；圖7為顯示了通過丙酮沉淀法從血清提取的肽經Tricine-SDS-PAGE分離后進行考馬斯染色的結果的圖；圖8顯示了比較實施例2中實施的超濾法的流程圖；圖9為顯示了通過超濾法從血清提取的肽經Tricine-SDS-PAGE分離后進行考馬斯染色的結果的圖；而圖10顯示了基于Tricine-SDS-PAGE結果對本發明的方法、丙酮沉淀法和超濾法的作用進行比較的結果。權利要求提取包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽的方法，所述方法包括如下步驟(a)向所述體液樣本中添加含有脲和硫脲的試劑1和含有還原劑的試劑2，將其混合，然后將所述混合物滴入含有90％或更多有機溶劑的試劑3，將其混合；(b)低溫攪拌步驟(a)中所得的混合溶液；(c)低溫離心步驟(b)中所得的攪拌溶液并去除上清液；(d)將含有有機溶劑和酸的試劑4添加至步驟(c)中所得的沉淀，將其混合；(e)低溫攪拌步驟(d)中所得的混合溶液；以及(f)低溫離心步驟(e)中所得的攪拌溶液并回收上清液。2.如權利要求1所述的方法，進一步包括步驟(g)凍干步驟(f)中回收的上清液。3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述試劑2中的還原劑選自二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、三羧基膦(TCEPHCl)、三丁基膦(TBP)、2_巰基乙醇(2_ME)、2_巰基乙醇胺(2-MEA)及其混合物。4.如權利要求1或2所述的方法，其中所述體液樣本為血清或血漿。5.如權利要求1、2或3所述的方法，其中試劑1中脲的濃度為1-8M，硫脲濃度為0.5-3M，而試劑2包含的還原劑的量使得在體液樣本、試劑1和試劑2的混合物中所述還原劑的濃度為lmM-20mM。6.如權利要求5所述的方法，其中試劑1的脲濃度為3-8M，硫脲濃度為1-3M。7.如權利要求5或6所述的方法，其中當試劑2中的還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、2-巰基乙醇(2-ME)、或2-巰基乙醇胺(2-MEA)時，試劑2中還原劑的量使得在體液樣本、試劑1和試劑2的混合物中該還原劑的濃度為5mM-20mM，或當所述還原劑為三(2-羧乙基)膦HC1(TCEPHCl)或三正丁基膦(TBP)時，試劑2包含的還原劑使得在體液樣本、試劑1和試劑2的混合物中該還原劑濃度為ImM-lOmM。8.如權利要求1、2或3所述的方法，其中試劑3中的有機溶劑選自丙酮、乙醇、甲醇、2-丙醇、乙腈及其混合物。9.如權利要求8所述的方法，其中試劑3中的有機溶劑為丙酮。10.如權利要求8或9所述的方法，其中試劑3包含濃度為95%或更高的有機溶劑。11.如權利要求8或9所述的方法，其中試劑3包含濃度為98%或更高的有機溶劑。12.如權利要求1所述的方法，其中試劑4中的有機溶劑選自乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇及其混合物，且濃度為50-99%，而所述酸選自氫氯酸、三氟乙酸(TFA)、甲酸、乙酸和三氯乙酸(TCA)。13.如權利要求12所述的方法，其中試劑4中的有機溶劑為乙腈。14.如權利要求12或13所述的方法，其中試劑4中的酸為氫氯酸，且濃度為5mM-500mM。15.如權利要求12、13或14所述的方法，其中試劑4中有機溶劑的濃度為60-80%。16.如權利要求12、13或14所述的方法，其中試劑4中有機溶劑的濃度為65-75%。17.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(b)中，由步驟(a)所得的混合溶液在-20°C至10°C的低溫下攪拌1分鐘或更長時間。18.如權利要求17所述的方法，其中在步驟(b)中，由步驟(a)所得的混合溶液在0°C至5°C的低溫下攪拌60分鐘或更長時間。19.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(e)中，由步驟(d)所得的混合溶液在_5°C至20°C的低溫下攪拌1分鐘或更長時間。20.如權利要求19所述的方法，其中在步驟(e)中，由步驟(d)所得的混合溶液在0°C至5°C的低溫下攪拌60分鐘或更長時間。21.制備包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽的分析樣本的方法，所述方法包括向根據權利要求2所述的方法獲得的凍干產品中添加含有成分的試劑5，所述成分選自TFA、氫氯酸、甲酸、乙酸和TCA。22.如權利要求21所述的方法，其中試劑5包含0.1-20%的TFA。23.如權利要求21或22所述的方法，其中試劑5包含0.1_20%的甲酸、乙酸、TCA或其混合物。24.用于提取包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽的試劑盒，其中所述試劑盒包括含有脲或硫脲的試劑1、含有還原劑的試劑2、含有90%或更多的有機溶劑的試劑3、以及含有有機溶劑和酸的試劑4。25.如權利要求24所述的試劑盒，其中試劑1的脲濃度為1-8M，硫脲濃度為0.5-3M；試劑2所含的還原劑的量使得在體液樣本、試劑1和試劑2的混合物中該還原劑的濃度為lmM-20mM；試劑3中的有機溶劑選自丙酮、乙醇、甲醇、2-丙醇、乙腈及其混合物；試劑4中的有機溶劑選自乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇及其混合物，且濃度為50-99%；并且所述酸選自氫氯酸、TFA、甲酸、乙酸和TCA。26.如權利要求24所述的試劑盒，其中試劑1的脲濃度為3-8M，硫脲濃度為1-3M；當試劑2中的還原劑為二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、2_巰基乙醇(2-ME)或2-巰基乙醇胺(2-MEA)時，試劑2所含的還原劑的量使得在體液樣本、試劑1和試劑2的混合物中該還原劑的濃度為5mM-20mM，或者當所述還原劑為三(2-羧乙基)膦HCl(TCEPHCl)或三正丁基膦(TBP)時，試劑2所含的還原劑的量使得在體液樣本、試劑1和試劑2中該還原劑的濃度為ImM-IOmM；試劑3中的有機溶劑為丙酮，且濃度為98%或更高；而試劑4中的有機溶劑為乙腈，且濃度為60-80%。27.用于制備包含在體液樣本中的低分子量蛋白/肽的分析樣本的試劑盒，其中所述試劑盒包括含有脲和硫脲的試劑1，含有還原劑的試劑2，含有90%或更多的有機溶劑的試劑3，含有有機溶劑和酸的試劑4，并進一步包括含有成分的試劑5，試劑5被添加至通過權利要求2所述的方法獲得的凍干產品中，且所述成分選自TFA、氫氯酸、甲酸、乙酸和TCA。全文摘要本發明提供了提取體液樣本(特別是血清或血漿)中包含的低分子量蛋白/肽的方法。本發明的方法包括步驟(a)至(e)(a)向該體液樣本中添加含有脲和硫脲的試劑1和含有還原劑的試劑2，將其混合，然后將該混合物滴入含有90％或更多有機溶劑的試劑3，并將其混合；(b)低溫攪拌步驟(a)中所得的混合溶液；(c)低溫離心步驟(b)中所得的攪拌溶液并去除上清液；(d)將含有有機溶劑和酸的試劑4添加至步驟(c)中所得的沉淀，將其混合；(e)低溫攪拌步驟(d)中所得的混合溶液；以及(f)低溫離心步驟(e)中所得的攪拌溶液并回收上清液。文檔編號G01N1/28GK101821618SQ20088011053公開日2010年9月1日申請日期2008年8月8日優先權日2007年8月8日發明者前田忠計,小寺義男,川島祐介申請人:學校法人北里研究所