免疫原性鏈球菌蛋白質的制作方法

專利名稱：：免疫原性鏈球菌蛋白質的制作方法免疫原性鏈球菌蛋白質本發明涉及醫藥領域。更具體地說，本發明涉及免疫原性鏈球菌蛋白質及其免疫原性部分、衍生物和類似物。鏈球菌屬包含多種病原和共生革蘭氏陽性細菌，在包括人、馬、豬和牛的多種宿主中可以發現這些細菌的存在。在宿主中，經常可見到鏈球菌聚居在上呼吸道粘膜表面。但在某些情況下，鏈球菌也會導致亞急性到急性甚至是慢性的疾病。到目前為止，許多抗鏈球菌的商品疫苗是基于全細胞細菌。通常這類細菌對同源血清型攻擊的確能夠產生顯著的保護作用，但是對異源血清型攻擊沒有保護作用。接種全細胞鏈球菌一般能夠導致針對同樣的鏈球菌菌株的免疫反應，但不能(有效地)抗其他鏈球菌菌株，更不用說其他鏈球菌血清型。因此，許多疫苗不能提供對異源菌株和/或血清型的有效保護，因為抗一種鏈球菌菌株的免疫接種通常不能有效地抵抗另一種鏈球菌菌株感染。并且，抗一種鏈球菌血清型的接種通常不能有效抵抗另一種鏈球菌血清型感染。因此，需要能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株，優選抗兩種鏈球菌血清型的免疫反應的免疫原性組合物。本發明目的在于提供能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株的免疫反應的鏈球菌蛋白質及其免疫原性部分、衍生物和/或類似物，以及編碼它們的核酸分子。本發明提供了鑒定能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株的免疫反應的鏈球菌蛋白質的方法，所述方法包括a)鑒定分泌蛋白、表面相關蛋白和/或與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白的至少一部分；b)挑選步驟a)中鑒定到的在至少兩種鏈球菌菌株中保守的至少一種蛋白；和c)確定步驟b)中挑選的至少一種蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物是否能夠特異結合被第一鏈球菌菌株感染的動物的抗體和/或免疫細胞，以及被第二鏈球菌菌株感染的動物的抗體和/或免疫細胞。所述第一鏈球菌菌株和所述第二鏈球菌菌株優選是相同的鏈球菌菌種。優選地，所述與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白質與細菌毒力因子具有至少60%、更優選至少70%、更優選至少75%、最優選至少80%的序列同一性。根據本發明，鑒定到了至少一種能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株的免疫反應的鏈球菌蛋白質。所述蛋白適合免疫個人和/或非人動物因為它能夠引發廣泛的免疫反應。因此，本發明排除了針對每一種鏈球菌菌株和/或血清型提供疫苗的需要。所以使用本發明的免疫原性鏈球菌蛋白能夠節約時間和金錢。更重要的是，本發明的免疫原性鏈球菌蛋白理論上來說能夠引發抗未知鏈球菌菌株，或者還沒有針對其的特異疫苗的鏈球菌菌株(例如自然界中近期發生進化的菌株)的免疫反應。優選地，本發明的鏈球菌蛋白能夠引發抗至少兩種鏈球菌血清型的免疫反應。因此本發明的優選實施方案提供了鑒定能夠引發抗至少兩種鏈球菌血清型的免疫反應的鏈球菌蛋白的方法，所述方法包括a)鑒定分泌蛋白、表面相關蛋白和/或與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白的至少一部分；b)挑選步驟a)中鑒定到的在至少兩種鏈球菌血清型中保守的至少一種蛋白；和c)確定步驟b)中挑選的至少一種蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物是否能夠特異結合被第一鏈球菌血清型感染的動物的抗體和/或免疫細胞，以及被第二鏈球菌血清型感染的動物的抗體和/或免疫細胞。抗至少兩種鏈球菌菌株和/或鏈球菌血清型的免疫反應在本文中定義為針對至少兩種不同菌株和/或血清型鏈球菌的體液和/或細胞免疫反應。所述免疫反應在例如非人動物中引發。也可能為了預防和/或抵抗鏈球菌相關的疾病，在人類個體中引發對至少兩種不同鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應。體液免疫反應導致產生抗體，而細胞免疫反應主要增加比如T殺傷細胞的反應性免疫細胞的形成。一般來說，免疫反應的這兩個部分是由給與免疫原性蛋白或其免疫原性部分引發的。抗至少兩種鏈球菌菌株/血清型的免疫反應優選包含抗體的產生。所述免疫反應優選能夠至少部分地減少人類個體和/或非人動物內地鏈球菌生物體的數量。所述免疫反應進一步優選能夠至少部分抵抗鏈球菌導致的疾病。正如本領域公知的，鏈球菌菌株能通過其形態、生化和血清學特點進行鑒定。鏈球菌血清型是以特異抗原性多糖為分類基礎的一組鏈球菌。鏈球菌的血清型分類也是本領域公知的。本發明的方法包含鑒定分泌蛋白、表面相關蛋白和/或與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白的至少一部分。所述蛋白通過各種途徑鑒定。在發明的一個實施方案中，利用了基因組學方法。例如通過搜索所述分泌蛋白和/或表面相關蛋白的基元來鑒定編碼分泌蛋白和/或表面相關蛋白的基因。所述基元優選包含脂類附著位點，信號肽酶切割位點和/或分選酶(sortase)附著位點。當然，搜索本領域已知的其他基元也是可能的。因此發明的一個實施方案提供了本發明的方法，其中通過在鏈球菌的至少部分基因組序列中識別出包含分泌和/或表面相關蛋白的基元的基因來鑒定所述分泌蛋白和/或表面相關蛋白。此外，或者替代地，通過本領域已知的一種或多種其它方法來鑒定編碼分泌蛋白和/或表面相關蛋白的基因。例如，一旦知道了一種鏈球菌中編碼分泌蛋白和/或表面相關蛋白的基因，就可以篩選另一種鏈球菌基因組序列中存在的高％序列同一性的基因。在一個實施方案中，這類篩選方法包括這樣的方法，該方法中篩選另一種鏈球菌基因組序列與編碼鏈球菌分泌蛋白和/或表面相關蛋白的核苷酸序列雜交的能力。因此根據發明，本發明提供了一種方法，其中所述與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白是通過在鏈球菌的至少部分基因組序列中鑒定這樣的基因而鑒定到的，所述基因能夠與圖4中列出的任一核酸序列在pH7.2的含有0.5M磷酸鈉、ImMEDTA和7%十二烷基硫酸鈉的緩沖液中于65°C雜交，其中核酸分子在用含有40mM磷酸鈉(pH7.2)、lmMEDTA和5%十二烷基硫酸鈉的緩沖液于65°C漂洗30分鐘兩次；并用含有40mM磷酸鈉(pH7.2)UmMEDTA和十二烷基硫酸鈉的緩沖液于65°C漂洗30分鐘兩次后仍然保持雜交。優選地，所述與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白與細菌毒力因子具有至少60%、更優選至少70%，更優選至少75%，最優選至少80%序列同一性。現有技術還提供了多種方法可以確定鏈球菌蛋白與細菌毒力因子是否有至少50%序列同一性。例如，將鏈球菌蛋白的氨基酸序列與細菌毒力因子的氨基酸序列進行比較。采用基因組學方法也是可能的。例如通過篩選鏈球菌基因組序列中與編碼毒力因子的細菌基因具有至少50%序列同一性的核苷酸序列鑒定到與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的鏈球菌蛋白的編碼基因。因此發明的一個實施方案提供了本發明的方法，其中所述與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白是通過在鏈球菌的至少部分基因組序列中鑒定與細菌毒力因子基因具有至少50%序列同一性的基因而鑒定到的。但是，許多替代的確定鏈球菌蛋白與細菌毒力因子是否具有至少50%序列同一性的方法也是本領域已知的。一旦鑒定到編碼分泌蛋白、表面相關蛋白和/或與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白的至少一個鏈球菌基因，優選確定所述基因中是否有至少一個在至少兩種鏈球菌菌株中是保守的。如果第二鏈球菌菌株的基因組包含與第一鏈球菌菌株所述基因具有至少60%序列同一性的核酸序列，則所述第一鏈球菌菌株的該基因在至少兩種鏈球菌菌株中是保守的。優選地，所述核酸序列與所述基因具有至少75%、更優選至少80%，更優選至少90%，最優選至少95%序列同一性。術語"序列同一性"是指兩個核酸序列或氨基酸序列間的相同度百分比。當將兩個核酸序列進行比對，并在必要時引入空位以實現最大序列同一性百分比后，所述序列顯示至少60%的序列同一性，則這兩個核酸序列相互具有至少60%的序列同一性。用于比對的方法和計算機程序是本領域公知的。可以用于或者改編用于確定候選序列是否落在這個定義范疇內的一個計算機程序是版權屬于Genentech，Inc.的“Align2”，該程序于1991年12月10日與用戶文件(userdocumentation)提交至美國版權局，Washington,D.C.20559。根據本發明的一個實施方案，如果發明所述基因在至少兩種鏈球菌菌株中是保守的，則該基因所編碼的蛋白是用于評估所述蛋白、或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物是否能夠引發抗一種以上鏈球菌菌株的免疫反應的良好候選物。優選所述第一鏈球菌菌株和所述第二鏈球菌菌株屬于相同的鏈球菌物種。優選地，為了鑒定到(由所述基因編碼的)好的候選蛋白，所述蛋白被用于檢測其引發抗一種以上鏈球菌血清型的免疫反應的能力，需確定所述基因是否在至少兩種鏈球菌血清型中是保守的。因此優選進一步包括挑選在兩種鏈球菌菌株和/或血清型中保守的基因的發明方法。一經鑒定到在至少兩種鏈球菌菌株/血清型中保守的基因，優選獲取由所述基因編碼的蛋白。此外，或者替代地，可以獲取所述蛋白的免疫原性部分、衍生物和/或類似物。現有技術提供了多種方法可以獲取基因所編碼的蛋白、其免疫原性部分、衍生物和/或類似物。例如通過合適的表達系統對所述基因進行表達。表達系統的非限制性實例包括諸如酵母等真核宿主細胞和諸如大腸桿菌等原核宿主細胞。優選地，在原核表達系統中表達發明所述編碼分泌蛋白、表面相關蛋白和/或與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白的基因，該基因在至少兩種鏈球菌菌株中是保守的。優選原核表達系統是因為理論上(原核的)鏈球菌的蛋白在原核表達系統中能夠更好地表達。并且，原核表達系統通常更容易建立和使用。本發明的方法包括確定發明的至少一種蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物是否能夠與被第一鏈球菌菌株感染的動物的抗體和/或免疫細胞，以及被第二鏈球菌菌株感染的動物的抗體和/或免疫細胞特異結合。優選地，確定發明的至少一種蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物是否能夠與被第一鏈球菌血清型感染的動物的抗體和/或免疫細胞，以及被第二鏈球菌血清型感染的動物的抗體和/或免疫細胞特異結合。本領域已知許多實施這類檢測的方法。優選地，使用感染了至少兩種不同鏈球菌菌株的至少兩只動物的血清。替代地，僅使用一只動物的血清，所述動物感染了至少兩種不同鏈球菌菌株。根據一個實施方案，一個非人動物感染了至少第一鏈球菌菌株和/或血清型，第二非人動物感染了至少第二鏈球菌菌株和/或血清型。所述鏈球菌菌株和/或血清型通過例如靜脈內給予所述動物。根據一個實施方案，隨后采集包含鏈球菌特異性抗體和/或免疫細胞的動物的血清。任選將所述血清在使用前進行處理。例如，將抗體和/或免疫細胞至少部分濃縮和/或分離。優選本發明的蛋白質和/或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物是分離的和/或重組產生的，并隨后與來源于所述動物的所述血清、或者(部分)分離的抗體和/或免疫細胞進行溫育。可以將來源于第一動物的血清、抗體和/或免疫細胞與來源于第二動物的血清、抗體和/或免疫細胞一起給予。替代地，先給予來源于第一動物的血清、抗體和/或免疫細胞，之后加入來自第二動物的血清、抗體和/或免疫細胞。再一個實施方案中，將第一動物的血清、抗體和/或免疫細胞給予包含至少一種本發明蛋白和/或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物的一種獨立混合物(S印aratebatch)，將第二動物的血清、抗體和/或免疫細胞給予包含至少一種本發明蛋白和/或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物的另一混合物。溫育后，將所述血清、抗體和/或免疫細胞洗去，利用本領域已知的任何方法使結合的抗體和/或免疫細胞顯像。例如將結合抗體與能夠特異結合所述結合抗體的第二抗體一起溫育，所述第二抗體偶聯了辣根過氧化物酶。未發生結合的第二抗體被洗去后，加入過氧化氫。過氧化氫被辣根過氧化物酶降解偶聯著發光化合物的氧化，由此使得反應可視。如果本發明的蛋白和/或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物似乎與由第一鏈球菌菌株引發的抗體和/或免疫細胞，并與由第二鏈球菌菌株引發的抗體和/或免疫細胞特異結合，這表明所述蛋白、免疫原性部分、衍生物和/或類似物能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株的免疫反應。在一個優選實施方案中，使用了來源于感染了鏈球菌的動物的恢復期血清(convalescentserum)的抗體和/或免疫細胞。恢復期血清來源于已經有效地抵抗了感染的動物。這樣，感染了鏈球菌的動物的恢復期血清包含能夠保護所述動物免于相同鏈球菌菌株攻擊的抗體和/或免疫細胞。因此，為了確定本發明的蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物是否能夠引發保護性免疫反應，優選與恢復期培養基進行溫育。因此發明的一個實施方案提供了鑒定能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株的免疫反應的鏈球菌蛋白的方法，所述方法包括-獲得分離的和/或重組的鏈球菌蛋白；-將所述蛋白與感染了第一鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞，以及感染了第二鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞進行溫育，和-確定蛋白是否能夠與感染了第一鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞，以及感染了第二鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞結合。鏈球菌蛋白質通過多種途徑獲得。優選地，從鏈球菌培養物中分離分泌蛋白、表面相關蛋白和/或與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白。在一個實施方案中，用例如溶菌酶從鏈球菌中剝離表面相關蛋白。在一個實施方案中，利用編碼至少一種所述蛋白的至少一個核酸序列重組產生鏈球菌蛋白。如上文解釋的，優選使用編碼分泌蛋白、表面相關蛋白和/或與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白的基因。更優選地，所述基因在至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型中是保守的。替代地，或者另外地，鏈球菌蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物是利用本領域已知的另一種方法產生的。例如，利用常見的合成技術，比如固相合成產生免疫原性鏈球菌蛋白或肽。作為另外一個例子，從鏈球菌中分離鏈球菌蛋白，或者重組制備，之后進行修飾以便產生免疫原性部分、衍生物和/或類似物。在一個優選實施方案中，在聚丙烯酰胺凝膠上分離鏈球菌蛋白，隨后與感染了第一鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞，以及感染了第二鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞進行溫育。優選使用二維聚丙烯酰胺凝膠。在優選實施方案中，鑒定到的鏈球菌蛋白能夠引發調理吞噬(opsonophagocytosis)誘導性抗體。調理吞噬是一個自然過程，在這個過程中微生物被調理素調理，之后所述微生物被吞噬細胞吞噬并殺死。許多微生物需要被調理素調理以提高對它們的吞噬作用。調理作用是一個使得微生物更容易被吞噬細胞攝入的過程。在這個過程中，調理抗體和/或蛋白結合到所述微生物上，從而促進該微生物被所述吞噬細胞的攝入。因此，優選能夠引發調理吞噬誘導性抗體的發明所述鏈球菌蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物，因為將這類蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物給予動物會導致在所述動物中存在能夠吞噬鏈球菌的調理吞噬誘導性抗體。本發明的鏈球菌蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應。為了引發更廣泛的免疫反應，優選鑒定至少兩種不同鏈球菌蛋白和/或所述蛋白中至少一個的免疫原性部分、衍生物和/或類似物。更優選地，鑒定至少三種不同鏈球菌蛋白、和/或所述蛋白中至少一個的免疫原性部分、衍生物和/或類似物等等。鑒定到的本發明的鏈球菌蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物的數目越高，越能引發更廣泛的免疫反應。在另一個優選實施方案中，鑒定到至少一種符合本發明的鏈球菌蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物，它們能夠引發抗至少三種鏈球菌菌株的免疫反應。所述蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物尤其適用于中人類個體和/或非人動物中引發廣泛的免疫反應。更優選地，鑒定到至少一種符合本發明的鏈球菌蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物，它們能夠引發抗至少三種鏈球菌血清型的免疫反應。蛋白質的免疫原性部分定義為能夠在人類個體和/或非人動物中引發免疫反應的蛋白質的一部分。優選所述免疫原性部分能夠引發的免疫反應與所述蛋白引發的在種類上相同，但不一定在量上相同。蛋白質的免疫原性部分優選包含所述蛋白的一或多個表位。蛋白質的表位定義為所述蛋白的一部分，該部分至少約5個氨基酸長，能夠誘發能特異結合所述表位的特異抗體和/或免疫細胞。存在兩種不同的表位線性表位和構象表位。線性表位包含一段連續的氨基酸。構象表位是由正確折疊的蛋白中幾段連續的氨基酸折疊至一定位置，共同形成表位。本發明的免疫原性部分可以包含一類或者這兩類表位。蛋白質的免疫原性部分包含至少5個氨基酸殘基。優選所述免疫原性部分包含至少10個、更優選至少15個、更優選至少25個，最優選至少30個連續氨基酸。取決于免疫原性部分所來源的蛋白質的類型，所述免疫原性部分優選最多包含500個氨基酸殘基，更優選最多250個氨基酸殘基。蛋白質的衍生物定義為具有類型相同，量不一定相同的免疫原性性能的分子。本領域技術人員能夠改變一個蛋白質從而使得與所述蛋白相比，所述分子的免疫原性性能基本上是相同類型，但不一定等量。蛋白質的衍生物是通過例如將所述蛋白的至少一個氨基酸殘基突變和/或通過將一個氨基酸殘基取代為另一個氨基酸殘基而提供的。優選進行的是保守氨基酸取代，例如將包含酸性側鏈的氨基酸取代為另一個包含酸性側鏈的氨基酸、將體積大的氨基酸取代為另一個體積大的氨基酸、將包含堿性側鏈的氨基酸取代為另一個包含堿性側鏈的氨基酸等等。本領域技術人員完全能夠制備蛋白質的類似化合物。這是通過例如篩選肽文庫或者借助肽改變程序。本發明所述的類似物具有與所述蛋白質類型基本相同，但量不一定相同的免疫原性性能。本發明的蛋白質的類似物包含例如融合蛋白和/或嵌合蛋白。為了能夠引發免疫反應，優選本發明所述的免疫原性部分、衍生物和/或類似物具備適宜的特點從而能夠保證抗體和/或免疫細胞的產生。所述特點是本領域公知的，例如包括合適的旁側序列和/或蛋白酶水解切割位點。替代地或者另外的，本發明所述的蛋白質、免疫原性部分、衍生物和/或類似物優選帶有免疫原性載體。本發明所述的蛋白質或免疫原性部分、衍生物和/或類似物一旦被給予人類個體或非人動物，通常會有因多種不同原因而被降解的危險，比如象蛋白酶水解、解折疊、極端PH值、去污劑和高鹽濃度。為了延長蛋白質或者其免疫原性部分、衍生物和/或類似物的壽命，優選增強其抵抗降解的能力，例如為了保持其天然的電荷特征，通過合成帶有C末端氨甲酰的肽和/或將肽的N末端乙酰化。在一個實施方案中，通過將本發明所述的蛋白質或免疫原性部分、衍生物和/或類似物突變，從而至少部分地抑制使得所述蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物容易自溶的局部解折疊過程，由此進一步提高它們的抗降解能力。穩定化突變策略是已知的，例如Matthews(1991)，Alber(1991)，VriendandEijsink(1993)以及FershtandSerrano(1993)描述過。分泌蛋白定義為在細胞和/或生物體中天然產生的并且至少部分從所述細胞和/或生物體中分泌到環境中的蛋白質。因此，如果培養鏈球菌，分泌蛋白至少部分，至少在某個時刻存在于至少部分培養基中。分泌蛋白不需要是連續產生和/或分泌的。例如分泌蛋白可以是僅在細菌生命周期的某個時期產生和/或分泌的。并且，分泌蛋白的產生和分泌不必同時發生。例如，某些分泌蛋白先在細胞內積累，然后晚些時候分泌。表面相關蛋白定義為天然形成細胞表面一部分的，或者附著到細胞表面的蛋白質。如果所述表面相關蛋白是附著到細胞表面的，可以說直接或者間接附著。間接附著包括例如存在至少一個連接分子。術語“分離的蛋白”是指至少部分與其天然環境脫離的蛋白質，和/或缺少自然界中通常與它相關聯的序列的至少一部分的蛋白質。術語“重組蛋白”是指通過分離的和/或人工表達系統，優選利用編碼所述蛋白質的核酸序列產生的蛋白質。所述核酸序列優選可操縱地連接著至少一個調控序列，比如象啟動子、增強子和/或終止子。優選所述調控序列是可誘導的，從而有可能控制所述蛋白的表達程度。在一個實施方案中，所述核酸序列包含外源核酸序列。外源核酸序列是存在于生物體基因組的某個所述核酸序列不天然存在的位置的核酸序列。通過本發明的方法鑒定到能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的鏈球菌蛋白后，優選制備所述蛋白。產生的蛋白質適用于例如生產免疫原性組合物和/或在動物中引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應。正如上文所概括的，本領域已知有多種方法可以制備蛋白質，比如例如重組制備。因此本發明提供了通過發明所述方法鑒定到的至少一種蛋白質的制備方法。同時還提供了能通過發明所述方法獲得的能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的鏈球菌蛋白。符合本發明的鏈球菌蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物尤其適用于制備免疫原性組合物。所述免疫原性組合物能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株的廣泛的體液和/或細胞免疫反應。優選利用能夠引發抗至少兩種鏈球菌血清型的免疫反應的鏈球菌蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物來制備免疫原性組合物，從而能夠實現抗至少兩種鏈球菌血清型的廣泛免疫反應。因此發明還提供了通過發明所述方法獲得的蛋白質或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物在制備能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的免疫原性組合物中的用途，以及能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含可由發明所述方法獲得的至少一種分離的和/或重組的蛋白，或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物。為了提供更廣泛的保護，優選利用至少兩種或更多種發明所述的蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物來制備免疫原性組合物。在一個實施方案中，將符合發明的至少一種蛋白質和至少一種免疫原性部分、衍生物和/或類似物組合用于制備免疫原性組合物。除了更廣泛的保護，使用至少兩種發明所述蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物降低了產生鏈球菌生物體的逃逸突變體的機會。細菌生物體的逃逸突變體通常是在環境壓力下產生的，例如在有抗生素存在的情況下和/或有抗所述生物體的表位之抗體的情況下。由于生物群體中的天然差異，某些生物體可以躲避過所述環境壓力(比如存在所述抗生素和/或抗體的情況)的抑制效果，得以增殖。幾個不同表位同時產生逃逸突變體的機會比僅有一個表位產生逃逸突變體的機會小。因此，本發明的免疫原性組合物優選包含能通過發明所述方法獲得的至少兩個分離的和/或重組的蛋白質，和/或其至少一個免疫原性部分、衍生物和/或類似物。為了更好地避免形成逃逸突變體，本發明的蛋白質優選包含關鍵的蛋白質。就是說所述蛋白質對于鏈球菌的代謝、存活和/或增殖很重要_優選是關鍵的。這樣對于關鍵蛋白可能發生改變形成的逃逸突變體，即使有活性也會較低。表5和6包含通過發明所述方法鑒定到的優選乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)蛋白質的列表。這些蛋白質，或者至少其一個免疫原性部分、衍生物和/或類似物適用于制備本發明的免疫原性組合物。因此本文也提供了本發明的用途，其中所述蛋白選自表5和/或表6;以及本發明的免疫原性組合物，所述組合物包含至少一種表5和/或表6中列舉的分離的和/或重組的蛋白質，或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物。為了提供更廣泛的保護，所述免疫原性組合物優選包含至少兩種表5和/或表6中列舉的蛋白質，和/或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物。最優選地，所述免疫原性組合物包含至少三種表5和/或表6中列舉的蛋白質，和/或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物。在優選實施方案中，所述至少一種、至少兩種或至少三種表5和/或表6列舉的蛋白質選自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、P100、P105、表面排斥蛋白、觸發因子(ropA)以及核苷二磷酸激酶。這些蛋白質或者是被感染乳房鏈球菌的動物的血清中存在的抗體所識別，表明這些蛋白在奶牛中是體內表達的并且是免疫原性的；或者是如表5所示在至少兩個乳房鏈球菌菌株中是交叉反應性的。以上蛋白質在例如表5中進行了表征，它們的編號參照例如顯示乳房鏈球菌常見表面蛋白的非限制性實例的表1、2和3中列舉的蛋白質。圖4中進一步顯示了這些選中的推測的表面蛋白/毒力因子的核酸和氨基酸序列之非限制性實例。高度保守的、在體內表達并且是高度免疫原性的蛋白質，比如象實施例11所示的被來自感染不同菌株的奶牛的恢復期血清所識別的蛋白質尤其適用于符合本發明的免疫原性組合物。因此在更優選的實施方案中，從表5和/或表6中挑選的蛋白質包含選自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105的蛋白。最優選地，從表5和/或表6挑選的蛋白包含選自P15、P16、P54、P28、P63*P105的蛋白。正如實施例11所示，后面的選擇被所有使用的恢復期血清識別，表明這些抗原在導致各自感染的所有乳房鏈球菌中都有表達，這些抗原是在宿主發生感染的過程中表達的，而且這些抗原是高度免疫原性的。還有一個實施方案提供了能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含能通過本發明的方法獲得的至少一種蛋白質或者所述蛋白質的免疫原性部分、衍生物和/或類似物的至少一種編碼核酸分子。所述免疫原性組合物一經給予動物，即由動物的機構表達所述核酸分子，導致表達符合本發明的至少一種蛋白質和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物。所述蛋白質和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物的產生以及任選的分泌到胞外引起免疫反應。在一個實施方案中，本發明的蛋白和/或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物是重組產生的。發明提供了生產能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的免疫原性組合物的方法，所述方法包括給細胞或者另外的表達系統提供至少一種重組載體，所述至少一種載體包含的核酸序列編碼至少一種能通過本發明的方法獲得的蛋白、和/或至少一種選自表5和/或表6的蛋白，和/或所述蛋白的免疫原性部分、衍生物和/或類似物。合適的表達系統是本領域已知的。在一個實施方案中，編碼本發明的一種蛋白質或其免疫原性部分的至少一種核酸序列被表達。在另一個實施方案中，使用了編碼至少兩種蛋白質和/或免疫原性部分的至少一種核酸分子。還可以使用至少兩種核酸分子，每個核酸分子編碼一或多種符合本發明的蛋白質和/或免疫原性部分，等等。例如，一種核酸分子編碼(至少)一種蛋白質，一種核酸分子編碼(至少)一種免疫原性部分是合適的。因此核酸分子的數目以及所述核酸分子所編碼的蛋白質和/或免疫原性部分的數目有可能存在差別。本發明的核酸序列通過例如同源重組插入細胞的基因組。也有可能通過例如電穿孔隨機插入核酸序列。替代的或者另外的，將所述核酸序列置于諸如質粒載體或噬菌體載體的載體中，所述載體在選定的表達系統(比如微生物和/或細胞)中是穩定的。優選發明所述核酸序列在諸如啟動子、增強子和/或終止子的調控序列的控制下進行轉錄和翻譯。優選地，所述啟動子、增強子和/或終止子適合用于選定的表達系統。更優選地，為了能夠可控性地表達，所述調控序列是誘導型的。(BiseibutsugakuKisokoza(BasicMicrobiology),Vol.8,GeneticTechnology,KyoritsuShuppan(1990))中公開了適合各種微生物的啟動子和終止子。例如，適合埃希氏菌，更具體說適合大腸埃希氏菌的質粒載體是PBR和pUC系列的質粒，合適的啟動子包括例如Iac啟動子(β-半乳糖苷酶)、trp操縱子(色氨酸操縱子)以及tac啟動子(lac-trp雜合啟動子)以及來源于λ-faagPL或I3R的啟動子。優選的終止子包括trpA-或來源于噬菌體的rrnB核糖體終止子。適用于在鏈球菌中進行重組制備的質粒載體包括例如pHV1301(FEMSMicrobiol.Lett.26，239(1985))和pGKl(App1.Environ.Microbiol.50，94(1985))。因此本發明提供了這樣的重組核酸分子，所述核酸分子包含的核酸序列處于功能性地連接的調控序列(比如啟動子)之下，編碼至少兩種能通過發明所述方法獲得的鏈球菌蛋白質，和/或選自表5和/或表6的蛋白質，和/或至少一種所述蛋白質的免疫原性部分。還提供了分離的宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼至少兩種能通過發明所述方法獲得的鏈球菌蛋白質，和/或選自表5和/或表6的蛋白質，和/或至少一種所述蛋白質之免疫原性部分的核酸序列。所述宿主細胞優選包含原核宿主細胞。在優選實施方案中，本發明的核酸分子被用于引發抗鏈球菌的免疫反應。優選這是利用重組載體實現的，所述重組載體包含編碼至少一種能通過發明所述方法獲得的鏈球菌蛋白質，和/或選自表5和/或表6的蛋白質，和/或至少一種所述蛋白質的免疫原性部分的核酸，或者本發明的重組核酸分子。因此還提供了所述重組載體。最優選地，提供的重組載體包含編碼至少一種選自表5和/或表6的蛋白質的核酸。在一個特別優選的實施方案中，所述重組載體包含編碼至少兩種選自表5和/或表6的蛋白質的核酸。在一個實施方案中，讓所述重組載體產生至少一種本發明蛋白，然后利用至少一種重組蛋白和載體本身的組合來引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應。在一個實施方案中，提供了滅活的發明所述重組載體。而在另一個優選實施方案中，提供了活的發明所述重組載體。在一個實施方案中，所述活載體是減毒的載體。本發明的活載體優選能夠感染人類個體和/或非人動物，之后引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應。本發明的重組載體優選包含鏈球菌菌種。這樣抗鏈球菌的免疫反應就是由所述載體編碼的蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物，以及所述重組載體本身共同引發的。鏈球菌的莢膜基因表達產物經常是高度免疫原性和血清型特異性的。因此，莢膜基因表達產物的存在會妨礙抗各種不同鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的誘發。因此，在一個實施方案中，如果本發明的重組載體包含鏈球菌，所述鏈球菌缺少至少部分莢膜基因表達產物。在一個實施方案中，所述鏈球菌是無莢膜型的鏈球菌。正如上文描述的，接種來源于至少兩種不同鏈球菌菌株和/或血清型的至少兩種蛋白和/或免疫原性部分、衍生物和/或類似物能夠提供廣泛的保護，并且減少形成逃逸突變體的機會。因此本發明的優選實施方案提供了發明所述重組載體，其包含編碼來源于第一鏈球菌菌株和/或血清型的至少一種蛋白質和/或其免疫原性部分的核酸序列，以及編碼來源于第二鏈球菌菌株和/或血清型的至少一種蛋白質和/或其免疫原性部分的核酸序列。所述重組載體優選包含活的重組載體。在例如合適的宿主細胞中產生重組載體。因此也提供了包含本發明的重組載體的分離的宿主細胞。本發明的重組載體適用于生產能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的免疫原性組合物。因此這里也提供了能夠引發抗鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含本發明的重組載體。將本發明的免疫原性組合物給予人類個體和/或非人動物后，引發了抗鏈球菌的免疫反應。所述免疫反應優選能夠至少部分地抵抗鏈球菌相關的疾病。因此這里還提供了本發明的免疫原性組合物作為藥物的用途，以及本發明的免疫原性組合物用于制備抗鏈球菌相關疾病的藥物的用途。本發明的免疫原性組合物還適用于生產疫苗。所述疫苗優選能夠至少部分地提供抗鏈球菌相關疾病的保護作用。優選地，所述疫苗能夠提供抗鏈球菌感染的保護作用。因此本發明提供了發明所述免疫原性組合物用于制備疫苗的用途。優選將本發明的蛋白質、免疫原性部分、衍生物、類似物和/或重組載體與合適的載體一起給予人類個體和/或非人動物。所述載體優選能夠促進所述人類個體和/或動物對發明所述蛋白、免疫原性部分、衍生物、類似物和/或重組載體的接受，并且優選增強免疫原性效果。合適的發明所述載體包含例如適宜的佐劑，所述佐劑能夠增強本發明的免疫原性組合物的免疫效果。許多合適的佐劑(油基和水基的)是本領域技術人員已知的。在一個實施方案中，所述佐劑包含DiluvacForte和/或Specol。在另一個實施方案中，所述合適的載體包含例如用于稀釋蛋白質及其免疫原性部分、衍生物和/或類似物的例如鹽水的溶液。因此，本發明還公開了發明所述免疫原性組合物，所述組合物包含至少一種本發明的蛋白質、免疫原性部分、衍生物、類似物和/或重組載體以及合適的載體。本發明的免疫原性組合物能夠在人類個體和/或非人動物中引發抗鏈球菌的免疫反應，從而減少和/或控制所述個體和/或動物中的鏈球菌生物的數目。因此本發明提供了用于減少和/或控制人類個體和/或非人動物中鏈球菌生物體數目的方法，所述方法包括給所述個體和/或非人動物提供本發明的免疫原性組合物。本發明的免疫原性組合物優選能夠至少部分地抵抗和/或預防鏈球菌相關疾病。一旦鏈球菌相關疾病已經存在，本發明的免疫原性組合物優選能夠至少部分地抵抗所述疾病。因此本文也提供了藥物組合物，該藥物組合物包含本發明的免疫原性組合物，并且優選還包含合適的載體，比如例如DiluvacForte和/或Specol。本發明還有一個實施方案提供了測量人類個體和/或非人動物抗鏈球菌的免疫能力的方法，所述方法包括確定來自所述個體和/或動物的至少一個樣本中是否存在這樣的抗體和/或免疫細胞，所述抗體和/或免疫細胞抗能通過發明的方法獲得的蛋白質，和/或選自表5和/或表6的蛋白質，或所述蛋白質的免疫原性部分。因此本文還提供了診斷試劑盒，其包含至少一種能通過發明的方法獲得的和/或選自表5和/或表6的蛋白質，或其免疫原性部分，以及檢測與所述蛋白質或其免疫原性部分發生抗體結合和/或免疫細胞結合的工具(means)。在特別優選的實施方案中，所述診斷試劑盒包含至少兩種選自表5和/或表6的蛋白質。發明詳述在優選實施方案中，本發明的方法被用于鑒定能夠引發抗至少兩種乳房鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的乳房鏈球菌蛋白質。這類乳房鏈球菌蛋白質優選用于制備能夠引發抗至少兩種乳房鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的免疫原性組合物。因此本文還提供了能夠引發抗至少兩種乳房鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的免疫原性組合物，及其用于制備抗乳房鏈球菌乳腺炎的藥物的用途；所述免疫原性組合物包含至少一種，優選至少兩種能通過本發明的方法獲得的分離的和/或重組蛋白，或其至少一個免疫原性部分、衍生物和/或類似物。發明還提供了分離的或重組的核酸分子，所述核酸分子包含的核酸序列編碼至少兩種能通過本發明的方法獲得的，和/或選自表5和/或表6的乳房鏈球菌蛋白質。另外提供的還有重組載體、宿主細胞和包含所述核酸的免疫原性組合物，及其用途。乳房鏈球菌與牛乳腺炎相關聯。牛乳腺炎是奶牛乳腺發生的感染，通常是由細菌引起的。感染后的炎癥反應造成牛奶產量和質量下降，每年給奶制品行業造成重大的經濟損失。在荷蘭，每年每只奶牛的經濟損失估計在大約100歐元。最常見與乳腺炎相關的細菌是鏈球菌屬的多個種，包括乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)(不可分型的(untypeable))、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)(蘭氏#,(Lancefieldgroup)B,)、亭學LIil求Iif(Streptococcusdysgalactiae)(蘭氏C群)、獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)以及蘭氏D、G、L和N群鏈球菌。這些菌種中有些是感染性的(例如，無乳鏈球菌)，而其他的被認為是環境病原菌(例如停乳鏈球菌和乳房鏈球菌)。感染乳房鏈球菌導致的乳腺炎通常是亞臨床的，其特征在于顯然是正常的牛奶，以及由于白細胞涌入造成的體細胞計數增加。根據感染造成的臨床效果，乳腺炎的嚴重程度不一。較溫和的乳腺炎可能導致體溫有所上升，和/或乳房溫度上升。在某些嚴重的病例中，乳房鏈球菌性乳腺炎也可能表現出急性臨床癥狀，有明顯的病征，比如牛奶凝塊或變色，以及乳腺的腫大或變硬。有些臨床病例可能非常嚴重，有可能存在發熱。關于乳房鏈球菌性乳腺炎的臨床表現的綜述，參見Bramley(1991)和Schalmetal.(1971)。常規的抗菌控制方法，比如乳頭藥浸和抗生素療法能夠有效控制許多類型的傳染性乳腺炎，但是在所有奶場都能發現的常見環境生物體經常對這類措施有抗性。因此這些措施沒能影響由諸如乳房鏈球菌和大腸埃希氏菌等環境病原菌導致的乳腺炎的發生率，目前95%以上的乳腺炎病例是由它們導致的。對于這兩種菌種，在英國(Hillertonetal.,1993)、新西蘭(McDougal1，1998)、美國(Hoganetal.，1989)以及荷蘭(AnimalHealthService,2000)進行的調查顯示，乳房鏈球菌是最重要的環境病原菌。還有證據表明，一旦從環境中被感染乳房鏈球菌，該菌可以直接從被感染的奶牛傳播給易感動物(Neaveetal.，1969，Oliveretal.，1999，Zadoksetal.,2001)存在幾種毒力和抗原性不同的乳房鏈球菌菌株。目前方法在控制乳房鏈球菌性乳腺炎的失敗使得人們尋找替代的控制措施，比如更有效的疫苗。至今已開發了幾種類型的疫苗，并已在奶牛中進行了測試。給奶牛反復接種滅活全細菌，再用同樣的菌株進行試驗性攻擊后，牛奶中存在的細菌數目減少(Leigh，1999;Leigh，2000)。但是滅活疫苗不能防止乳腺中的感染或炎癥反應，并且對野外乳房鏈球菌乳腺炎的發生率沒有效果(Leigh，1999)。因此，結論是免疫接種滅活細菌不是乳房鏈球菌乳腺炎的解決方法。接種活的乳房鏈球菌誘發對用相同(或同源)菌株進行的試驗性攻擊的部分保護(Finchetal.，1997)。保護是在沒有調理活性，沒有大量嗜中性粒細胞涌入的情況下實現的。但是，疫苗似乎不能提供對其他乳房鏈球菌菌株的保護作用。這些全細胞疫苗策略的較低成功率表明很難用常規的全細胞疫苗給動物提供抗乳房鏈球菌的保護作用。近來，基于乳房鏈球菌的一個蛋白質生產出了亞基疫苗(Fontaineetal.2002)。所述亞基疫苗在發表后至今沒有后續進展，這使我們得到的結論是能夠找到可以使動物抗幾種類型的乳房鏈球菌的單個蛋白的機會很小，這類亞基疫苗通常不是控制乳房鏈球菌乳腺炎的解決方法。總之，接種全細菌，無論活的或者滅活的，或者包含一種蛋白質的疫苗都不能有效地防止或者治愈乳房鏈球菌導致的乳腺炎。盡管以上描述的抗乳房鏈球菌性乳腺炎的疫苗結果令人沮喪，我們在本文中披露，根據本發明，利用能夠引發抗乳房鏈球菌的抗原性組合物成功地預防和/或消除了由多種乳房鏈球菌菌株引起的乳腺炎。本發明提供了用于鑒定能夠引發抗至少兩種乳房鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的乳房鏈球菌蛋白的方法，所述方法包括a)鑒定至少部分分泌蛋白、表面相關蛋白和/或與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白；b)挑選至少一種步驟a)鑒定到的蛋白質，所述蛋白在至少兩種乳房鏈球菌菌株和/或型別中是保守的；以及c)確定步驟b)挑選的至少一種蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物是否能夠特異結合感染了第一乳房鏈球菌菌株和/或型別的動物的抗體和/或免疫細胞，以及感染了第二乳房鏈球菌菌株和/或型別的動物的抗體和/或免疫細胞。優選地，所述與細胞毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白質與細菌毒力因子具有至少60%，更優選至少70%，更優選至少75%，最優選至少80%序列同一性。本發明另外還公開了至少兩種分離的或重組的乳房鏈球菌表面蛋白或其免疫原性部分組合成的抗原性組合物大大增強了抗乳房鏈球菌菌株的免疫反應。雖然包含多種細菌免疫原性蛋白的全細菌細胞疫苗不能引發抗各種乳房鏈球菌菌株的廣泛保護，本發明的免疫原性組合物中的兩種或多種蛋白質或其免疫原性部分具備增強抗乳房鏈球菌的免疫反應的預期效果。我們在本發明中公開了挑選乳房鏈球菌生物體(優選是乳房鏈球菌生物體的至少兩種菌株或型別)的至少兩種免疫原性蛋白質或其免疫原性部分，將所述至少兩種免疫原性蛋白質或其免疫原性部分組合成免疫原性組合物，從而提高對乳房鏈球菌不同菌株的免疫力，因為免疫反應是針對更廣泛的不同乳房鏈球菌生物體。為了在個體或動物中引發免疫反應，優選將蛋白質的免疫原性部分遞呈成所述個體或動物。在本發明中，術語“免疫原性部位”與術語“免疫原性部分”可以互換使用。“免疫原性部分或部位”意味著能夠在個體中引發免疫反應的蛋白質部分。優選所述蛋白質的免疫原性部分包含一或多個表位，從而能夠引發免疫反應。免疫原性部分包含至少5個氨基酸，優選至少10-15個，最優選25或更多個連續氨基酸。因此發明在另一個實施方案中提供了包含由發明所述核酸編碼的蛋白性分子中至少30個連續氨基酸的蛋白質或其免疫原性部分。構象表位通常是在蛋白質處于其三維結構時，由幾段連續氨基酸折疊至一定位置，共同形成表位。本發明還公開了將構象表位作為免疫原性部分。蛋白質的衍生物定義為具有類型相同，量不一定相同的免疫原性性能的蛋白質。本領域技術人員能夠改變蛋白質使得所述分子類型基本相同，但量不一定相同。通過多種途徑可以提供蛋白質的衍生物，例如通過諸如將蛋白質中的一個氨基酸取代為另一個氨基酸這樣的保守氨基酸取代。在常規替換做圖中，優選進行的是保守性變化，例如將包含酸性側鏈的氨基酸取代為另一個包含酸性側鏈的氨基酸、將體積大的氨基酸取代為另一個體積大的氨基酸、將包含堿性側鏈的氨基酸取代為另一個包含堿性側鏈的氨基酸、將包含不帶電荷的極性側鏈的氨基酸取代為包含不帶電荷的極性側鏈的氨基酸、將包含非極性側鏈的氨基酸取代為包含非極性側鏈的氨基酸。本領域技術人員很容易制備蛋白質的類似化合物。這能通過例如篩選肽文庫或者利用改變肽的程序來實現。為了作為免疫原，合成具有適宜特性的肽以便保證更高的成功率產生抗體。這包括如果肽是天然蛋白質的真實的C末端序列，需要C末端的游離羰基；如果肽是天然蛋白質的真實的N末端序列，需要游離的N末端基團。這樣的類似物與所述蛋白具有基本相同類型的免疫原性性能，但不一定量相同。蛋白質或者肽會發生多種因素導致的降解，象例如蛋白質水解、解折疊、極端pH值、去污劑和高鹽濃度。為了延長重組蛋白質或肽的壽命，將所述蛋白或肽制備地更穩定以經受降解，例如通過合成帶有C末端甲酰胺的蛋白質和/或將N末端乙酰化從而維持天然的電荷特性。這還可以進一步通過突變，利用穩定化突變策略來抑制通常會使蛋白質容易被自溶的局部解折疊過程。所述穩定化突變側鏈基于蛋白質結構和穩定性的公認原理，正如例如Matthews(1991)、Alber(1989)、VriendandEijsink(1993)以及FershtandSerrano(1993)中描述的。在一個實施方案中，本發明的免疫原性組合物包含含有至少兩種重組或分離的表面蛋白或其衍生物或類似物和/或免疫原性部分的組合物，其中將所述組合物給予個體或者動物，優選給予奶牛，導致對所述表面蛋白或其免疫原性部分建立起體液和/或細胞免疫反應。免疫反應包括在個體或動物，優選奶牛中建立起針對所述蛋白或其免疫原性部分的體液和/或細胞免疫反應。體液免疫反應導致個體或動物中產生抗體，而細胞免疫反應主要會增加應答性免疫細胞的形成。一般來說，免疫反應的這兩部分是由給予免疫原性蛋白或其部分引發的。優選的抗乳房鏈球菌的免疫反應是產生抗體。優選地，所述免疫反應能夠預防和/或減弱乳腺炎，和/或減少乳房中乳房鏈球菌生物體的數目。本發明公開了選擇和制備用于引發所述抗體反應的蛋白和表位的方法。另一種優選的抗乳房鏈球菌的免疫反應是細胞性免疫反應。本發明也公開了挑選表面蛋白的T細胞表位的方法，以及制備導致T細胞反應性增強的T細胞表位的方法，例如通過象VanderBurgetal(W097/41440)描述的將多個預先挑選的T細胞表位偶聯成珠串的方式。在發明的一個實施方案中，所述免疫原性組合物能夠減弱感染的持續時間和/或嚴重程度或者提高動物對乳房鏈球菌感染的抵抗力。本發明公開了優選針對乳房鏈球菌外部的免疫反應。因此，本發明公開的免疫原性組合物或其免疫原性部分能夠引發針對優選位于或者靠近乳房鏈球菌細胞表面的抗原的免疫反應。本發明的表面蛋白包含優選天然地靠近或者位于乳房鏈球菌細菌表面的蛋白質，和/或優選由乳房鏈球菌細菌天然地產生和/或分泌到胞外的蛋白質。優選在乳房鏈球菌的其他菌株中存在所述表面蛋白的同源蛋白。因此，來源于一種乳房鏈球菌菌株的免疫原性蛋白或其部分所引發的免疫反應也能有效抗其他乳房鏈球菌菌株。因此本發明公開了能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含至少兩種來源于乳房鏈球菌的重組和/或分離的表面蛋白，和/或所述蛋白中任一種或者兩者的免疫原性部分。術語“重組蛋白”是指通過重組DNA技術，即通過轉化了編碼所需蛋白之核酸構建體的細胞產生的蛋白質。所述核酸構建體是例如帶有控制表達序列的調控序列，比如啟動子和/或終止子序列和/或增強子序列的重組DNA構建體。術語“分離的蛋白”是指與其天然所存在的整個生物體分開和離散的蛋白質；和/或完全或部分地不含有正常情況下與它相關聯的物質的蛋白質。所述免疫原性組合物包含來源于相同乳房鏈球菌生物體的至少兩種蛋白質或其免疫原性部分；或者包含來自一類乳房鏈球菌的至少一種蛋白或其免疫原性部分，以及來自另一類乳房鏈球菌的至少一種蛋白或其免疫原性部分。發明還公開了至少3種或4種或者更多種蛋白質或其免疫原性部分的組合，其中的一種或兩種或更多種來源于其它類型的乳房鏈球菌。優選地，本發明的免疫原性組合物或其免疫原性部分包含來自至少兩種不同乳房鏈球菌生物體的蛋白質，因為這樣產生的廣泛免疫反應可以交叉保護，即可以對抗不同類型的乳房鏈球菌。而且，利用來自至少兩類乳房鏈球菌菌株的免疫原性蛋白或其免疫原性部分降低了形成乳房鏈球菌生物體的逃逸突變體的機會。細菌生物體的逃逸突變體通常是在環境壓力下形成的，例如在有抗生素的情況下，或者存在抗所述生物體的表位的抗體的情況下。比如因為生物體群體中的低突變率導致的天然差異，所述群體中的某些生物體的復制更受所述抗體的抑制，而其他生物體能夠逃避所述抗體的抑制效果并不斷地增殖，從而在新的群體中占據主導地位。幾個不同表位同時產生逃逸突變體的機會比僅有一個表位產生逃逸突變體的機會小。優選免疫原性組合物和/或其免疫原性部分能夠引發抗至少兩種蛋白質的免疫反應，導致更廣泛的抗感染作用并減少乳腺炎的臨床癥狀。因此，本申請提供了能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含來源于至少一種乳房鏈球菌菌株的至少兩種重組和/或分離的表面蛋白，和/或所述蛋白中任一種或者兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物。對細菌生物體的代謝或存活或者增殖重要的蛋白質通常稱為生物體的關鍵蛋白。所述關鍵蛋白的序列和功能通常在不同類型的乳房鏈球菌中是較為保守的。在發明的優選實施方案中，所述免疫原性蛋白是乳房鏈球菌的關鍵蛋白。這樣，免疫反應針對的是關鍵蛋白或其免疫原性部分，從而形成對抗同源的乳房鏈球菌生物體的防護作用，但也能交叉反應性對抗不同類型的乳房鏈球菌，因為所述保守蛋白或關鍵蛋白也存在于其他類型的乳房鏈球菌表面上。因此，將乳房鏈球菌生物體的關鍵表面蛋白作為發明的免疫原性蛋白提高了抗不同類型乳房鏈球菌感染的免疫反應的保護效力，減少了所述生物體逃避免疫反應的可能性。乳房鏈球菌的莢膜抗原通常是良好的免疫原性表位，因為莢膜抗原很容易用奶牛(忍耐了乳房鏈球菌乳腺炎)的恢復期血清檢測到。所述免疫原性特性能夠增強抗相關乳房鏈球菌免疫原性表位的免疫反應。因此，在另一個實施方案中，免疫原性組合物在免疫原性蛋白之外，包含至少一種莢膜抗原，因為所述莢膜抗原能夠提高抗所述免疫原性組合物的免疫反應。本專利申請在表5和表6中公開了優選的重組和/或分離的表面蛋白，這些蛋白來源于乳房鏈球菌并因其能夠引發抗不同乳房鏈球菌菌株的免疫反應而被選中。因此，本申請提供了發明的免疫原性組合物，和/或所述蛋白中任一種或者兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物，其中至少兩種蛋白選自表5和/或表6。在發明的優選實施方案中，從表5和/或表6的蛋白中進行選擇，并將兩種或多種蛋白質進行組合，象例如乳房鏈球菌菌株0140J的No.63蛋白質和/或其免疫原性部分，與來自乳房鏈球菌菌株41-241的No.15或22蛋白質和/或兩者和/或其免疫原性部分。這樣的選擇提供了來自兩種不同乳房鏈球菌菌株的蛋白或其免疫原性部分，從而提供了針對多種乳房鏈球菌菌株的廣泛保護作用。在優選實施方案中，從表5和/或表6中選擇的蛋白質包含選自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、P100和P105的蛋白質。正如前面提過的，這些蛋白質或者被感染了乳房鏈球菌的動物的血清中存在的抗體識別，表明這些蛋白在奶牛中是體內表達的并且是免疫原性的；或者如表5所示在至少兩種乳房鏈球菌菌株中是交叉反應的。實施例11中鑒定的蛋白質尤其適用于引發免疫反應。因此，在更優選的實施方案中，從表5和/或表6中選擇的蛋白質包含選自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105的蛋白質。最優選地，從表5和/或表6中選擇的蛋白質包含選自P15、P16、P54、P28、P63和P105的蛋白質。正如上文提及的，所有實施例11中導致各自感染的乳房鏈球菌中都能表達后一組選中的蛋白，這些蛋白是在感染宿主的過程中被表達，并且是高度免疫原性的。在例如表5中進行了表征的上述蛋白的編號參照在例如表1、2和3中描述的蛋白，這幾個表顯示了乳房鏈球菌常見表面蛋白的非限制性實例。此外，圖4顯示了這些選中的推測的乳房鏈球菌表面蛋白/毒力因子的核酸和氨基酸序列的非限制性實例。在野外經常會發現牛奶中或牛乳房上或乳房內有少量的細菌，這不一定對動物構成危害。當牛奶或者牛乳房中的細菌，例如乳房鏈球菌生物體的數量增加時，就可能發生乳腺炎。通過本發明的蛋白或其免疫原性部分引發的免疫反應優選能夠有效地抑制牛乳房中至少部分乳房鏈球菌生物體的細菌生長。減少直接環境中乳房鏈球菌生物體的數量也有助于預防乳腺炎。本發明公開了如何通過給奶牛接種，從而將乳房鏈球菌生物體的數量維持在較低來預防和/或減少乳房鏈球菌乳腺炎。乳房鏈球菌生物體的所述低水平可以進一步通過在擠奶時采取的衛生措施來保持，例如通過清潔牛乳房、乳頭以及會接觸到乳房和/或乳頭的所有器具。在一個實施方案中，本發明提供的來源于乳房鏈球菌的重組和/或分離的表面蛋白是由利用原核細胞或真核細胞的制備系統產生的。用于制備重組蛋白的具備成熟宿主/載體系統的細胞的例子，包括例如細菌埃希氏菌(Escherichia)，芽孢桿菌(Bacillus)，假單胞菌(Pseudomonas)、沙雷菌(Serratia)、短桿菌(Brevibacterium)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、鏈球菌和乳桿菌；酵母菌釀酒酵母(Saccharomyces)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、接合酵母(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母(Yarrowia)、絲孢酵母(Trichosporon)、冬孢酵母(Rhodosporidium)、漢遜酵母(Hansenula)、畢赤酵母(Pichia)和假絲酵母(Candida)；以及對真菌有脈孢霉(Neurospora)、曲霉(Aspergillus)、頭抱霉(Cephalosporium)禾口木霉(Trichoderma)0為了制備目的重組蛋白，將編碼所述蛋白或其部分的基因通過同源重組或隨機地整合到基因組中，或者將所述基因置于質粒載體或噬菌體載體中，在選定的微生物或細胞中穩定地維持所述載體并表達。為了在微生物或細胞中表達選定的DNA構建體，在啟動子和終止子的控制下轉錄和翻譯所述基因。優選地，所述啟動子和終止子適合所選微生物。"BiseibutsugakuKisokoza(BasicMicrobiology),Vol.8,GeneticTechnology,KyoritsuShuppan(1990)”中公開了適用于各種微生物的啟動子和終止子，"Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)”和“Yeast8，423-488(1992)”中公開了酵母菌優選的。例如，適合埃希氏菌，更具體說適合大腸埃希氏菌的質粒載體是PBR和pUC系列的質粒，合適的啟動子包括Iac啟動子(β-半乳糖苷酶)、trp操縱子(色氨酸操縱子)以及tac啟動子(lac-trp雜合啟動子)以及來源于λ-faagPL或冊的啟動子。優選的終止子包括trpA-或來源于噬菌體的rrnB核糖體終止子。適用于鏈球菌中進行的重組制備的質粒載體包括例如pHV1301(FEMSMicrobiol.Lett.26,239(1985))和pGKl(Appl.Environ.Microbiol.50,94(1985))適用于乳桿菌中進行的重組制備的質粒載體包括例如那些針對鏈球菌公開的，比如例如ρΑΜβ1(J.Bacteriol.137，614(1979))。適用于酵母，優選釀酒酵母中進行的重組制備的質粒載體包括例如YRp、Y印、YCp和Yip系列的載體。通過采用核糖體DNA與染色體中多重拷貝的同源重組構建的整合載體(EP5327456)適用于多拷貝的插入和穩定的基因調控。適用于克魯維酵母，優選乳酸克魯維酵母中進行的重組制備的質粒載體包括例如來源于釀酒酵母的2μπι質粒系列、pKDl系列的質粒(J.Bacteriol.145,382-390(1981))以及參與殺傷活性的PGKll衍生的質粒、帶有克魯維酵母的自主復制基因的KARS系列質粒和整合載體(EP537456)。適用于畢赤酵母中進行的重組制備的質粒載體包括例如宿主載體系統，該系統是利用參與畢赤酵母中的自主復制的一個基因在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中建立起來的(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985)。適用于假絲酵母中進行的重組制備的質粒載體包括例如在麥芽糖假絲酵母(Candidamaltosa)、白假絲酵母(Candidaalbicans)和熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)中建立的宿主載體系統(Agri.Biol.Chem.51,51,1587(1987)。適用于曲霉中進行的重組制備的質粒載體包括例如通過基因整合到質粒或染色體中以及胞外蛋白酶或淀粉酶的啟動子構建的載體(TrendsinBiotechnology7,283-287(1989))。適用于在木霉中進行的重組制備的質粒載體包括例如在里氏木霉(Trichodermareesei)中建立的宿主載體系統，以及適合構建所述載體的胞外纖維素酶的啟動子(Biotechnology7,596-603(1989))。優選地，是以編碼表5和/或表6中的蛋白質或其免疫原性部分的核酸構建體，優選DNA構建體提供所述制備系統的。在另一個實施方案中，是以編碼表5和/或表6中的兩種或三種或四種或更多種蛋白質或其免疫原性部分的DNA構建體提供所述制備系統的。還有一個實施方案中，是以各自編碼表5和/或表6中的至少一種蛋白或其免疫原性部分的至少兩個DNA構建體提供所述制備系統的。在優選實施方案中，所述表5和/或表6中的蛋白選自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、PlOO和P105、更優選所述表5和/或表6的蛋白選自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105。最優選地，所述表5和/或表6中的蛋白選自P15、P16、P54、P28、P63和P105。在更優選的實施方案中，所述核酸構建體編碼融合蛋白，所述融合蛋白包含來源于一種以上乳房鏈球菌蛋白質的免疫原性表位。更優選地，所述融合蛋白包含來源于來自一種以上乳房鏈球菌菌株的蛋白質的表位。在發明的另一個實施方案中，所述核酸構建體編碼被修飾過以便增強體液和/或細胞免疫反應的表位。因此，本申請提供了制備免疫原性組合物的方法，所述組合物包含至少兩種能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應的乳房鏈球菌蛋白，所述方法包括給細胞提供重組載體，其中所述載體包含的核酸編碼至少兩種表5和/或表6中列舉的蛋白質，和/或所述蛋白中的一種或兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物。為了由核酸重組制備蛋白，優選將所述核酸置于誘導型調控序列的控制下，所述調控序列能夠增強所述蛋白的表達，優選導致更高的蛋白產量。優選地，所述重組蛋白或其免疫原性部分累積在細胞質中，例如在那些要從細胞中收集所產生的重組蛋白的情況下，或者蛋白是分泌的，例如產生的蛋白是從培養液中收集的。因此，提供帶有正確調控序列和/或功能性連接的啟動子的編碼所述免疫原性蛋白的重組構建體以便蛋白的胞內或胞外累積。因此，本發明提供了包含核酸序列的重組分子，所述核酸序列處于功能性連接的啟動子的控制下，其編碼至少兩種表5和/或表6中列舉的蛋白質，和/或所述蛋白中的一種或者兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物。在優選實施方案中，所述表5和/或表6中列舉的蛋白選自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、P100和P105。更優選的所述表5和/或表6中列舉的蛋白選自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105。最優選所述表5和/或表6中列舉的蛋白選自P15、P16、P54、P28、P63*P105。本申請還提供了包含本發明的核酸序列或發明的重組DNA分子的活性重組載體。在優選實施方案中，所述載體是第一乳房鏈球菌菌株，重組核酸編碼另一種乳房鏈球菌菌株的免疫原性表位。因此，本發明提供了包含核酸序列的活性重組載體，所述核酸序列處于功能性連接的啟動子的控制下，其編碼表5和/或表6中列舉一種或多種蛋白質，和/或所述蛋白中的一種或者兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物。當然，所述活性重組載體在被滅活時也是免疫原性的。因此，本發明還公開了滅活的重組載體。本申請進一步提供了包含核酸序列的分離的宿主細胞，所述核酸序列處于功能性連接的啟動子的控制下，其編碼一種或多種表5和/或表6中列舉的蛋白質，和/或所述蛋白中的一種或者兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物。分離的宿主細胞包含例如細菌，比如埃希氏菌、芽孢桿菌、假單胞菌、沙雷菌、短桿菌、棒狀桿菌、乳房鏈球菌、豬鏈球菌和乳桿菌；或者酵母菌，比如例如釀酒酵母、克魯維酵母、裂殖酵母、接合酵母、耶氏酵母、絲孢酵母、冬孢酵母、漢遜酵母、畢赤酵母和假絲酵母，或者真菌，比如例如脈孢霉、曲霉、頭孢霉和/或木霉。基于前述的包含重組分子的分離的宿主細胞，本發明向本領域技術人員公開了如何制備重組蛋白性分子，其中所述重組分子包含的核酸序列處于功能性連接的啟動子的調控之下，編碼一種或多種表5和/或表6中列舉的蛋白質，和/或所述蛋白中的一種或全部的免疫原性部分或類似物或衍生物。由于不同乳房鏈球菌菌株之間的差異，來自各種菌株的蛋白質和肽的氨基酸序列可能略有不同，但仍具有相同的功能。因此，來源于一種乳房鏈球菌菌株的蛋白性分子與另一種乳房鏈球菌菌株中的功能等同蛋白性分子具有序列同一性。“序列同一性”是指將兩個氨基酸序列或核苷酸序列進行比對，并在必要時引入空位以實現最大序列同一性百分比后，兩個序列之間的序列同一性百分比。用于比對的方法和計算機程序是本領域公知的。可以用于或者改編用于確定候選序列是否落在這個定義范疇內的一個計算機程序是版權屬于Genentech，lnc.的“Align2”，該程序于1991年12月10日與用戶文件提交至美國版權局(WaShington，D.C.20559)。如果兩個氨基酸序列在比對后，序列顯示兩個分子存在至少約80%、優選至少約90%，最優選至少約95%的序列同一性，它們相互具有高的“序列同一性”。因此，本申請公開了與發明所述核酸編碼的蛋白質具有至少80%序列同一性的分離的和/或重組的蛋白性分子。在優選實施方案中，發明公開了與發明所述核酸編碼的蛋白質具有至少95%序列同一性的分離的和/或重組的蛋白性分子。為了在動物中誘發或引發抗本發明的蛋白或免疫原性部分的免疫反應，給所述動物提供所述蛋白和/或包含至少一個免疫原性部位的免疫原性部分。蛋白質的免疫原性部分或部位是由一個或多個表位形成，因此能夠引發免疫原性反應。免疫原性部位優選包含至少5個氨基酸，更優選至少10-15個，最優選25個或更多個連續氨基酸。發明在另一個優選實施方案中提供了這樣的蛋白或其免疫原性部分，所述蛋白或免疫原性部分包含由發明的核酸編碼的蛋白性分子中的至少25個連續氨基酸片段。優選所述至少25個連續氨基酸的片段包含免疫原性部位。在優選實施方案中，重組核酸分子編碼至少一個蛋白質或者編碼表示至少兩個蛋白或其免疫原性部分的融合蛋白。在優選實施方案中，所述融合蛋白包含至少兩種乳房鏈球菌菌株的蛋白的免疫原性部分。因此，發明公開了編碼本發明的蛋白性分子的核酸。在宿主細胞中表達所述核酸提供了本發明的免疫原性蛋白質。優選將所述免疫原性蛋白并入發明的免疫原性組合物。因此，本發明提供了能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含發明所述分離的和/或重組的蛋白性分子。所述發明的重組蛋白由宿主細胞產生。將比如例如大腸桿菌的細菌和/或酵母菌或真菌或真核細胞作為宿主細胞進行生產。并入了分離的或重組蛋白的免疫原性組合物，和/或展示所述蛋白的細胞在給予動物(優選奶牛)時，能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應。優選地，所述包含處于合適的調控序列下的發明所述核酸的細胞將所述蛋白表達于細胞表面。這類細胞稱為載體細胞。優選將所述載體細胞并入本發明的免疫原性組合物中。優選地，所述載有所述免疫原性蛋白的細胞是活性重組載體，但在另一個實施方案中，所述載體能夠在通過例如福爾馬林處理滅活后引發免疫反應。因此，本發明提供了能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含活的或滅活的本發明的重組載體。因為乳房鏈球菌是導致奶牛乳腺炎的病因，在發明的優選實施方案中，所述活的或者滅活的重組載體是鏈球菌屬的。在發明的一個實施方案中，所述宿主細胞是鏈球菌屬的。然后優選所述蛋白分子在能夠增強引發免疫反應的其他鏈球菌蛋白的背景下存在。而且，能通過在宿主細胞，優選鏈球菌細胞表面過表達重組蛋白來增強免疫原性。此外，使用不同的鏈球菌宿主細胞菌株可以提高免疫原性蛋白或其部分的免疫原性。因此，本發明還提供了發明所述免疫原性組合物，其中所述宿主細胞是鏈球菌屬的。有幾種鏈球菌也適合作為宿主細胞，例如豬鏈球菌或無乳鏈球菌或停乳鏈球菌。因為各種鏈球菌之間的不同，而且因為天然存在于乳房鏈球菌的某些蛋白質能夠幫助引發抗乳房鏈球菌的免疫反應，在優選實施方案中，弱化的乳房鏈球菌被作為本發明的免疫原性組合物中的活性重組載體。優選地，所述乳房鏈球菌生物體表達另一種乳房鏈球菌菌株的蛋白，從而公開了區分疫苗，因為通過檢測抗這兩種菌株的蛋白的抗體，可以將接種了所述疫苗的動物的血清與感染了野外感染的動物辨別開。在另一個實施方案中，用活的或者滅活的豬鏈球菌或葡萄球菌或者大腸桿菌取代所述乳房鏈球菌生物體作為宿主細胞，或者作為活的或滅活的載體。給予本發明的免疫原性蛋白或其部分，或者給予編碼所述蛋白的核酸能夠引發免疫反應。在給予奶牛后，所述核酸在所述奶牛的細胞內表達，并被所述奶牛的免疫系統識另IJ。核酸以此充當了免疫原性組合物，例如作為抗乳腺炎的DNA疫苗。因此，本發明提供了能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含本發明的核酸。因為本發明的免疫原性組合物能夠在動物，優選奶牛中引發免疫反應，發明所述蛋白質減少與乳腺炎相關的疾病，提高所述奶牛的健康狀況，從而使奶牛更能抵抗其他(次級)感染。因此，本發明提供了發明所述免疫原性組合物作為藥物。優選地，本發明的免疫原性組合物被用于制備抗乳房鏈球菌乳腺炎的藥物，所述藥物減少因乳房鏈球菌導致的乳腺炎所造成的特定疾病。因此，本發明提供了發明所述免疫原性組合物用于制備抗乳房鏈球菌乳腺炎的藥物的用途。本發明的免疫原性組合物還被用于制備或配制抗乳腺炎的疫苗。疫苗通常能夠防止動物或人染上某種疾病。優選地，本發明的免疫原性組合物能夠預防乳腺炎。因此，本發明在優選實施方案中公開了發明所述免疫原性組合物用于制備疫苗的用途。在另一個實施方案中，優選將發明的免疫原性組合物用于減少和/或控制牛奶和/或奶牛乳房中的乳房鏈球菌生物體的數量。在奶場進行的擠奶過程潛在著將乳房鏈球菌生物體從染病的奶牛傳播給另一只奶牛的危險。因此最適合通過乳房鏈球菌生物體數量的下降來抑制感染從乳頭到乳頭和/或從動物到動物的傳播。為了給予個體本發明的免疫原性組合物，將蛋白或其免疫原性部分或者宿主細胞與合適的載體混合，從而促進個體對免疫原性組合物的接受并增強所述組合物的免疫原性效果。發明所述合適的載體包含例如合適的佐劑以便提高所述免疫原性組合物的免疫效果。許多油基和水基的合適的佐劑是本領域技術人員知道的，例如Diluvacforte佐劑或Specol佐劑。在一個實施方案中，所述合適的載體包含例如溶液，象用于稀釋細菌或蛋白或其免疫原性部分的鹽水。因此，本發明公開了包含發明所述免疫原性組合物和合適的載體的藥物組合物。在接種了本發明的免疫原性組合物的動物，優選奶牛中，產生了針對乳房鏈球菌的抗體。免疫接種發明的免疫原性組合物或疫苗后，所述抗體的存在和水平指示著免疫力。優選所述抗體不是針對作為野外的野生型乳房鏈球菌菌株存在的表位。為了將接種了疫苗的動物與帶有野生型感染的動物分辨開，在一個實施方案中優選通過測量針對發明所述免疫原性組合物的抗體來檢測所述接種了疫苗的動物的免疫力。還檢測了所述接種過疫苗的奶牛的抗血清是否存在免疫原性組合物中沒有的抗乳房鏈球菌抗原的抗體。檢測到發明所述免疫原性組合物或疫苗中不存在的抗乳房鏈球菌抗原的抗體表明有野生型感染。因此，本發明公開了測量動物抗乳房鏈球菌的免疫力的方法，所述方法包括確定來自所述動物的至少一個樣品中是否存在針對選自表5和/或表6的蛋白或其免疫原性部分的抗體。在優選實施方案中，所述選自表5和/或表6的蛋白質選自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、PlOO和P105。更優選所述選自表5和/或表6的蛋白質選自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105。最優選的，所述選自表5和/或表6的蛋白質選自P15、P16、P54、P28、P63和P105。為了檢測與發明所述免疫原性組合物結合的抗體，適合使用包含至少一種表5和/或表6中的蛋白質或其免疫原性部分的診斷試劑盒。通過例如免疫熒光抗體檢測或者酶聯抗體檢測或者任何其他能夠檢測結合在所述蛋白或其免疫原性部分上的抗體的手段來檢測抗體與所述蛋白或其免疫原性部分的結合。在優選實施方案中，所述至少一種表5和/或表6中的蛋白質選自P15、P16、P17、P19、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P64、P68、P75、P81、P93、PlOO和P105。更優選所述至少一種表5和/或表6中的蛋白質選自P15、P16、P20、P27、P54、P28、P63、P68、P93和P105。最優選的，所述至少一種表5和/或表6中的蛋白質選自P15、P16、P54、P28、P63和P105。因此，本發明公開了這樣的診斷試劑盒，所述試劑盒包含至少一種選自表5和/或表6的蛋白質或其免疫原性部分，以及檢測與所述蛋白或其免疫原性部分結合的抗體的手段。這類診斷試劑盒是例如ELISA檢測或者任何其他適用于篩查血清的檢測。優選地，所述檢測試劑盒適用于篩查大量血清。在另一個實施方案中，發明的核酸被用于檢測接種了本發明的免疫原性組合物或疫苗的動物群體中，感染有野生型乳房鏈球菌菌株的動物。這項檢測是通過利用例如PCR實現的。本專利申請公開了發明所述成功的免疫原性蛋白是能夠接觸到細菌表面的抗體，并且是多種乳房鏈球菌菌株共有的蛋白性分子和/或蛋白質。作為實例，從菌株41-241和0140J的基因組序列中鑒定到的表面蛋白是通過挑選含有一或多個常見于革蘭氏陽性細菌表面蛋白的序列，例如將蛋白錨定到細胞壁所需的LPXTG分選酶基元，或者脂蛋白所需的脂類附著基元，或者信號序列或預示著所編碼的蛋白將定位到表面的跨膜區。本申請公開了通過用由以上挑選的基因得到的PCR產物探測多種乳房鏈球菌菌株的染色體DNA證實選中的蛋白質存在于乳房鏈球菌菌株中。以下實施例進一步解釋發明。這些實施例不會限制發明的范圍，而只是用于闡明發明。可以實施許多替代的實施方案，它們都在本發明的范圍內。圖1.完整乳房鏈球菌菌株的FACS分析。將乳房鏈球菌菌株41-241(A)和OHOJ(B)與小鼠免疫血清(黑色條帶)或相應的免疫前血清(淺色條帶)一起溫育。利用FITC偶聯的二抗檢測結合的抗體。數據表達為與細菌細胞相關的熒光強度的中值。熒光強度彡10(2x背景)認為是陽性。所用血清的編號參照表1到4中顯示的基因/蛋白編號。圖2.考馬斯亮藍染餼的2D蛋白組樽式。用得自試驗性感染菌株0140J的奶牛的牛血清探測指數生長的乳房鏈球菌菌株41-241(A)和OHOJ(B)的裂解物。圈起來的蛋白質鑒定為免疫原性蛋白。表6中顯示了通過膠內胰蛋白酶消化、MALDI-TOF質譜分析鑒定到的蛋白質的特性。圖3.用乳房鏈球菌菌株0140.T或菌株41-241感染奶牛3A.用乳房鏈球菌菌株0140J經乳腺導管感染奶牛6716和6717。用乳房鏈球菌41-241經乳腺導管感染奶牛6720和6721。注意奶牛6720是用5000cfu乳房鏈球菌進行感染，6721是用500cfu乳房鏈球菌進行感染。SSC表示牛奶中的體細胞計數。BO意味著細菌研究，顯示為以菌落形成單位(cfu)表示的從牛奶中分離的微生物數量。RV表示右前乳區，LA表示左后乳區。3B.感染乳房鏈球菌菌株0140J后，奶牛6718和6719的臨床癥狀以及細菌學和細胞學結果。3C.感染乳房鏈球菌菌株41-241后，奶牛6722和6723的臨床癥狀以及細菌學和細胞學結果。a4.^5^mimmmm^mmpfmmMm^w.實施例實施例1共有表面抗原的選擇DNA序列分析。以2x覆蓋度確定了乳房鏈球菌菌株41-241的DNA序列。將測序數據進行拼接獲得含有1815個ORF的572個連續序列。乳房鏈球菌菌株0140J(Hill，1988)已在Sangercenter測序。2002年4月Sanger網站上提供的序列數據也進行了拼接，獲得了含有1938個ORF的61個毗連片段(contigs)。共有表面抗原的詵擇。成功的疫苗抗原是細菌表面上能夠接觸到抗體的并且是多種乳房鏈球菌菌株共有的蛋白質。通過基因篩選從菌株41-241和0140J的基因組序列中鑒定到表面蛋白，所述基因含有一或多個構成特征基元(參見M&M)的常見于革蘭氏陽性細菌表面蛋白的序列。在所有被分析的ORF中，17個ORF含有將所述蛋白質錨定到細胞壁所需的LPXTG分選酶基元(表1)。17個這樣的蛋白質中的4個(P12，P23，P24和P25)僅見于菌株41-241。31個ORF含有脂蛋白所需的脂質附著基元(表2)。所有這些蛋白均存在于菌株0140J和菌株41-241。另外，挑選了87個含有信號序列或跨膜區的ORF(表3)，預示著所編碼蛋白將定位于細菌表面。這些蛋白在菌株0140J和菌株41-242中都有發現。實施例2所選基因在多種乳房鏈球菌臨床和亞臨床分離物中的分布。為了檢驗所選基因在各種乳房鏈球菌菌株中的存在，進行了斑點雜交試驗，試驗中用從99個所選基因獲得的PCR產物探測大量臨床乳房鏈球菌菌株的染色體DNA。數據(表4)顯示多數所選基因與大多乳房鏈球菌菌株發生雜交，表明多數所選基因普遍存在于各種乳房鏈球菌菌株中。相反，99個被測基因中的4個只與有限量的菌株發生雜交。這些基因全部存在于菌株41-241中，并編碼含有將蛋白錨定到細胞壁所需的LPXTG分選酶基元的蛋白質。實施例3所選表面蛋白的免疫原性。為了評價這些蛋白質是否可以作為疫苗候選對象，將115個所選基因編碼的蛋白克隆并在大腸桿菌中表達為帶有多組氨酸標簽。這些基因中的106個的產物被成功克隆并在大腸桿菌中進行了表達。隨后，通過Western印跡分析檢測得自感染了乳房鏈球菌的奶牛的血清，以及得自用福爾馬林滅活或超聲破碎的乳房鏈球菌細胞免疫的兔的血清中是否存在針對上述表達的蛋白質的特異抗體。結果(表5)顯示，表達的蛋白質中的19個被感染了乳房鏈球菌的動物的血清中存在的抗體所識別，表明這些蛋白在奶牛中體內表達，并且是免疫原性的。此外，表達的蛋白質中的30個被用福爾馬林滅活或超聲破碎的乳房鏈球菌細胞免疫過的兔的血清中存在的抗體所識別。表達的蛋白質中的12個被得自感染了乳房鏈球菌的奶牛的血清，以及得自用福爾馬林滅活或超聲破碎的乳房鏈球菌細胞免疫的兔的血清所識別。這些數據表明這些蛋白多數是抗原性的。表5還顯示了某些蛋白質被用菌株41-241和0140J試驗性感染后誘發的抗血清所識別。但是，其他蛋白僅與感染菌株0140J后獲得的血清，或者僅與感染菌株41-241后獲得的血清有陽性反應。這可能顯示了這兩種菌株在體內蛋白表達或者免疫系統可否接觸到這些蛋白質方面的差別。實施例4所選蛋白質的純化。為了進一步評價蛋白質是否可作為疫苗候選對象，將被來自感染奶牛的血清和/或來自免疫的兔的血清所識別的全部36種蛋白質進行了純化。此外，含有分選酶基元但與兩種血清都未發生反應的4種蛋白質也被純化。這40種選定的重組蛋白中的31種成功地以可溶性形式過表達，并且可以在天然條件下純化，而5種蛋白表達為不溶的內含體。這些蛋白質采用變性條件純化并在純化后進行重折疊。有4種蛋白，我們未能純化到足夠進行免疫接種的量。所有36種純化了的蛋白隨后用于免疫小鼠。如Western印跡所示，這些蛋白與得自免疫前的小鼠的血清都沒有反應。相反地，這些蛋白質與得自小鼠的免疫血清有強反應(表5)，表明這些蛋白在小鼠中是高度免疫原性的。誘導產生的抗體的特異性通過抗乳房鏈球菌細胞裂解物(或原生質體上清)的免疫印跡得以證實。結果顯示多數誘導產生的抗體與預期分子量的乳房鏈球菌蛋白特異反應，這清楚地表明這些蛋白質代表能夠在小鼠中誘發免疫反應的(表面)抗原。實施例5誘導抗體的功能特征。我們在FACS分析中使用小鼠血清來研究抗體與完整微囊化乳房鏈球菌細胞(生長在Todd-Hewitt中)的結合。如圖1所示，從免疫前小鼠獲得的血清都不能與完整乳房鏈球菌細胞結合。相反，免疫血清(誘導抗蛋白P11、P15、P17、P20、P25、P26、P27、P63的血清)中的8個與完整細菌細胞強烈結合，而這些血清中的2個(抗蛋白P17、P18)顯示與完整細菌細胞的弱結合。這清楚地表明這些血清所識別的蛋白質在用于培養乳房鏈球菌細菌細胞的條件下表達，并且能夠被抗體接觸到進行結合。此外，圖1清楚地顯示這些蛋白的表達和/或表面可接近性在所用的兩種菌株間不同。表達和/或表面可接近性在三種蛋白(P17、P19和P20)中是保守的。相反，Pll和P63只在使用菌株0140J時被檢測到，而P15、P18、P25和P26只有通過使用菌株41-241被檢測到。P27在菌株41-241和0140J中均暴露在表面，但在菌株41-241上僅被抗血清微弱識別。總的來說，數據清楚地顯示所選抗原中的10個表達在體外生長的細菌的表面，并且可以被完整微囊化細胞上的抗體結合。這些蛋白中的3個在所用的兩種菌株中是保守的。實施例6血清學蛋白質組策略。作為鑒定乳房鏈球菌疫苗候選對象的替代策略，采用了血清學蛋白質組分析。通過2D凝膠電泳將生長在TH培養液中的乳房鏈球菌菌株的蛋白質分開，并用感染乳房鏈球菌的動物的血清中存在的抗體進行探測。鑒定到多種高度免疫原性的乳房鏈球菌蛋白(數據未顯示)。三個斑點成功地與考馬斯亮藍染色的2D凝膠上的蛋白匹配(圖2)。由這些蛋白質，通過Q-TOF分析它們的胰蛋白酶消化產物，將得到的肽質量指紋圖譜與由菌株41-241和0140J的基因組序列分析預測到的所有蛋白的計算機模擬(insilico)肽質量指紋圖譜進行比較。此外，從每個圖譜中挑選的兩種主要胰蛋白酶解肽用于串聯MS。然后將得到的肽的氨基酸序列與由乳房鏈球菌基因組序列預測的氨基酸序列進行比較。所有三種蛋白均可用這種方法成功匹配。表6中列出了鑒定到的蛋白質的特性。這些疫苗候選對象中的一個利用基因組策略也鑒定到了(P63)。這突出了該蛋白作為疫苗候選對象的重要性。實施例7培養物上清與小鼠免疫血清的ELISAP93和P105在兩種菌株的培養物上清中被強烈識別表明這兩種蛋白被這兩種菌分泌出來。實施例8利用模擬體內條件生長在乳清中的乳房鏈球菌細胞進行的FACS分析。按照實施例5的程序測試抗體與生長在類似牛奶的培養基中的乳房鏈球菌細胞的結合。實施例9抗原在不同乳房鏈球菌菌株中的保守性。通過FACS分析研究了所選蛋白質在不同乳房鏈球菌分離物中的表達以及對抗體的可接近性的保守性。這些研究使得能夠挑選針對各種乳房鏈球菌菌株的疫苗候選對象。實施例10在牛中進行的接種和攻擊。未接種疫苗的動物的試驗性感染。試驗性感染后確定了乳房鏈球菌菌株0140J和41-241的毒力。乳房分為四部分，通常稱為乳區。每個乳區包含泌乳細胞、乳導管、乳腔和乳頭。在這個試驗中，分別通過乳頭中的乳導管感染每個乳區的乳腔。接種菌株0140J的8個乳區中的6個被成功感染(圖3，表7)。從得自這些乳區的牛奶中分離乳房鏈球菌0140J的純培養物，檢測到體細胞計數(SCC)水平增加。在兩個乳區(兩只不同的奶牛的；奶牛6717和6719；圖3A和3B)中攻擊后未能檢測到感染。這兩個乳區在試驗過程中保持細菌陰性。兩個乳區中的一個觀察到SCC略有增加。相反，用菌株41-241攻擊的全部8個乳區均建立了感染(圖3A和3C;表7)。這些乳區(奶牛6721和6723)中的4個接種了5xl02cfu的41-241菌株，而其他4個乳區接種了5xl03Cfu(奶牛6720和6722)。接種較高劑量后觀察到更嚴重的效果奶牛的體溫升高更明顯，并且觀察到更嚴重的疾病臨床癥狀(牛奶中的凝塊，乳房持續硬結)(表7；圖3A和3C)。但是，用41-241菌株以5xl02cfu的接種劑量也誘發了乳腺炎的臨床癥狀。以前對菌株0140J觀察到類似的數據(Hill，1988)。較之菌株41-241，用菌株0140J(接種劑量5xl02cfu，研究進行16天)觀察到的乳腺炎臨床癥狀似乎更嚴重(圖3B和3C)。4個乳區中的3個成功感染菌株0140J，并且全部3個都在感染后表現出至少16天的乳腺炎的臨床癥狀。這些乳區中的2個在感染后的16天內維持細菌陽性(圖3B)，一個乳區中35天內均檢測到SCC水平上升(數據未顯示)。感染菌株41-241的全部4個乳區在感染后的10-13天顯示乳腺炎臨床癥狀，但是在第13天之后臨床癥狀陰性(圖3C)。這些乳區中的2個(奶牛6723)在試驗過程(16天)中保持細菌陽性，表明乳房鏈球菌持續存在于乳腺中(圖3C)。感染后3-5天采集的乳房物質的組織學檢驗一般與臨床觀察對應。感染菌株41-241的兩只奶牛和感染菌株0140J的一只奶牛表現出整個腺體的中度到嚴重的乳腺炎，有多形核粒細胞的多病灶泡內積聚、泡內上皮層的局灶性瓦解以及單核細胞的中度間質性浸潤(數據未顯示)。感染菌株0140J的第二只奶牛發生了溫和的多灶性卡他性(multifocalcatarrhal)總的來說，這些數據顯示菌株0140J和41-241對奶牛是病原性的。奶牛的免疫在奶牛中激發抗乳房鏈球菌蛋白的多克隆抗體。利用皮下接種和/或肌內和/或乳房內接種，通過多種免疫方案給奶牛免疫。免疫原性組合物用溶劑(例如磷酸鹽緩沖鹽水)和佐劑(例如油包水佐劑或者無油佐劑)配制。免疫后，采集血樣，測試血清中抗乳房鏈球菌的抗體。免疫接種動物的試驗性感染用500cfu乳房鏈球菌菌株0140J攻擊感染接種和未接種的奶牛。每個乳區經乳頭中的乳導管分別感染。攻擊后，接種了本發明的免疫原性組合物的奶牛表現出較少的乳腺炎臨床癥狀，牛奶的變化較小，SCC水平較低，臨床乳腺炎時間短，熱度低。乳房的臨床評分和組織學證據清楚顯示根據本發明進行的免疫能夠有效抵抗乳房鏈球菌導致的乳腺炎。實施例11抗原與恢復期血清的反應性。利用從14只近期感染了乳房鏈球菌恢復過來的奶牛獲得的野生血清(fieldserum)，通過Western印跡分析來檢測選定的一些蛋白質(P15、P16、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P68、P75、P93和P105)誘發恢復期抗體的能力。12個選定抗原中的6個(P15、P16、P54、P28、P63、P105)被所有14種使用的恢復期血清所識別。這些數據表明這些抗原在導致各自相應感染的所有乳房鏈球菌菌株中都表達，這些抗原在感染宿主的過程中表達，并且這些抗原是高度免疫原性的。這些抗原中的5種(P68、P27、P20、P93和P22)分別被恢復期血清中的8、9、10、11或12種識別。有一種抗原沒有檢測到與任何恢復期血清反應(P75)。實施例12抗原在不同乳房鏈球菌菌株中的保守性。為了表明這些抗原適用于提供抗多種乳房鏈球菌菌株的保護作用，確定了12種選定抗原(P15、P16、P20、P22、P27、P54、P28、P63、P68、P75、P93和P105)在一組近期采集的野外菌株(35株)中的保守性和表達情況。抗原的表達通過用抗純化的抗原的小鼠免疫血清篩選Western印跡來證實。12種抗原中的5種(P15、P16、P28、P75*P105)在97%以上的測試菌株中表達；2種(P27和P63)在94%的菌株中表達；4種(P20、P22、P54和P93)在81-92%的菌株中表達。這些數據清楚地顯示多數抗原的表達在各種乳房鏈球菌菌株中是高度保守的。材料與方法細菌菌株及生長條件乳房鏈球菌菌株41-241于1998年分離自荷蘭一個爆發了乳房鏈球菌乳腺炎的商業奶場(Hill，1988)。菌株41-241顯示了爆發期間在該特定畜群中發現的主要RAPD指紋圖譜類型B(ZadokSetal.，2003)。該菌株分離自感染了乳房鏈球菌至少兩個月的奶牛。感染開始是亞臨床性的，之后發生多次臨床急性發作。乳房鏈球菌菌株0140J和EF20由J.Leigh博士(InstituteforAnimalHealth,Compton,England)惠贈。其他分離自不同荷蘭奶場上乳腺炎臨床病例的乳房鏈球菌和副乳房鏈球菌(S.parauberis)菌株由D.Mevius博士(CIDC，Lelystad,TheNetherlands)、0.Sampimon博士(AnimalHealthService,Deventer,TheNetherlands)或者DierenartsenPraktijk(Diessen，TheNetherlands)提供。其他所有鏈球菌來自ASG(Lelystad，TheNetherlands)的實驗室收藏。除非另有說明，鏈球菌菌株生長在Todd-Hewitt培養液(codeCM189,Oxoid)中，并鋪在含有6%(ν/ν)馬血和0.七葉苷(aesculin)(w/v)的哥倫比亞血瓊脂基礎培養基(Columbiaagarbloodbase，代碼CM331，Oxoid)中。大腸桿菌菌株生長在Luria培養液(18)中，鋪在含有1.5%(w/v)瓊脂的Luria培養液中。如果需要，加入50μg/ml卡那霉素。乳清蛋白的制備。從一個歷史上未發生過乳房鏈球菌感染的奶場(Waiboerhoeve，Lelystad,TheNetherlands)獲得大量牛奶。將牛奶于12，800xg離心30分鐘，除去脂肪。隨后加入40μ1/ml的凝乳酶(Lactoferm，Brouwland,Belgium)，牛奶于37°C溫育2小時，規律地攪拌。過篩除去凝結的牛奶，剩下的上清于12，SOOxg離心30分鐘。通過在0.2umSartobranP濾膜(Sartonus,Goettingen,Germany)上過濾將澄清的上清滅菌。奶樣品和血清。牛奶樣品和血清得自多個荷蘭奶場的臨床乳房鏈球菌乳腺炎病例(Drs.0.Sampimon,AnimalHealthService，Deventer，TheNetherlands)。在米集樣品前，動物均未用抗生素治療。另外，在用乳房鏈球菌菌株0140J和41-241試驗性感染后，在不同時間點采集牛奶和血清。兔抗血清。在兔中激發針對福爾馬林滅活的完整乳房鏈球菌細胞的多克隆抗體和抗超聲破碎的乳房鏈球菌細胞的多克隆抗體。用油包水佐劑中的2-4xl09滅活細胞將兔皮下免疫。2、3和4周后重復接種。6周后，殺死兔并采集血清。為了制備抗原，將乳房鏈球菌菌株在Todd-Hewitt培養液中生長16小時。將培養物10倍稀釋于IL個預熱的Todd-Hewitt培養液中，培養細胞至光密度(600nm)達到0.5。將培養液于10，OOOxg離心15分鐘，沉淀溶解在IOOmlPBS(136.89mMNaCl、2.68mMKCl,8.ImMNa2HPO4,2.79mMΚΗ2Ρ04ρΗ7.2)中。隨后，用PBS將光密度(600nm)調節到1.O。為了制備福爾馬林固定的細胞，IOml一份的上述細胞于10，OOOxg離心20分鐘，沉淀重懸于2.5mlPBS中。向該懸浮液加入250μ13%福爾馬林，保持在室溫下16小時。將懸浮液鋪在哥倫比亞瓊脂板上確認沒有活細菌。細胞用PBS洗兩次以除去福爾馬林。為了制備超聲破碎的細胞，IOml—份的上述細胞于10，OOOxg離心20分鐘，沉淀重懸于250μ1PBS中。細胞用尖頂超聲破碎儀(tipsonifier)以100%輸出，50%有荷因數(dutycycle)超聲破碎15分鐘。超聲破碎后，將細胞在PBS中稀釋10倍。兩種抗原均與Specol11混合從而產生油包水乳劑。基因組測序。如Sambrooketal.(1989)所述從乳房鏈球菌菌株41-241分離基因組DNA。將DNA剪切，用于構建質粒文庫。利用染料終止物化學法對隨機克隆測序，并用ABIPRISM3700DNA分析儀(AppliedBiosystems，Warrington，GB)分析。將測序數據拼接得到572個毗連序列(contiguoussequence)。用GLIMMER禾ΠGENEMARK軟件鑒定到開始的一組開放讀框(ORFs)。利用www,cbs.dtu.dk/services/TMHMM提供的稱為TMHMM的計算機程序預測基因中的跨膜螺旋和亞細胞定位。為了搜索每個ORF中是否存在信號肽，使用了SignalP程序(Nielsenetal.，1999)。替代地，信號肽預測可以利用http//osort.nibb.ac.ο提供的PSORT稈序禾口http//www,biology,wustl.edu/gcg/spscan.html提供的稱為GCG-SPScan的程序進行。利用GCG-Findpatterns程序，以下列expressions:PS00013(D，E，R，K)6(L，I，V,M，F，W,S，T，A,G)2(L，I，V,M，F，Y，S，T，A,G，C，Q)(A,G，S)C；g-lpp<(Μ,V)X{0,13}(R，K)(D，E，R，K，Q){6，20}(L，I，V，M，F，E，S，T，A,G)(L，V，I，A，M)(I,V，M，S，T，A，F，G)(A,G)C禾口g-lpp_rvh:(M，V，L)X{0，13}(R,K)(D,Ε,R,K,Q){6，20}(L,I，V，M，F，E，S，T，A，G)(L，V，I，A，M)(I，V，M，S，T，A，F，G)(A，G)C尋找到脂蛋白。含有細胞壁錨定結構域的蛋白利用InterProaccessionIPR001899鑒定。使用BLAST程序搜索與推測的氨基酸序列有序列同一性的蛋白序列。斑點印跡、Southern印跡和雜交。如Sambrooketal.(1989)所述分離染色體DNA0對于斑點印跡，將1μg染色體DNA點在GenescreenPlus膜上。將膜在0.4MNaOH-IMNaCl中于室溫溫育10分鐘以便使DNA變性，在0.6MNaCl,0.06M檸檬酸鈉(pH7.0)中中和10分鐘。對于Southern印跡，如Sambrooketal.(1989)所述在0.8%瓊脂糖凝膠上分離DNA片段，并轉移到Gene-ScreenPlus膜(NEN)上。使用隨機引物標記試劑盒(Boehringer)給DNA探針標記上[(α-32P]dCTP(3000CimmoF1；Amersham)。印跡膜上的DNA于65°C在含有0.5M磷酸鈉、ImMEDTA和7%十二烷基硫酸鈉的緩沖液(pH7.2)中與GeneScreenPlus膜供應商推薦的合適的DNA探針雜交。雜交后，膜用含有40mM磷酸鈉(pH7.2)UmMEDTA、5%SDS的溶液于65°C洗30分鐘兩次，用含有40mM磷酸鈉(pH7.2)、ImMEDTA,1%SDS的溶液于65°C洗30分鐘兩次。在磷屏(Storm;MolecularDynamics)上檢測信號。選定蛋白的克隆和表達。用特異寡核苷酸引物經PCR擴增選中的ORF以便克隆到PET200/D-T0P0(Invitrogen)中。克隆的蛋白不帶有推測的信號序列或預測的跨膜區。構建物轉化到大腸桿菌BL21Star(DE3)(Invitrogen)中進行重組蛋白的表達。對于PCR反應(25μ1)，按照供應商的描述使用PlatinumPfxDNA聚合酶(Invitrogen)。在PerkinElmer9700擴增儀中進行DNA擴增，程序是94°C溫育5分鐘；35個循環的94°C15秒、57°C30秒和68°C2分鐘；以及68°C5分鐘。被表達抗原的免疫檢測。蛋白質用XCellSureLockmini-cell系統(Invitrogen)通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。凝膠中的蛋白質按照制造商的推薦用SYPRO-orange(MolecularProbes,Sunnyvale,Calif.)染色顯像。在磷屏(Storm;MolecularDynamics)上檢測信號。蛋白質通過標準程序(19)轉移到硝酸纖維素膜上。膜在含有4%脫脂牛奶、5%胎牛血清和0.05%Tween20的Blotto=Tris緩沖鹽水(TBS)(50mMTris-HCl[pH7.5]，150mMNaCl)中，室溫(RT)下封閉16小時。為了檢測重組抗原，將膜與抗6xHIStag(Clontech,PaloAlto,CA.)的單克隆抗體一起溫育。按照Sambrooketal.(1989)的描述，用偶聯堿性磷酸酶的抗小鼠抗體和氯化硝基四氮唑蘭/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(nitro-blue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)檢IlJ并顯現結合的抗體。所表達的抗原的免疫原性用來自臨床或亞臨床感染乳房鏈球菌的奶牛的血清樣品，或者用兔抗乳房鏈球菌抗血清來測試。結合抗體按照Sambrooketal.(1989)的描述，用偶聯堿性磷酸酶的兔抗奶牛_或羊抗兔_免疫球蛋白(JacksonImmunoresearch檢測，并用氯化硝基四氮唑蘭/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸顯像。蛋白純化。蛋白質利用Ni-次氮基三乙酸(Ni2+-NTA)柱層析按照制造商(Qiagen)的描述從溶解了的細胞沉淀中親和純化。簡而言之，細胞生長至指數期；加入ImMIPTG，讓細胞在37°C再生長4小時。隨后，收集細胞并裂解。將澄清的上清上樣到Ni2+-NTA瓊脂糖柱子中。洗柱子并將蛋白洗脫。對天然和變性純化，使用不同的緩沖液。變性條件下純化的蛋白通過用溶于286.89mMNaCl、2.68mMKCl、8.ImMNa2HPO4,2.79mMKH2PO4(pH7.2)的6M-0M尿素線性梯度進行透析來復性。純化得到的蛋白進一步用AmiconUltra-45000MWCOfilters(Millipore)濃縮。蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后確定樣品中的蛋白質濃度。凝膠中的蛋白質按照制造商的推薦，用SYPRO-orange(MolecularProbes,Sunnyvale,Calif.)染色來顯現。在磷屏(StormMolecularDynamics)上檢測信號。濃度范圍已知的牛血清清蛋白作為標準來計算凝膠中存在的蛋白質的量。計算使用MolecularDynamics程序。純化蛋白的免疫原性。OFl小鼠用福氏完全佐劑中的20μg純化蛋白皮下免疫。三周后，用福氏不完全佐劑中的20μg純化蛋白重復接種。第二次接種的三周后，將小鼠殺死，收集血清。FACS分析。乳房鏈球菌細胞在Todd-Hewitt培養液中生長至OD6c達到0.5。通過離心收集細胞，在FACS緩沖液(PBS-13，pH7,2[137mMNaCl、2.68mMKC1、8.ImMNa2HPO4,2.8mMKH2POJ-O,5%BSA)中洗一次，在FACS緩沖液中將細胞濃度調節到約OD6tltlLO。細胞(250μ1)通過離心收集，重懸于50μ1含有小鼠抗血清(150稀釋度)的FACS緩沖液中。樣品在冰上保持45分鐘。將細胞用250μ1FACS緩沖液漂洗兩次以除去未結合的抗體。隨后，細胞與含有異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗小鼠二抗(1100稀釋度；DAKOA/S,Glostrup,Denmark)的50μ1FACS緩沖液在冰上保持30分鐘。細胞用250μ1FACS緩沖液漂洗兩次，重懸于100μ1FACS緩沖液中，在熒光激活的細胞分選儀(FACSCalibur,BentonDickinson,FranklinLakes,USA)中檢測結合抗體。全細胞ELISA.通過離心收集指數生長的乳房鏈球菌細胞，重懸于包被緩沖液(pH9.6,0.05MNaHCO3,0.05MNa2CO3)中，將細胞密度調節至0D_1.0。高結合96孔板用每孔100μ1該懸浮液在4°C包被16小時。小孔用ELISA緩沖液(5%Tween-80,0,02%疊氮鈉)漂洗4次，加入血清(在含有0.05%Tween-80,2%NaCl和5%胎牛血清的PBS-13中120稀釋)，板在37°C保溫1小時。板孔用ELISA緩沖液洗4次以除去未結合的抗體。隨后，加入二抗(在含有0.05%Tween-80，2%NaCl和5%胎牛血清的PBS-13中1250稀釋的100μ1偶聯了辣根過氧化物酶的兔抗小鼠(DAKO))，板在37°C保溫1小時。小孔再用ELISA緩沖液洗4次，用100μ1四甲基聯苯胺(TMB)(CeDi-Diagnostics,Lelystad,TheNetherlands)在室溫下檢測結合的抗體。15分鐘后每孔加入100μ10.5ΜH2SO4終止反應。用ELISA檢測儀(ThermoLabsystems，Franklin,USA)讀取450nm的光吸收。雙向凝膠電泳的樣品制備。乳房鏈球菌菌株在100mlTodd-Hewitt培養液中生長16小時。培養物在IL預熱好的Todd-Hewitt培養液中稀釋20倍，細胞生長至光密度(600nm)達到0.5。培養物在10，OOOxg離心20分鐘，沉淀用等體積的250mM蔗糖/25mMTris(pH8.0)洗一次，用等體積的superQ洗一次。將得到的沉淀溶解在5mlsuperQ中。從該懸浮液取1.5ml用尖頂超聲破碎儀(Branson超聲細胞破碎儀250，50%時延，振幅3)超聲破碎15分鐘。隨后，懸浮液用DNAseI和MgCl2(終濃度分別為6.5μg/ml和IOmM)在37°C處理10分鐘。加入蛋白酶抑制劑胃酶抑制劑(ρ印statin)、亮抑酶肽(Ieup印tin)、pefabloc和牛胰蛋白酶抑制劑(aprotinin)至終濃度分別為2.5μg/ml、5μg/ml、25μg/ml和1μg/ml。加入尿素、二硫蘇糖醇和Triton-XlOO至終濃度分別為9M、70mM和2%。將樣品在10，OOOxg離心30分鐘，收集上清，在100，OOOxg再離心30分鐘。收集上清，利用RCDCProteinAssay(BioRad)按照制造商的說明確定樣品中的蛋白濃度。雙向凝膠電泳。將含有50-100μg蛋白質的樣品溶解于450ul樣品緩沖液(8M尿素、2%CHAPS,0.5%IPG緩沖液3_10、70mM二硫蘇糖醇和痕量的溴酚藍)。按照制造商白勺Immobiline18cmDryStrips(3-10NLAmershanPharmaciaBiotech)UyKit^,用該條帶在IPGphor(AmershanPharmaciaBiotech)通過等電點聚焦將蛋白質在第一維分離。聚焦后，立即將條帶隨后在含有10mg/ml二硫蘇糖醇的平衡緩沖液(6M尿素、30%甘油、2%SDS、50mMTris-HCL-pH8.8、痕量的溴酚藍)中平衡15分鐘，在含有25mg/ml碘乙酰胺的平衡緩沖液中平衡15分鐘。按照制造商的說明，將蛋白質在EttanDALTtwelve系統(AmershamPharmaciaBiotech)12.EttanDALT(AmershanPharmaciaBiotech)上通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行第二維分離。染色。凝膠中的蛋白質用PlusOneSilverStainingKit(AmershanPharmaciaBiotech)按照制造商的說明用銀染色，或者如Sambrooketal.(1989)所述，以延長的溫育時間(因為凝膠的塑料襯底)用考馬斯亮藍染色。消化來自2D凝膠的蛋白質。將在考馬斯染色的凝膠上鑒定到的蛋白斑點人工切下。膠條在0.乙酸中冷凍于-80°c直至使用。凝膠中的蛋白如Lietal.(2003)所述用胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化的來自2D凝膠的蛋白斑點的質譜。如Lietal.(2004)所述，用MicromassQ-TOF質譜儀分析胰蛋白酶消化的蛋白斑點。實驗室感染實驗動物。臨床健康的Holstein-Friesian奶牛，在第一次產奶期的2_4周時用于感染。每天7.00a.m.和4.OOp.m給奶牛擠奶兩次。所有奶牛的體細胞計數(SCC)低于2.OxlO5細胞/ml，基于在感染前最后14天對牛奶反復進行微生物評價，是乳腺炎病原菌陰性的，并且沒有乳腺炎發病史。接種物的制備和接種。乳房鏈球菌菌株0140J和41-241用作接種物。將長在含有6%馬血(ν/ν)和0.1%七葉苷(w/v)的哥倫比亞瓊脂板上的單菌落轉移到90mlTodd-Hewitt培養液(Oxoid)中，在37°C過夜培養。將過夜培養物1比10稀釋在相同的培養基中，細菌生長至濃度約3X108cfu/ml(對數生長期)。然后通過離心收集細胞，重懸并稀釋于PBS。每只奶牛的兩個乳區通過池內(intracisternally)接種5xl02(菌株0140J或菌株41-241)或者5xl03(菌株41-241)cfu/5mlPBS。對照乳區接種5mlPBS。注射用一次性乳頭針頭在下午擠奶后進行。接種前，用酒精清潔乳頭。向上按摩接種物使之進入乳腺池。用5xl02cfu的菌株0140J攻擊一組四只奶牛。另一組四只奶牛用菌株41-241攻擊。這些奶牛中兩只用5xl02cfu攻擊，兩只用5xl03cfu攻擊。奶牛用于兩個連續的試驗中，其中一個試驗在45到80小時后結束，第二個在16天后結束。取樣和臨床打分。每次擠奶時，從所有乳區無菌采集奶樣。樣品在含有6%馬血(ν/ν)和0.七葉苷(w/v)的血瓊脂板上進行細菌學檢驗，采用標準程序(InternationalDairyFederation,1981)確定SCC。此外，奶樣保持在_20°C直至分析抗體反應。每次擠奶時，確定奶牛的體溫和牛奶產量，監控奶牛是否有乳腺炎的臨床癥狀(乳房的硬結和牛奶中的凝塊)。每周一次取血樣分析血清中的抗體反應。病理學。對于組織學檢驗，從三個不同水平剖面切片(即在乳腺底部、底部和乳池之間以及乳腺池)的不同位置采集來自各個乳區的乳腺組織。將組織樣品在4%緩沖的福爾馬林中固定，并包埋在石蠟中。對于組織學檢驗，將組織切片切開并用蘇木精/伊紅染色。參考文獻Alber,T.1989.Mutationaleffectsonproteinstability.Annu.Rev.Biochem.58，765-798.Adv.Biochem.Eng.43，75—102(1990)Agri.Biol.Chem.51，51，1587(1987)App1.Environ.Microbiol.50，94(1985)Biotechnology7,596-603(1989)Bramley1991Mastitis:physiologyorpathology,p.3-9.inBurvenich,C.，G.Vandeputte-vanMessom,andA.W.Hill(ed.),Newinsightsintothepathogenesisofmastitis.RijksuniversiteitGent,BelgiumBiseibutsugakuKisokoza(BasicMicrobiology),1990,Vol.8,GeneticTechnology,KyoritsuShuppanDeGreeffetal(2002),InfectImmun.701319-1325FEMSMicrobiol.Lett.26，239(1985)Fersht,A.R.andL.Serrano,1993.principlesofproteinstabilityderivedfromproteinengineeringexperiments.Curr.OpinionStruct.Biol.,3,75-83Finch,J.M.，A.Winter,A.W.WaltonandJ.A.Leigh.1997.FurtherstudiesontheefficacyofalivevaccineagainstmastitiscausedbyStreptococcusuberis.Vaccine151138-43.Fontaine,Μ.C.，J.Perez-Casal,Χ.Μ.Song,J.Shelford,P.J.Willson,A.A.Potter.2002.ImmunisationofdairycattlewithrecombinantStreptococcusuberisGapCorachimericCAMPantigenconfersprotectionagainstheterologousbacterialchallenge.Vaccine20:2278-2286.Grandi,G.2001.Antimicrobialvaccinedesignusinggenomicsandproteomics.TrendsinMicrobiol.19:181_188.Hill，A.W.1988.PathogenicityoftwostrainsofStreptococcusuberisinfusedintolactatingandnon—lactatingbovinemammaryglands.ResVetSci.45400-404.HillertonJ.E.，Μ.F.Shearn，R.Μ.Teverson,S.Langridge，andJ.M.Booth1993.Effectofpre—milkingteatdippingonclinicalmastitisondairyfarmsinEngland.J.ofDairyResearch60:31_4LHogan，J.S.，K.L.Smith，K.H.Hoblet，D.A.Todhunter，P.S.Schoenberger，W.D.Hueston，D.E.Pritchard，G.L.Bowman,L.E.Heider,B.L.Brockettetal.1989.Bacterialcountsinbeddingmaterialsusedonninecommercialdairies.J.DairySci72:250-258.J.Bacteriol.137，614(1979)J.Bacteriol.145，382-390(1981)Leigh,J.A.1999.Streptococcusuberis:apermanentbarriertothecontrolofbovinemastitis？.Vet.J.157:225_238.Leigh，J.A.2000.VaccinesagainstbovinemastitisduetoStreptococcusuberiscurrentstatusandfutureprospects.Adv.Exp.Med.Biol.480:307-311.Li，K.W.，Μ.P.Hornshaw,R.C.vanderSchors，R.Watson,S.Tate,B.Casetta，C.R.Jimenez,Y.Gouwenberg，E.D.Gunde1finger，K-H.Smalla,andA.B.Smit2004ProteomicsAnalysisofRatBrainPostsynapticDensity.J.Biol.Chem.Vol.279,987-1002.Matthews,B.W.1991.Mutationalanalysisofproteinstability.Curr.OpinionStruct.Biol.,1,17-21.McDougall,1998.Efficacyoftwoantibiotictreatmentsincuringclinicalandsub-clinicalmastitisinlactatingdairycows.NewZealandVet.J.46,226-232.Mol.Cell.Biol.5，3376(1985)NeaveF.K.,F.H.Dodd,R.G.KingwellandD.R.Westgarth.1969.Controlofmastitisinthedairyherdbyhygieneandmanagement.JDairySci.52:696_707.Nielsen,H.,S.Brunak,andG·vonHeijne.1999.Machinelearningapproachestothepredictionofsignalpeptidesandotherproteinsortingsignals.ProteinEngineering12:3_9.OliverS.P.，Μ.J.Lewis,B.E.Gillespie，S.J.Ivey,LH.Coleman，R.A.Almeida，W.Fang，andK.Lamar.1999.Evaluationofapostmilkingteatdisinfectantcontainingaphenoliccombinationforthepreventionofmastitisinlactatingdairycows.J.ofFoodProtection62:1354—1357.Paton，J.C.andP.Giammarinaro.2001.Genome-basedanalysisofpneumococcalvirulencefactors:thequestfornovelvaccineantigensanddrugtargets.TrendsinMicrobiol.9:515_518·PizzaM，V.Scarlato,V.Masignani,M.M.Giuliani，B.Arico,M.Comanducci，G.T.Jennings，LBaldi，E.Bartolini，B.Capecchi,C.LGaleotti，E.Luzzi,R.Manetti,E.Marchetti,M.Mora,S.Nuti,G.Ratti,LSantini,S.Savino，M.Scarselli，E.Storni,P.Zuo，M.Broeker,E.Hundt,B.Knapp,E.Blair,T.Mason，H.Tettelin，D.W.Hood，A.C.Jeffries，N.J.Saunders，D.M.Granoff，J.C.Venter,E.R.Moxon,G.GrandiandR.Rappuoli.2000.IdentificationofvaccinecandidatesagainstserotypeBMeningococcusbywho1e-genomesequencing.Science287:1816—1820·Rappuoli，R.2000.Reversevaccinology.CurrentOpinioninMicrobiol.3445-450.WizemannΤ.M.，J.H.Heinrichs，J.E.Adamou,A.LErwin，C.Kunsch,G.H.Choi，S.C.Barash,C.A.Rosen，H.R.Masure,E.Tuomanen,A.Gayle，Y.A.Brewah，W.Walsh,P.Barren，R.Lathigra,M.Hanson，S.Langermann,S.JohnsonandS.Koenig.2001.UseofwholegenomeapproachtoidentifyvaccinemoleculesaffordingprotectionagainstStreptococcuspneumoniaeinfection.Infect.Immun.69:1593_1598·Sambrook，J.，Ε.F.Fritsch，andT.Maniatis.1989.Molecularcloningalaboratorymanual，2nded·ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.Schalmetal.(1971)Themastitiscomplex-Abriefsummary,p.1-3.InBovineMastitis.Lea&Febiger，Philadelphia.TrendsinBiotechnology7，283—287(1989)VanderBurg,S.H.,W.M.Kast,R.Ε.M.Toes,R.Offringa,C.J.M.Melief,MethodsforselectingandproducingTcellpeptideepitopesandvaccinesincorporatingsaidselectedepitopes.InternationalPatentApplicationWO97/41440.Vriend，G·andV.G.H.Eijsink,1993.Predictionandanalysisofstructure，stabilityandunfoldingofbacillusneutralproteases.J.Computer-AidedMol.Design7，367-396.Wren,B.W.2000.Microbialgenomeanalysis:insightsintovirulence,hostadaptationandevolution.NatureGenetics1:30_39.Yeast8，423-488(1992).ZadoksR.N.，H.G.Allore，H.W.Barkema，0.C.Sampimon，Y.T.GrohnandY.H.Schukken.2001.AnalysisofanOutbreakofStreptococcusuberismastitis.J.DairySci.84:590_599.Zadoks，R.N.，B.Ε.Gillerpie，S.P.Oliver,H.W.Barkema,0.C.Sampimon，andY.H.Schukken.2003.Clinical，epidemiologicalandmolecularcharacteristicsofStreptococcusuberisinfectionsindairyherds.EpidemiolInfect.130:335-349.Zadoks，R.N.，H.G.Allore，H.W.Barkema，0.C.Sampimon，G.J.Wellenberg,Y.T.GrohnandY.H.Schukken.2001.Cow—andquarter-levelriskfactorsforStreptococcusuberisandStaphylococcusaureusmastitis.J.DairySci.842649-2663.<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>P6寸卜003V)OwlodwSJnAVlmMmIVOJ卜《咖辦龍_槭資<N0886I-IN二DH(riildzονοΤΠ28α!πν1(Ι<ΟΤΗ5πυ^2σιιη咖嗆激黎黎^^^εεΓΟιο§1ηt寸90689ldN)QVJ/nslvTmsfcasoxasIo寸·ο-3Βο勢槭釹雄ιοεε二ol-HeCJ(N二Cu<2ln卜003v)t^剌<激制崔馮OzsIOIAnaLiHNIS寸寸槭發禪椒^趣磁途餾HCNCNεΛ69oolodc8coi,003v)^OWlsnsloVLLSATDIXHsg寸sfTi-雄τ^·雄<%06εSOtus卜9doVslViisnfcVATAim^ADlss！fl-躲ETf卜ιηεS1-HH69幻Sd(9寸οων)_-__-_677722OO______<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage47</image><image>imageseeoriginaldocumentpage48</image><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>權利要求鑒定能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的鏈球菌蛋白質的方法，所述方法包括a)鑒定分泌蛋白、表面相關蛋白和/或與細菌毒力因子具有至少50％序列同一性的蛋白的至少一部分；b)挑選步驟a)中鑒定到的在至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型中保守的至少一種蛋白；和c)確定步驟b)中挑選的至少一種蛋白或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物是否能夠特異結合感染了第一鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞，以及感染了第二鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞。2.權利要求1所述的方法，其中所述分泌蛋白和/或表面相關蛋白是通過在鏈球菌基因組至少部分序列中鑒定包含分泌蛋白基元和/或表面相關蛋白基元的基因鑒定到的。3.權利要求1或2所述的方法，其中所述與細胞毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白是通過在鏈球菌基因組至少部分序列中鑒定與細菌毒力因子基因具有至少50%序列同一性的基因鑒定到的。4.權利要求1或2或3所述的方法，其中所述與細菌毒力因子具有至少50%序列同一性的蛋白的鑒定是通過在鏈球菌基因組至少部分序列中鑒定能夠與圖4列出的任何核酸序列的全長核苷酸序列在含有0.5M磷酸鈉、ImMEDTA和7%十二烷基硫酸鈉的緩沖液中，在pH7.2雜交的基因，其中所述核酸分子在用含有40mM磷酸鈉(pH7.2)UmMEDTA和5%十二烷基硫酸鈉的緩沖液在65°C30分鐘洗兩次；且用含有40mM磷酸鈉(pH7.2)UmMEDTA和十二烷基硫酸鈉的緩沖液在65°C30分鐘洗兩次后仍然保持雜交。5.權利要求2、3或4所述的方法，進一步包括挑選在至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型中保守的基因。6.權利要求5所述的方法，進一步包括獲得由所述基因編碼的蛋白、或所述蛋白的免疫原性部分、衍生物和/或類似物。7.權利要求2-6中任一項所述的方法，其中所述基因在原核表達系統中表達。8.權利要求1-7中任一項所述的方法，包括-獲得分離的和/或重組的鏈球菌蛋白；-將所述蛋白與感染了第一鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞，以及感染了第二鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞一起溫育；和-確定蛋白是否能夠結合感染了第一鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞，以及感染了第二鏈球菌菌株和/或血清型的動物的抗體和/或免疫細胞。9.權利要求8所述的方法，進一步包括用編碼所述蛋白的核酸序列表達所述蛋白。10.權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述抗體和/或免疫細胞來源于恢復期血清。11.權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述鏈球菌蛋白能夠引發調理吞噬誘導性抗體。12.權利要求1-11中任一項所述的方法，其中鑒定了能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的至少兩種鏈球菌蛋白。13.通過權利要求1-12中任一項所述的方法鑒定到的至少一種蛋白的制備方法。14.權利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述鏈球菌是乳房鏈球菌。15.能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的鏈球菌蛋白，所述蛋白能通過權利要求1-14中任一項所述的方法獲得。16.能通過權利要求1-14中任一項所述的方法獲得的蛋白、或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物在制備免疫原性組合物中的用途，所述組合物能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應。17.權利要求16所述的用途，其中所述蛋白選自表5和/或表6。18.能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含至少一種能通過權利要求1-14中任一項所述的方法獲得的分離的和/或重組的蛋白，或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物。19.權利要求18所述的免疫原性組合物，所述組合物包含至少兩種能通過權利要求1-12中任一項所述的方法獲得的分離的和/或重組的蛋白，或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物。20.能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含至少一種核酸分子，所述核酸分子編碼至少一種能通過權利要求1-12中任一項所述的方法獲得的蛋白，或所述蛋白的免疫原性部分、衍生物和/或類似物。21.權利要求18-20中任一項所述的免疫原性組合物，其中所述鏈球菌是乳房鏈球菌。22.權利要求18-20中任一項所述的免疫原性組合物，其中至少一種，優選至少兩種所述蛋白選自表5和/或表6。23.免疫原性組合物的制備方法，其中所述組合物能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應，所述方法包括給細胞提供至少一種重組載體，所述至少一種載體包含的核酸序列編碼至少一種能通過權利要求1-14中任一項所述的方法獲得的蛋白質和/或至少一種選自表5和/或表6的蛋白質，和/或其免疫原性部分、衍生物和/或類似物。24.重組核酸分子，其包含的核酸序列處于功能性連接的啟動子的控制下，編碼至少兩種能通過權利要求1-14中任一項所述的方法獲得的蛋白質和/或至少兩種選自表5和/或表6的蛋白質，和/或所述蛋白中至少一種的免疫原性部分。25.重組載體，其包含編碼至少兩種能通過權利要求1-14中任一項所述的方法獲得的蛋白質和/或選自表5和/或表6的蛋白質，和/或所述蛋白中至少一種的免疫原性部分的核酸，或者包含權利要求24所述的重組核酸分子。26.權利要求25所述的重組載體，所述載體是活載體。27.權利要求25或26所述的重組載體，所述載體是鏈球菌。28.權利要求27所述的重組載體，其中所述鏈球菌是乳房鏈球菌。29.權利要求27或28所述的重組載體，其中所述鏈球菌缺少莢膜基因表達產物的至少一部分。30.權利要求27-29中任一項所述的重組載體，其中所述鏈球菌是無莢膜鏈球菌。31.權利要求25-30中任一項所述的重組載體，其包含編碼來源于第一鏈球菌菌株和/或血清型的至少一種蛋白和/或其免疫原性部分的核酸，以及編碼來源于第二鏈球菌菌株和/或血清型的至少一種蛋白和/或其免疫原性部分的核酸。32.分離的宿主細胞，其包含編碼至少兩種能通過權利要求1-14中任一項所述的方法獲得的和/或選自表5和/或表6的蛋白質，和/或所述蛋白中至少一種的免疫原性部分的核酸序列，或者包含權利要求24所述的重組核酸分子，或者包含權利要求25-31中任一項所述的重組載體。33.能夠引發抗鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含權利要求25-31中任一項所述的重組載體。34.權利要求18-22和/或33中任一項所述的免疫原性組合物作為藥物的用途。35.權利要求18-22和/或33中任一項中所述的免疫原性組合物在制備抗乳房鏈球菌乳腺炎的藥物中的用途。36.權利要求18-22和/或33中任一項中所述的免疫原性組合物在制備疫苗中的用途。37.減少和/或控制個體和/或非人動物中的鏈球菌生物體的數量的方法，所述方法包括給所述個體和/或非人動物提供權利要求18-22和/或33中任一項所述的免疫原性組合物。38.藥物組合物，其包含權利要求18-22和/或33中任一項所述的免疫原性組合物以及合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑。39.測量個體和/或非人動物抗鏈球菌的免疫力的方法，所述方法包括確定來自所述個體和/或動物的至少一個樣品中是否存在抗這樣的蛋白質或其免疫原性部分的抗體，所述蛋白質能通過權利要求1-14中任一項所述的方法獲得和/或選自表5和/或表6。40.診斷試劑盒，其包含至少一種能通過權利要求1-14中任一項所述的方法獲得的和/或選自表5和/或表6的蛋白質，或者其免疫原性部分，以及檢測與所述蛋白或其免疫原性部分結合的抗體的工具(means)。41.能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，其包含至少兩種來源于至少一種乳房鏈球菌菌株的重組和/或分離的表面蛋白，和/或所述蛋白中的一種或兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物。42.權利要求41所述的免疫原性組合物，其中所述至少兩種蛋白選自表5和/或表6。43.制備權利要求41或42所述的免疫原性組合物的方法，所述方法包括給細胞提供重組載體，其中所述載體包含的核酸編碼至少兩種表5和/或表6中列舉的蛋白質，和/或所述蛋白中的一種或兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物。44.權利要求43所述的方法，其包括給至少兩種細胞提供權利要求43所述的重組載體，和/或提供包含編碼表5和/或表6中列舉的蛋白質、和/或所述蛋白中的一種或兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物的核酸的重組載體。45.重組分子，其包含處于功能性連接的啟動子的調控下，編碼表5和/或表6中列舉的蛋白質、和/或所述蛋白的免疫原性部分或類似物或衍生物的核酸序列。46.重組分子，其包含處于功能性連接的啟動子的調控下，編碼至少兩種表5和/或表6中列舉的蛋白質、和/或所述蛋白中的一種或兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物的核酸序列。47.活的重組載體，其包含權利要求45或46所述的核酸序列。48.分離的宿主細胞，其包含權利要求45或46所述的核酸序列。49.分離的和/或重組的蛋白性分子，其與權利要求45或46所述的核酸編碼的蛋白具有至少80%的序列同一性。50.分離的和/或重組的蛋白性分子，其與權利要求45或46所述的核酸編碼的蛋白性分子具有至少95%的序列同一性。51.分離的和/或重組的蛋白性分子，其包含權利要求45或46所述的核酸編碼的蛋白性分子中至少25個連續氨基酸的一段。52.編碼權利要求49-51中任一項所述的蛋白性分子的核酸。53.權利要求40或41所述的免疫原性組合物，所述組合物包含權利要求49-51中任一項所述的分離的和/或重組的蛋白性分子。54.能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含活的或滅活的權利要求47所述的重組載體。55.權利要求54所述的免疫原性組合物，其中所述活的或滅活的重組載體是鏈球菌。56.權利要求54或55所述的免疫原性組合物，其中所述活的或滅活的重組載體是乳房鏈球菌。57.能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含權利要求45或55所述的核酸。58.作為藥物的權利要求41或42和/或權利要求53-57所述的免疫原性組合物。59.權利要求41或42和/或權利要求53-57所述的免疫原性組合物在制備抗乳房鏈球菌乳腺炎的藥物中的用途。60.權利要求41或42和/或權利要求53-57所述的免疫原性組合物在制備疫苗中的用途。61.權利要求41或42和/或權利要求53-57所述的免疫原性組合物在減少和/或控制牛奶和/或奶牛乳房中的乳房鏈球菌生物體的數量的用途。62.藥物組合物，其包含權利要求41或42和/或權利要求53-57所述的免疫原性組合物以及合適的載體。63.測量動物抗乳房鏈球菌的免疫力的方法，所述方法包括確定來自所述動物的至少一個樣品中是否存在抗這樣的蛋白質或其免疫原性部分的抗體，所述蛋白選自表5和/或表6，或者是權利要求49-51中任一項所述的蛋白。64.診斷試劑盒，其包含至少一種選自表5和/或表6的蛋白質、或者權利要求49-51中任一項所述的蛋白質、或所述蛋白的免疫原性部分，以及檢測與所述蛋白或其免疫原性部分結合的抗體的工具。65.檢測乳房鏈球菌免疫原性菌株的方法，所述方法包括由來自乳腺炎病例的乳房鏈球菌生物體分離核酸，將所述核酸進行PCR，所述PCR包含權利要求45、46或52所述的核酸或其引物。全文摘要本發明提供了鑒定能夠引發抗至少兩種鏈球菌菌株和/或血清型的免疫反應的鏈球菌蛋白質的途徑和方法。發明進一步公開了能夠引發抗乳房鏈球菌的免疫反應的免疫原性組合物，所述組合物包含至少兩種來源于乳房鏈球菌的重組和/或分離的蛋白質，和/或所述蛋白中的一種或兩者的免疫原性部分或類似物或衍生物。發明還公開了編碼所述蛋白或其免疫原性部分的核酸分子、包含所述核酸分子的宿主細胞和重組載體、以及基于所述蛋白和核酸的疫苗和診斷檢測。文檔編號G01N33/569GK101821627SQ200880110303公開日2010年9月1日申請日期2008年8月5日優先權日2007年8月6日發明者希爾達·E·史密斯申請人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司