對丙型肝炎病毒(hcv)感染具有抑制活性的抗體和其用途的制作方法

專利名稱：對丙型肝炎病毒(hcv)感染具有抑制活性的抗體和其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及對丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性的抗體和其用途。背景領域丙型肝炎病毒(HCV)被發現和鑒定為非甲型和非乙型肝炎的主要致病病毒(非專 利文獻1)。此外，近年來已建立了用于檢測HCV的高靈敏性方法，并且由于輸血引起的新 HCV患者的人數急劇減少。然而，日本的病毒攜帶者人數據推測超過2，000，000人，世界范 圍的數字超過170，000，000人，包括還未發生肝炎癥狀的所謂病毒攜帶者。這主要是因為 由于HCV感染引起的肝炎的慢性率高達70%至80%，目前除了干擾素外還不存在有效的抗 病毒劑。此外，丙型肝炎是具有不良預后的嚴重感染，因為大約一半的慢性丙型肝炎患者將 無例外地經歷從丙型肝炎至肝硬化和肝癌的癥狀的惡化。因此，目的在于預防肝炎攜帶者 發生疾病或消除病毒的抗病毒劑或疫苗的開發還在等待中。當具有包膜的病毒例如HCV感染細胞時，病毒首先需要結合細胞表面上的特定蛋 白質(即，病毒受體)。之后，病毒膜與細胞膜融合，然后病毒基因被注入細胞。HCV的治療 和預防需要可抑制細胞感染的抗體的開發。特別地，可阻止HCV結合細胞表面上的病毒受 體和侵入細胞的抗體是非常重要的。HCV包膜蛋白被認為在HCV與細胞表面的結合中起著至關重要的作用。因此，進 行了關于患者的血清中與包膜蛋白反應的抗體的檢測的研究。展示與ClOO抗體(NS4-NS5 抗體)或核心抗體陽性反應和展示與包膜蛋白抗體陽性反應的患者的百分比發現為大約 10%。因為31位展示與包膜蛋白抗體陽性反應的患者中只有3位被天然治愈，因此認為這 3位患者中產生了中和抗體(非專利文獻2)。經歷中和抗體的產生的患者的百分比低至所 有患者的1%。然而，在急性乙型肝炎的情況下，抗乙型肝炎病毒的包膜蛋白的抗體的產生是 100%，并且病毒被破壞。在HIV的情況下，以很高的頻率檢測到抗HIV包膜蛋白的抗體。只 在10%的患者中檢測到抗HCV包膜蛋白的抗體的事實據推斷是由于存在可使抗HCV包膜蛋 白的抗體的產生復雜化的機制而引起的。(非專利文獻3).同時，已顯示，哺乳動物細胞中表達的HCV E2蛋白可特異性結合存在于人細胞表 面上的CD81 (非專利文獻4)。通過利用這樣的實驗系統，已嘗試展示中和E2蛋白與來自丙 型肝炎患者的CD81的結合的活性(即，結合的中和，稱為“NOB”)的抗體的開發。代表性實例是展示NOB活性的抗體，其可通過從基因型Ia的慢性丙型肝炎患者的 骨髓淋巴細胞制備抗體基因文庫和通過噬菌體展示獲得目的抗體來獲得(專利文獻1)。另 一個研究小組從基因型Ib的丙型肝炎患者的外周B細胞制備了雜交瘤并且獲得展示NOB 活性的抗體(非專利文獻5，專利文獻2)。然而，根據從HCV患者獲得單克隆抗體的上述方法，患者的數量是有限的，并且來 源限制于其中存在抑制HCV感染的抗體的患者。因此，難以增加抑制感染的抗體的庫和發 現用作抗HCV試劑的抗體。此外，已嘗試了其中對小鼠施用重組包膜蛋白以誘導抗體的方法(專利文獻3)和其中將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以制備產生抗體的雜交瘤從而獲得抗包膜蛋白的抗體 的方法(專利文獻4，非專利文獻6)。然而，抑制HCV感染的抗體仍然未被證實。作為至于仍然沒有通過用包膜蛋白免疫動物來制備中和HCV感染的抗體的原因， 有人認為是用于免疫的重組包膜蛋白具有與病毒本身固有的包膜蛋白的結構不同的結構。 已有報導重組包膜蛋白可能經歷聚集，從而不能形成天然構象(非專利文獻7)。也已證明展示NOB活性的抗體將不總是抑制感染(非專利文獻8)。因此，從通過 使用抗體來治療和預防HCV的觀點來看，用于有效誘導抗包膜蛋白的能夠抑制病毒感染的 抗體和抑制病毒感染的抗體的方法的開發是必需的。在上述情況下，近年來已開發了用于在細胞培養系統中制備感染性HCV顆粒的方 法(專利文獻5，專利文獻6和專利文獻7)。與其中包膜蛋白通過基因重組技術表達并且所 得的產物用作抗原的情況相比，HCV顆粒展示傳染性，從而認為HCV抗原的構象得到維持。 因此，此類HCV顆粒可適合作為產生用于抑制HCV感染的抗體的抗原。[專利文獻1]日本專利公開案(kohyo)No. 2005-531286A[專利文獻2]日本專利公開案(kohyo)No. 2006-504645A[專利文獻3]日本專利公開案(kohyo)No. 2004-500366A[專利文獻4]日本專利公開案(kohyo)No. H-06-505389A[專利文獻 δ] WO O5O8O575Al[專利文獻 6]W0 06022422A1[專利文獻 7]W0 06096459A2[非專利文獻 IjChoo 等，Science, 1989，第 244 卷，pp. 359-362[非專利文獻 2]Matsuura 等，J. Virol.，1992，第 66 卷，pp. 1425-1431[非專利文獻 3] Saito 等，Jikken Igaku, 1991，第 9 卷，pp. 2075-2080[非專利文獻 4]Pileri 等，Science, 1998，第 282 卷，pp. 938-941[非專利文獻 5]Hadlock 等，J. Virol.，2000，第 74 卷，pp. 10407-10416[非專利文獻 6] Suzuki 等，Saishin Igaku, 2003，第 58 卷，pp. 2017-2022[非專利文獻7] Op de Beeck 等，J. Gen. Virol.，2001，第 82 卷，pp. 2589-2595[非專利文獻 8]Burioni 等，J. Virol.，2002，第 76 卷，pp. 11775-11779發明的公開內容發明解決的問題本發明的目的是提供抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染的抗體。解決問題的方法本發明的發明人對小鼠施用JFH-I株的丙型肝炎病毒(HCV)顆粒或J6CF株與 JFH-I株的嵌合病毒作為抗原，然后測量已對其施用了 HCV的小鼠的血清中對HCV感染的抑 制活性。結果，他們發現此類HCV顆粒具有對HCV感染的抑制活性。此外，從已對其施用了 HCV顆粒的小鼠制備脾細胞，將脾細胞融合至小鼠骨髓瘤 細胞系來制備產生抗體的雜交瘤，評估由這些雜交瘤產生的抗體對HCV感染的抑制活性， 并且獲得抑制HCV感染的單克隆抗體。這已導致本發明的完成。具體地，本發明包括下列。[1]抗體，其識別獲自丙型肝炎病毒(HCV)的基因組的丙型肝炎病毒(HCV)顆粒 作為抗原并且對丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性的抗體，其中所述丙型肝炎病毒(HCV)的基因組包括彼此連接的下列(i)和(ii)(i) (a)丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株的5’非翻譯區、核心蛋白編碼序列、El蛋 白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列或(b)丙型肝炎病毒(HCV)的J6CF株的 5’非翻譯區、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列； 禾口(ii) JFH-I株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B 蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區。[2]根據上述[1]的抗體，其中丙型肝炎病毒(HCV)基因組是包含序列表的SEQ ID NO :1或2中所示的核苷酸序列的核酸(條件是當核酸是RNA時，將核苷酸序列中的“T”讀 作“U”)。[3]根據上述[1]或[2]的抗體，其中所述抗體類別是IgM。[4]根據上述[1]至[3]的任一項的抗體，其識別序列表的SEQ IDNO 24中所示 的氨基酸序列的至少10個連續氨基酸。[5]根據上述[4]的抗體，其具有含有序列表的SEQ ID NO 52中所示的氨基酸序 列的重鏈可變區。[6]根據上述[4]至[5]的抗體，其具有含有序列表的SEQ ID NO 54中所示的氨 基酸序列的輕鏈可變區。[7]根據上述[4]至[6]的任一項的抗體，其由登錄號為FERMBP-10982的雜交瘤 細胞系產生。[8]根據上述[1]至[3]的任一項的抗體，其識別含有序列表的SEQID NO 44或 45中所示的氨基酸序列中的至少10連續氨基酸。[9]根據上面[8]的抗體，其由登錄號為FERM BP-10980的雜交瘤細胞系產生。[10]根據上述[1]至[3]的任一項的抗體，其識別含有序列表的SEQID NO :36、 45、46、47或48中所示的氨基酸序列中的至少10連續氨基酸。[11]根據上面[10]的抗體，其由登錄號為FERM BP-10981的雜交瘤細胞系產生。[12]用于丙型肝炎病毒(HCV)感染的抑制劑，其包含上述[1]至11]的任一項的 抗體作為活性成分。[13]藥物，其包含上述[1]至11]的任一項的抗體作為活性成分。[14]用于丙型肝炎的治療劑或預防劑，其包含上述[1]至11]的任一項的抗體作 為活性成分。[15]用于檢測丙型肝炎病毒(HCV)的方法，其包括使用根據上述[1]至11]的任 一項的抗體檢測丙型肝炎病毒(HCV)顆粒。發明效果本發明的對HCV感染具有抑制活性的抗體和其用途可用于治療或預防丙型肝炎 以及闡明HCV感染的機制的研究。附圖概述圖IA顯示已對其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清抑制基因2a HCV的感 染的活性。圖IB顯示已對其施用了 J6/JFH-1-HCV的小鼠的血清抑制基因型lb HCV的感 染的活性。
圖2顯示已對其施用了 JFH-I-HCV顆粒的小鼠的血清抑制基因2aHCV的感染的活性。圖3A顯示已對其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清IgG級分抑制HCV感染 的活性。圖3B顯示已對其施用了 J6/JFH-1-HCV的小鼠的血清IgM級分抑制HCV感染的活性。圖4顯示抗J6/JFH-1-HCV單克隆抗體對HCV感染的抑制活性。在圖中，“P. C”表 示未向其中加入抗體的陽性對照的結果；“N. C”表示未向其中加入感染性HCV顆粒的陰性 對照的結果；和“IgG”表示對照抗體的結果。圖5顯示抗JFH-I-HCV單克隆抗體對HCV感染的抑制活性。在圖中，“P. C”表示 未向其中加入抗體的陽性對照的結果；和“N. C”表示未向其中加入感染性HCV顆粒的陰性 對照的結果。圖6A顯示JF/M1-4單克隆抗體對具有來源于JFH-1E1 (包膜蛋白1)的序列的肽 的結合強度。圖6B顯示JF/M1-4單克隆抗體對具有來源于JFH-1E2(包膜蛋白2)的序列 的肽的結合強度。代表圖6A中的肽編號53至56和圖6B中肽編號11和112的條線圖 (vehicles)顯示通過加入PBS而非肽進行的對照實驗。圖7A顯示當與具有來源于J6 El (包膜蛋白1)的序列的肽結合時，J6/1G11-25 單克隆抗體的結合強度。圖7B顯示當與具有來源于J6E2(包膜蛋白2)序列的肽結合時， J6/1G11-25單克隆抗體的結合強度。代表圖7A中肽編號53至56和圖7B中肽編號111和 112的條線圖(vehicles)顯示通過加入PBS而非肽進行的對照實驗。圖8A顯示當與具有來源于J6 El (包膜蛋白1)的序列的肽結合時，J6/4D4-2單 克隆抗體的結合強度。圖8B顯示當與具有來源于E2(J6包膜蛋白2)的序列的肽結合時， J6/4D4-2單克隆抗體的結合強度。代表圖8A中肽編號53至56和圖8B中肽編號111和 112的條線圖(vehicles)顯示通過加入PBS而非肽進行的對照實驗。圖9顯示JF/M1-4單克隆抗體的H鏈可變區中互補決定區(OTR)和構架區的結構 和其氨基酸序列。該H鏈V區從N端至C端按順序包含構架1 (SEQ ID NO 55)、⑶Rl (SEQ ID NO 56)、構架 2 (SEQ ID NO :57)、CDR2 (SEQ ID NO :58)、構架 3 (SEQ ID NO :59)、CDR3 (SEQ IDNO 60)和構架4 (也稱為J區段，J區或J鏈)(SEQ ID NO 61)區域。

圖10顯示JF/M1-4單克隆抗體的L鏈可變區中互補決定區(OTR)和構架區的結構 和其氨基酸序列。該L鏈V區從N端至C端按順序包含構架1 (SEQ ID NO 62)、⑶Rl (SEQ ID N0:63)、構架2(SEQ ID NO :64)、CDR2 (SEQ ID NO :65)、構架 3 (SEQ ID NO :66)、CDR3 (SEQ IDNO 67)和構架4 (也稱為J區段，J區或J鏈)(SEQ ID NO 68)區域。實施本發明的最佳模式本發明涉及可通過使用從特定HCV基因組產生的感染性HCV顆粒作為抗原誘導的 并且可抑制HCV感染的抗體。本發明可通過本領域技術范圍內的常規分子生物學和免疫學技術來進行。此類技 術完整地描述于例如Sambrook等,Molecular Cloning :ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory (第 3 版，2001)或 EdHarlow 等，Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratoryjIgSS0本文中引用的所有出版物、專利和專利申請以全文引用的形式合并入本文。
本說明書包括本申請要求其優先權的日本專利申請案2007-193413中公開的部 分或所有內容。(1)感染性HCV顆粒的制備可在細胞培養系統中產生在本發明中可用作抗原的感染性HCV顆 粒。用于進 行目的的基本技術描述于 WO 04104198A1、WO 06022422A1、WO 06096459 A2、Wakita， Τ.等，Nat. Med. 11 :791_796，2005，Lindenbach, B. D.等，Science 309 :623_626，2005，和 Pietschmann, T.等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，103 :7408_7413，2006。可用于產生感染性HCV顆粒(所述顆粒用于產生本發明的對HCV感染具有抑制活 性的抗體)的HCV基因組的特定實例是基因型2aJFH-l株的病毒基因組RNA，其從5’末端 至3’末端按順序包含5’非翻譯區、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序 列、P7蛋白編碼序列、NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋 白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區。備選地，此類HCV基 因組可由兩個或更多類型的HCV株的病毒基因組RNA組成，其從5末端至3’末端按順序包 含除JFH-I外的HCV株的5’非翻譯區、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼 序列、P7蛋白編碼序列和NS2蛋白編碼序列和JFH-I株的NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編 碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區。此 夕卜，HCV基因組可由兩個或更多類型的HCV菌株的病毒基因組RNA組成，其從5’末端至3’ 末端按順序包含除JFH-I株外的HCV株的5’非翻譯區、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序 列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列和JFH-I株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序 列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’ 非翻譯區。根據本發明的優選實施方案，HCV基因組是嵌合基因組，其從5’末端至3’末端按 順序包含來源于基因型2a的JFH-I株的全長基因組(例如，包含如SEQ ID NO=I中所示的 核苷酸序列的基因組)和J6CF株的5’非翻譯區、核心蛋白編碼區、El蛋白編碼區、E2蛋白 編碼區、P7蛋白編碼區、NS2蛋白編碼區的直至N端上氨基酸16的區域、NS2蛋白編碼區的 從N端上氨基酸17至C端的區域、來源于基因型2aJFH-l株的NS3蛋白編碼區、NS4A蛋白 編碼區、NS4B蛋白編碼區、NS5A蛋白編碼區、NS5B蛋白編碼區和3’非翻譯區。其特別優選 實例是被克隆入J6/JFH-1的核酸，包含如SEQ ID NO 2中所示的核苷酸序列。根據本發明的特別優選實施方案，HCV基因組是包含如SEQ IDNO :1或2中所示的 核苷酸序列的核酸，條件是當核酸是RNA時，將核苷酸序列中的核苷酸“T”讀作“U”。本發 明的感染性HCV顆粒可通過使用HCV基因組RNA或HCV基因組DNA來產生。特別地，本發明涉及對HCV感染具有抑制活性的抗體，其與作為抗原的HCV顆粒反 應，所述HCV顆粒可獲自(a)HCV基因組，其從5’末端至3’末端按順序包含JFH-I株的5’ 非翻譯區、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列、NS2 蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼 序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區，或(b)HCV基因組，其從5’末端至3’末端按順序 包含HCV的J6CF株的5’非翻譯區、核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序 列、P7蛋白編碼序列和JFH-I株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序 列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區(優選所述HCV基因組從5’末端至3’末端按順序包含J6CF株的5’非翻譯區、核心蛋白編碼序列、El 蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序列和編碼NS2蛋白編碼區的直至N端上氨 基酸16的區域的序列和JFH-I株的編碼NS2蛋白編碼區的從N端上氨基酸17至C端的區 域的序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、 NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區)。 當評估本發明的抗體抑制感染的活性時，除了上述HCV顆粒(a)或(b)夕卜，還可使 用從HCV基因組(c)獲得的HCV顆粒，所述HCV基因組(c)包含按下列順序連接的JFH-I 株的5’非翻譯區，基因型lb TH株的核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序 列和 p7 蛋白編碼序列(ffakita,T.等，J. Biol. Chem.，269，14205-14210，1994，JP 專利公開 案(kokai)No. 2004-179A)，JFH-I株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編 碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區(優選 HCV基因組包含按下列順序連接的來源于JFH-I株的5’非翻譯區，TH株的核心蛋白編碼序 列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序列和編碼NS2蛋白編碼區的直至N 端上氨基酸33的區域的序列、編碼NS2蛋白編碼區的從N端上氨基酸34至C端的區域的序 列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B 蛋白編碼序列和3’非翻譯區域)。可通過從包含克隆入轉錄啟動子下游離位點的根據上述(a)至(C)的任一項的全 長HCV基因組RNA的cDNA的載體(例如，含有在T7啟動子的控制之下的克隆的HCV基因組 RNA的載體)合成RNA，然后將RNA導入細胞來制備上述感染性HCV顆粒。可使用試劑盒例 如MEGAscript T7試劑盒(Ambion)，利用含有在Tl啟動子的控制之下的克隆的HCV cDNA 的核酸在體外合成RNA。可將RNA導入任何細胞，只要此類細胞允許HCV顆粒產生。其實例 包括Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞和293細胞的培養細胞。更優選實例 是肝來源的培養細胞例如Huh7細胞。更優選實例包括Huh7細胞和來源于Huh7細胞的細胞 (即，Huh7. 5細胞和Huh7. 5. 1細胞)。此外，可使用通過在Huh7細胞、H印G2細胞、IMY-N9 細胞、HeLa細胞或293細胞中表達CD81和/或密蛋白1基因獲得的細胞。Huh7細胞或來 自Huh7細胞的衍生株細胞是特別優選的。在本發明中，術語“衍生株”是指來源于相關細 胞的細胞系。可通過任何已知的方法將RNA導入細胞。此類方法的實例包括磷酸沉淀法、 DEAE-葡聚糖法、脂質轉染法(lipofection)、顯微注射和電穿孔。脂質轉染法和電穿孔法 是優選的并且電穿孔是更優選的。細胞產生病毒顆粒的能力可利用與釋放在培養液中的構成HCV顆粒的因子例如 核心蛋白、El蛋白或E2蛋白反應的抗體來評估。此外，還可使用特異性引物擴增培養液中 HCV顆粒中包含的HCV基因組RNA來間接檢測HCV顆粒的存在。可通過培養以上述方式向其中導入了 HCV RNA的細胞，向HCV允許細胞 (permissive cell)(例如，Huh7細胞)施用(加入)所得的上清液，然后在48小時后用抗 核心抗體對細胞進行免疫染色以計數被感染的細胞的數目來評估制備的病毒是否具有感 染性。備選地，可通過將細胞提取物在SDS聚丙烯酰胺凝膠上經歷電游，然后通過Western 印跡檢測核心蛋白來進行評估。
(2)感染性HCV顆粒的純化
將含有在上述(1)中獲得的感染性HCV顆粒的病毒溶液經歷例如離心和/或通過 過濾器的過濾來除去細胞和細胞殘渣。可使用具有100，000至500，000的分子截斷值的超 濾性膜將已從其除去殘渣的溶液濃縮大約10至100倍。可以以任意組合或單獨地通過層 析和密度梯度離心純化已從其除去殘渣的含有HCV的溶液。此后，描述了代表性的層析或 密度梯度離心技術，雖然技術不限于此。優選使用含有丙烯基葡聚糖和N，N' _亞甲基雙丙烯酰胺的交聯聚合物作為凝膠 基質的層析載體來進行凝膠過濾層析，更優選通過使用Sephacryl s-300、s-400和s-500 層析來純化HCV顆粒。可使用，優選Q_Sepharose 作為陰離子交換樹脂以及SPSepharose 作為陽離
子交換樹脂進行離子交換層析來純化HCV顆粒。優選可使用樹脂作為載體進行親和層析，所述樹脂包含與其結合的選自肝素、 硫酸化cellulofine、凝集素和各種染料的基質作為純化HCV顆粒的配體。更優選，可 通過使用載體來純化HCV顆粒，所述載體包含與其結合的HiTrapH印arin HP , HiTrap Blue HP s HiTrapBenzamidine FF 、硫酸化 cellulofine、LCA、ConA、RCA_120 和 WGA。最 優選方法是通過使用硫酸化cellulofine作為載體來純化HCV顆粒。根據HCV RNA拷貝數 對溶液中總蛋白質量的比率，HCV顆粒可被純化30倍或更多倍。優選可利用糖聚合物例如氯化銫、蔗糖、Nycodenz 、Ficoll 或pereQii 作
為產生密度梯度的溶質來進行通過密度梯度離心的純化。優選還可使用蔗糖。優選，可使 用水或緩沖液例如磷酸鹽緩沖液、Tris、乙酸鹽或甘氨酸緩沖液。在通過密度梯度離心進行 純化時使用的離心力優選是1 X IO4至1 X IO9g,更優選5 X IO4至1 X IO7g,和最優選5 X IO4 至 5X105g。優選在0°C至40°C，更優選0°C至25°C和最優選0°C至10°C下進行純化。當通過密度梯度離心與柱離層析組合進行純化時，此類技術可以以任何順序進 行。優選，首先通過復數個層析柱，然后進行密度梯度離心來純化HCV顆粒。更優選，將 通過陰離子交換柱層析，然后親和層析獲得的HCV顆粒經歷通過密度梯度離心進行純化。 最優選，通過將用Q-Sepharose 柱獲得的含有HCV顆粒的級分進一步使用基于硫酸化 cellulofine的柱子進行純化，然后通過密度梯度離心純化所得的含有HCV顆粒的級分。在 柱層析和密度梯度離心的步驟過程中，可進行透析或超濾以置換含有HCV顆粒的溶液的溶 質和/或濃縮HCV顆粒。(3)感染性HCV顆粒的滅活本發明的抗體與作為抗原的HCV顆粒反應。當產生本發明的抗體時，HCV顆粒的感染性與抗原性無關，雖然滅活的HCV顆粒的使用是優選的。可通過在例如病毒懸浮液中 加入和混合滅活劑例如福爾馬林、β-丙內酯或戊二醛并且讓滅活劑與病毒反應來滅活感 染性HCV顆粒(Appaiahgari等，Vaccine, 22 =3669-3675,2004)。此外，可用紫外線照射感 染性HCV顆粒以消除病毒的感染性，病毒可被立即滅活。利用紫外線的照射實現了病毒的 滅活而對構成病毒的蛋白質幾乎沒有影響。用于滅活的紫外線的來源可以是商購獲得的殺 菌燈(germicidallamp)。具體地，可使用15w殺菌燈，盡管來源不限于其。在本發明中，使用通過上述方法純化的HCV顆粒，滅活的方法不受純化的或未純化的狀態限制。優選，可在室溫下以20mW/cm2的紫外線照射含有感染性HCV顆粒的溶液，進行至少5分鐘以滅活感染 性HCV顆粒。(4)動物的免疫可通過對動物施用HCV顆粒以通過免疫反應誘導抗體來獲得本發明的抗體。任何 可產生能夠產生雜交瘤的脾細胞的非人動物(非人哺乳動物)例如小鼠、大鼠、倉鼠或兔子 可用于免疫。在本發明中，小鼠是優選的，牽涉小鼠的使用的實例在下面進行了描述。通常，可用上述步驟⑴至(3)中獲得的HCV顆粒抗原免疫4至10周齡的小鼠。根 據情況，可改變或省略純化步驟，以及可省略病毒滅活。通常，通過皮下或腹膜內施用具有 佐劑的抗原數次來進行免疫。佐劑的實例包括但不限于弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑、含 有百日咳疫苗的S氧化招凝膠(aluminum hydroxide gel with pertussisvaccine)、Titer Max Gold(Vaxel)和GERBU佐劑(GERBU Biotechnik)。在不使用佐劑的情況下進行終免疫， 靜脈內或腹膜內施用抗原，然后按照已知的方法(Antibodies =A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory，1988)在HCV顆粒的最終施用后3至10天，優選4天從免疫小 鼠的血清中獲得多克隆抗體。免疫動物是否產生本發明的抗體可通過在終免疫前通過從免 疫動物的眼底或尾靜脈(caudal vein)的靜脈叢采集血液樣品，然后測量抑制用作抗原的 HCV的感染的活性來檢察。根據本發明的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，優選單克隆抗體。此外，本發 明的抗體可來源于任何生物，優選哺乳動物，更優選人。本發明的抗體可以是嵌合抗體(例 如人抗體與來源于其他哺乳動物的嵌合抗體)。特別優選嵌合抗體的實例是通過將小鼠抗 體的高變區上的序列移植入人抗體獲得的人源化抗體。本發明的抗體可以是具有人抗體的 構架區和來源于其他哺乳動物的抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區(包括高變區)的嵌 合抗體。(5)產生單克隆抗體的雜交瘤細胞的制備當制備本發明的抗體，特別地當制備單克隆抗體時，從免疫動物取出脾，將脾細胞 與骨髓瘤細胞融合以制備雜交瘤細胞。可在體外繁殖的任何骨髓瘤細胞都可用于細胞融 合。其實例包括小鼠來源的已建立的細胞例如抗8-氮雜鳥嘌呤小鼠(BALB/c-來源的) 骨髓瘤細胞 P3-X63Ag8-Ul (P3-U1)、SP2/0_Agl4 (SP2/0)、P3_X63_Ag8653 (653)、P3_X63_Ag 8 (X63)禾口 P3/NSl/l-Ag4-l (NSl)。此類細胞系可從 RIKENBioResource Center，ATCC (美 國典型培養物保藏中心)或ECACC(歐洲細胞培養物保藏中心商購獲得。按照常規技術 (Antibodies :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory,1988, Selected Methods inCellular Immunology W. H. Freeman and Company, 1980)進行培養禾口傳代培養。清洗上面獲得的脾細胞和骨髓瘤細胞，將骨髓瘤細胞與脾細胞以1 1至10的 比例混合，將聚乙二醇加入其中以進行細胞融合。聚乙二醇能夠融合細胞，具有較小細胞 毒性的聚乙二醇是優選的，例如，優選可使用聚乙二醇-1500(PEG-1500)。在細胞融合后， 在培養基中懸浮和清洗細胞。使用用于骨髓瘤細胞培養的培養基例如Dulbecco' s改良 MEN培養基或RPMI-1640清洗細胞。選擇用于融合的細胞的培養基以選擇性獲得目的融合 細胞，這樣的培養基的實例是通過向HAT培養基(通過向用于骨髓瘤細胞培養的培養基例 如Dulbecco' s改良MEN培養基中加入2-巰基乙醇(5X I(T5M)、青霉素(100單位/ml)、鏈霉素(lOOyg/ml)和牛血清(FCS) (10%, Invitrogen)制備的培養基)中加入次黃嘌呤 (IO-4M)、胸苷(1.5 X IO-5M)和氨基蝶呤(4X IO-7M)而制備的培養基。
在培養后，分離部分培養上清液，通過HCV感染檢測選擇產生抑制HCV感染的抗體 的細胞。備選地，可通過酶免疫測定選擇產生與HCV蛋白反應的抗體的細胞。隨后，通過在 甲基纖維素培養基中有限稀釋(limiting dilution)或集落形成來進行克隆，選擇已被證 明產生與HCV蛋白反應的抗體和對HCV感染具有抑制活性的抗體的細胞作為單克隆產生抗 體的雜交瘤細胞系。(6)對HCV感染具有抑制活性的抗HCV單克隆抗體的選擇可通過如下或如下面實施例中所描述的使用感染性HCV顆粒測定對HCV感染的抑 制活性的方法來選擇產生對HCV感染具有抑制活性的抗HCV單克隆抗體的雜交瘤。開始時，將感染性HCV顆粒(用于產生所述顆粒的方法描述于上文)與抗體樣品 混合，使反應在37°C下進行1小時。向前一天以5 X IO3個細胞/孔在96孔板上培養的Huh7 細胞中加入樣品(50 μ 1)，然后在37°C下進行培養2. 5小時。在培養后，除去樣品，用PBS 清洗細胞，加入新鮮培養基，繼續培養。48小時后除去培養上清液，用PBS清洗細胞一次， 加入100 μ 1ISOGEN (Nippon Gene)，從細胞制備RNA，定量RNA，然后測量HCV基因組RNA的 量。按照 Takeuchi 等(TakeuchiT.等，Gastroenterology，116 :636_642，1999)的方法通 過定量RT-PCR，通過檢測HCV RNA的5'末端非翻譯區的RNA來檢測HCV RNA。備選地，可通過下列方法評估對HCV感染的抑制活性。開始時，將抗體樣品與感染 性HCV顆粒混合，然后將所得的混合物在37°C下經歷反應，進行1小時。隨后，向前一天已以 1 X IO4個細胞/孔在96孔板上培養的Huh7細胞中加入樣品(50 μ 1)，然后在37°C下進行培 養2.5小時。在培養后，除去樣品，用PBS清洗細胞，加入新鮮培養基，繼續培養。在72小時 后除去上清液，向板中引入冰冷的甲醇，固定細胞。之后，通過空氣干燥除去甲醇，通過使用 ^Wo. 3%Triton -χ 100 (GE Healthcare)白勺 Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)透化細胞。使用克隆 2H9 抗 HCV-核心抗體(Nat Med.，2005，11 :ρρ· 791-6)和 山羊抗小鼠 IgG-Alexa488 (Molecular Probes)，在熒光顯微鏡 IX-70 ；Olympus)下計數HCV 感染的細胞的數目，其中HCV感染被抑制的孔中的樣品稱為陽性克隆。從而，可選擇靶雜交 瘤。所選擇的由雜交瘤產生的單克隆抗體是根據本發明的優選實施方案的抗體。產生本發明的抗體的雜交瘤不受特別限制，只要此類雜交瘤可以以上述方式選 擇。登錄號為FERM BP-10980、登錄號為FERM BP-10981和登錄號為FERM BP-10982的雜 交瘤細胞系是優選的。將雜交瘤細胞系J6/1G11_25(登錄號FERM BP-10980 ；從2007年 7 月 19 日保藏的登錄號=FERM P-21318(受理號(Receipt Number) =FERM AP-21318)轉移 至國際保藏的)、J6/4D4-2(登錄號FERM BP-10981 ；從2007年7月19日保藏的登錄號 FERM P-21319(受理號FERM AP-21319)轉移至國際保藏的)和JF/M1_4(登錄號FERM BP-10982 ；從2007年7月19日保藏的登錄號FERM P_21320(受理號FERM AP-21320)轉移 至國際保藏的)從2007年7 月 19 日起保藏在 International Patent Organism Depositary ofthe National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6，l-l-lHigashi，Tsukuba，Ibaraki,305-8566，Japan)。優選可將此類雜交瘤細胞系在 37°C 下培養于通過向Dulbecco' s改良Eagle培養基(高葡萄糖)中加入ImM丙酮酸鈉、55 μ M 2-巰基乙醇和10%胎牛血清而制備的培養基中。
為了分析以上述方式選擇的雜交瘤細胞系產生的本發明的抗體的表位，可使用基 于HCV蛋白的酶免疫測定(EIA)、Western印跡法、斑點印跡法或其他方法。通過進行用于 抗HCV單克隆抗體的初篩的此類表位分析，可有效地篩選靶向給定的HCV蛋白的抗HCV單 克隆抗體。根據本發明的更優選的對HCV感染具有抑制活性的抗體識別氨基酸序列 WLTPKCLVHYPYRLffHYPC(SEQ ID NO 24)或包含 HCV(特別地，HCV 的 Ji7H-I 株)的 E2 蛋白的 WLTPKCLVHYPYRLffHYPC(SEQ ID NO 24)的至少10個連續氨基酸的氨基酸序列為表位。包 含WLTPKCLVHYPYRLWHYPC中的至少10個連續氨基酸的氨基酸序列優選是LVHYPYRLWH (SEQ ID NO :18)、WLTPKCLVHY(SEQ ID NO 19), PKCLVHYPYR (SEQ ID NO 20)或 YPYRLWHYPC (SEQ ID NO 21)，以LVHYPYRLWH (SEQ ID NO 18)為更優選。識別HCV E2蛋白的氨基酸序列的 NFTIFKIRMY(SEQ ID NO 22)或 IFKIRMYVCG(SEQID NO 23)為表位的抗體是根據本發明的 更優選的對HCV感染具有抑制活性的抗體。在本說明書中，例如，術語“E1蛋白的氨基酸1 至162”是指El蛋白質的氨基酸序列中從氨基酸1至162的區域。同樣地，要類似地理解 代表蛋白質或核酸的一部分的相似表述。根據本發明的優選實施方案的抗體的實例是具有含有如SEQ IDNO 52中所示的 氨基酸序列的重鏈可變區的抗體。此外，根據本發明的優選實施方案的抗體的另一個實例 是具有含有如SEQ ID NO :54中所示的氨基酸的輕鏈可變區的抗體。具有含有如SEQ ID NO :52中所示的氨基酸序列的重鏈可變區和含有如SEQ ID NO :54中所示的氨基酸序列的 輕鏈可變區的抗體(優選單克隆抗體)是更優選的。這樣的單克隆抗體的實例在下面的實 施例中被描述為JF/M1-4單克隆抗體。具有含有如SEQ ID NO :52中所示的氨基酸序列的 重鏈可變區和/或含有如SEQ ID NO :54中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區的抗體可以是 來源于任何生物的抗體，優選來源于哺乳動物的抗體，更優選人抗體或嵌合抗體。可使用通 過將來源于任意生物(例如可容易地進行基因工程改造的小鼠)的重鏈和/或輕鏈可變區 或其互補決定區(高變區)移植入來源于有待對其施用目的抗體的生物(例如，人)的抗 體(優選單克隆抗體)的等同位置獲得的嵌合抗體。嵌合抗體的特別優選實例是通過將小 鼠抗體的高變區(也稱為“互補決定區(CDR) ”)的序列移植入人抗體的相關位置而獲得的 人源化抗體。本發明的抗體可包含來源于JF/M1-4單克隆抗體的分別具有SEQID NOs :56、58 和60的氨基酸序列的CDRl、CDR2和CDR3作為H鏈V區(即，重鏈可變區)的互補決定區 (⑶R)。同樣地，本發明的抗體可包含來源于JF/M1-4單克隆抗體的分別具有SEQ ID NOs 63,65和67的氨基酸序列的⑶R1、⑶R2和⑶R3作為L鏈V區(S卩，輕鏈可變區)的互補 決定區(⑶R)。根據另外的優選實施方案，本發明的抗體可包含分別具有SEQ ID NOs :56、 58和60的氨基酸序列的⑶R1、⑶R2和⑶R3作為H鏈V區(即，重鏈可變區)的互補決定 區(CDR)，和分別具有SEQ ID NOs :63、65和67的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3作為L 鏈V區(即，輕鏈可變區)的互補決定區(CDR)。此類抗體可在重鏈可變區和輕鏈可變區中包含任何構架1至4區。此類抗體也包含來源于除了小鼠以外的生物的任何抗體類型的 構架1至4區(例如，人來源的構架1至4區)。具有來源于JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V 區的⑶Rl至⑶R3和/或L鏈V區的⑶Rl至⑶R3的此類抗體顯示抑制基因型2a HCV顆 粒的感染的活性。
根據本發明的另一個實施方案，對HCV感染具有抑制活性的更優選抗體識別包含 HCV (特別地，J6CF株的HCV)的E2蛋白的氨基酸序列NVTNPEDMPRPYCW(SEQ ID NO 44)或 NYTIHQRMYVGG(SEQ ID NO 45)中至少10個連續氨基酸殘基的氨基酸序列為表位。包含氨 基酸序列 NVTNPEDMPRPYCW(SEQ ID NO :44)或NYTIFKIRMYVGG(SEQ ID NO 45)中至少 10 個 連續氨基酸殘基的氨基酸序列的實例包括NVTNPEDMRP (SEQ ID NO 29)、NPEDMRPYCff (SEQ ID NO :30)、NYTIFKIRMY(SEQ ID NO 31)禾口 IFKIRMYVGG(SEQ ID NO :32)。根據本發明的另外的實施方案，對HCV感染具有抑制活性的更優選抗體識別這樣 的氨基酸序列為表位，所述氨基酸序列包含HCV(特別地，J6CF株的HCV)的El蛋白的氨 基酸序列 FIVSPQHHWFVQDCNC (SEQ ID NO :46)或 MAWDMMMNWS (SEQID NO 36)中至少 10 個 連續氨基酸殘基的氨基酸序列或E2蛋白的氨基酸序列LIDYPYRLWHYPC(SEQ ID NO 47)、 NPEDMRPYCffHYPPRQ (SEQ ID NO :48)或 NYTIFKIRMYVGG (SEQID NO :45)。各自包含 E2 蛋白 的 FIVSPQHHWFVQDCNC(SEQ ID NO 46), MAffDMMMNWS(SEQ ID NO 36), LIDYPYRLffHYPC(SEQ IDNO 47), NPEDMRPYCffHYPPRQ (SEQ ID NO 48)或 NYTIFKIRMYVGG (SEQ ID NO 45)中的氨 基酸序列的至少10個氨基酸的氨基酸序列的實例包括El來源的表位的FIVSPQHHWF(SEQ IDNO :33)、SPQHHWFVQD(SEQ ID NO 34) ,HHWFVQDCNC (SEQ IDNO 35)和 MAWDMMMNWS (SEQ ID NO :36)。E2-來源的表位的實例包括 LIDYPYRLWH(SEQ ID NO 37) ,YPYRLffHYPC (SEQ ID NO: 38),DMRPYCffHYP(SEQ ID NO 39),NPEDMRPYCff(SEQ ID NO 40)和 PYCWHYPPRQ(SEQ ID NO: 41)。
為了選擇本發明的抗體，更特別地，將HCV蛋白固定在載體(S卩，固相化)上，然后 向其加入抗體樣品，然后讓反應在足以形成抗體/抗原復合物的條件下進行一定的時間。 隨后，將所形成的復合物與識別已與信號酶、染料或放射性同位素結合的抗體樣品的抗體 (即，二抗)接觸從而形成第二混合物。將第二混合物在足以形成抗體/抗原復合物的條件 下經歷反應進行一定的時間。借助于酶、染料或放射性同位素檢測識別HCV蛋白的抗體的 存在。可如將HCV蛋白固定至載體上那樣使用HCV顆粒。備選地，可使用利用包含HCV 基因組的核心蛋白編碼序列、El蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列、p7蛋白編碼序列、NS2蛋 白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序 列或NS5B蛋白編碼序列的cDNA在大腸桿菌(E. Coli)、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞等中 表達的蛋白質。此外，可化學合成和使用此類蛋白。有待用于固定的蛋白質的氨基酸序列 的長度不受限制，這樣的長度是3個或更多個氨基酸，更優選8個氨基酸。其中作為JFH-株或J6CF株的包膜蛋白的El蛋白和E2蛋白在哺乳動物細胞中表 達的實例在下面進行了描述。當氨基酸1如于全長JFH-I蛋白的氨基酸序列(NCBI蛋白質 登錄號BAB32872)的起始甲硫氨酸時，JFH-株或J6CF株的El蛋白始于氨基酸192和終于 氨基酸383。El蛋白的從氨基酸353至氨基酸383的區域被認為是跨膜結構域(也稱為“C 末端疏水結構域”)(Cocquerel, L.等，J. Virol. 74 :3623_3633，2000)。JFH-I株或J6CF株的E2蛋白始于上述氨基酸序列的氨基酸384并且終于氨基酸 750。E2蛋白的從氨基酸722至氨基酸750的區域被認為是跨膜結構域(Cocquerel，L.等， J. Virol. 74 :3623_3633，2000)。當在哺乳動物細胞中蛋白質分泌入和表達于培養上清液時，此類蛋白質必需具有信號肽，但它們不必具有跨膜結構域。因此，不具有El或E2蛋白的跨膜結構域的蛋白質包含從氨基酸192至氨基酸352 的區域或從氨基酸384至氨基酸721的區域。氨基酸位置的偏移不是問題，只要氨基酸在性 質上等同即可。在本發明中，JFH-I株的El蛋白的從氨基酸192至氨基酸352的序列，E2 蛋白的從氨基酸384至氨基酸720的序列(和優選從氨基酸384至氨基酸714的序列)，和 J6CF株的El蛋白的從氨基酸192至氨基酸352的序列，和E2蛋白的從氨基酸384至氨基 酸720的序列可用作不包含跨膜結構域的蛋白質。當此類氨基酸編號用于其他序列時，可 用在與全長JFH-I蛋白的氨基酸序列的比對(alignment)中相應的氨基酸編號命名序列。基于GenBank中給定的JFH-I的氨基酸序列，可使用JFH-I的cDNA作為模板通過 PCR合成編碼不含有El或E2蛋白的任何跨膜結構域的蛋白質的核酸，或可完全合成此類核 酸。可通過比對序列(進行比對)來容易地確定除了 JFH-I外的HCV株的相應的 El和E2蛋白區域，從而在考慮HCV株的序列的置換或缺失的情況下，比對的序列的長度 在與JFH-I序列比較中變得最長。可使用遺傳信息處理軟件(例如，GENETYX, Software Development Co.，Ltd.)進行此類分析。當不包含El或E2蛋白的跨膜結構域的蛋白質在哺乳動物細胞中被分泌和表達 時，將編碼此類蛋白質的核酸以使密碼子的讀框正確排列(即，符合讀框)的方式與編碼 信號肽的核酸的下游位點連接，將終止密碼子加至3'末端，然后將所得的核酸插入表達載 體。信號肽主要由疏水氨基酸組成，其包含位于分泌蛋白的N端的至少15至30個氨基酸 殘基，信號肽與蛋白質轉運通過細胞膜的機制相關。可用于蛋白質在哺乳動物細胞中分泌和表達的信號肽可以是分泌蛋白的信號肽。 具有信號肽的載體的實例包括具有小鼠GM-CSF的信號肽序列的載體(日本專利公開案 (kokai)No. S63-276490A (1988))、具有 IgG κ 鏈的信號肽序列的 pSecTag/FRT/V5_His 載 體(Invitrogen)、具有前原胰蛋白酶(pr印rotrypsin)的信號肽序列的p3xFLAG_CMV13載 體(Sigma)、具有IL-2的信號肽序列的pFUSE_Fc2載體(InvivoGen)和具有IgM的信號肽 序列的 pTriEx-7 載體(Novagen)。當表達蛋白質時，此類蛋白以靶蛋白與標記蛋白的融合蛋白的形式表達，可利用 與標記蛋白或分子反應的抗體(所述標記蛋白或分子特異性結合至其)來檢測或純化融合 蛋白。此類標記蛋白也稱為“標簽(tag)”。標記蛋白不受限制，其實例包括FLAG肽(也稱 為 flag 肽或 Flag 肽)、3x FLAG 肽(也稱為 3x FLAG 肽、3x Flag 肽或 3x flag 肽)、HA 肽、 3x HA肽、myc肽、6x His肽、GST多肽、MBP多肽、PDZ結構域多肽、堿性磷酸酶、免疫球蛋白 和抗生物素蛋白。通常將此類肽或多肽融合至靶蛋白的N或C末端，但也可根據需要將此 類肽或多肽插入靶蛋白內。具有前原胰蛋白酶信號肽和3x FLAG肽的融合多肽的載體可以 p3xFLAG-CMV-9載體的形式從Sigma商購獲得。(7)單克隆抗體的制備使上述(6)中選擇的雜交瘤適應無血清培養基例如雜交瘤-SFM(Invitrogen),可 將無血清培養基中培養的上清液指定為單克隆抗體樣品。可使用燒瓶、培養皿、旋動培養 瓶、轉瓶或高密度培養瓶(CELLine, Becton, Dickinson and Company)進行培養。當從動物制備單克隆抗體時，將上面獲得的抗HCV單克隆產生抗體的雜交瘤以2X IO7至5X IO6個細胞/小鼠腹膜內注射入姥鮫烷(pristane)處理的8至10周齡的小鼠、裸小鼠或SCID小鼠(腹膜內注射0.5ml 2，6，10，14-四甲基五烯(姥鮫烷)并且生長2 周)。雜交瘤在10至21天內經歷腹水瘤形成。從小鼠或裸小鼠中采集腹水樣品來制備單 克隆抗體樣品。將獲得的抗體樣品離心以除去細胞或破碎的細胞，使樣品經歷使用40%至 50%的飽和硫酸銨的鹽析，辛酸沉淀、DEAE-瓊脂糖柱、A蛋白柱、G蛋白柱、HiTrap IgM純 化HP-柱(GE Healthcare)、甘露聚糖結合蛋白-柱(Pierce)或凝膠過濾注，單獨地或以適 當的組合進行此類技術來回收IgG或IgM級分。從而獲得純化的單克隆抗體。可使用例如 小鼠單克隆抗體分型試劑盒(Pierce)來確定純化的單克隆抗體亞類。上述(4)至(7)中 獲得的本發明的對HCV感染具有抑制活性的抗體的種類不受特別地限制。在本發明中，IgG 或IgM是優選的，IgM抗體為更優選。(8)人源化抗HCV單克隆抗體的制備人源化抗體也稱為改型(reshaped)人抗體，此類改型人抗體通過將哺乳動物而 非人(例如，小鼠抗體)的互補決定區(CDR)移植入人抗體的互補決定區來獲得，一般基因 重組技術是已知的(EP專利公開案EP 125023)。特別地，使用經制備從而具有在⑶R和FR 的末端區域重疊的區域的幾種寡核苷酸引物，通過PCR來合成被設計來將小鼠抗體的⑶R 連接至人抗體的構架區(FR)的DNA序列。選擇通過互補決定區(OTR)連接的人抗體(其中⑶R形成良好的抗原結合位點) 的構架區。根據需要，可置換抗體可變區中構架區中的氨基酸，以使改型人抗體的CDR形成 適當的抗原結合位點(Sato, K.，等，Cancer Res. 53 :851_856，1993)。當制備本發明的對HCV感染具有抑制活性的人源化抗HCV單克隆抗體時，例如，首 先以下列方式獲得編碼抗HCV單克隆抗體的H鏈V區(VH)和L鏈V區(VL)的cDNA。從產 生抗HCV單克隆抗體的雜交瘤提取mRNA以合成cDNA。將合成的cDNA插入噬菌體或質粒載 體以制備cDNA文庫。利用小鼠的C或V區作為探針從所得的文庫分離具有編碼VH的重組 噬菌體或質粒以及具有編碼VL的cDNA的重組噬菌體或質粒。確定重組噬體或質粒上靶抗 體的VH和VL的完整核苷酸序列，基于核苷酸序列推導VH和VL的完整氨基酸序列。備選地，可通過PCR克隆編碼VH和VL的cDNA。將以上述方式制備的雜交瘤的 cDNA用作模板，使用復數個基于在相關基因中保守的氨基酸序列設計的引物擴增模板，將 cDNA片段克隆入克隆性載體。從而，可獲得編碼VH和VL的cDNA。可將編碼抗HCV抗體的VH和VL的cDNA插入編碼人抗體的H鏈C區(CH)和L鏈 C區(CL)的基因的上游區域來構建編碼人源化抗HCV單克隆抗體的cDNA。在CH中，可使 用Cy1、CY2、CY3禾口 CY4，在CL中，可使用CK禾口 C λ。為了提高抗體的穩定性或其產 量，可修飾C區。在哺乳動物的情況下，可將在哺乳動物中表達目的基因的啟動子、待表達的抗體 和poly A信號與3’末端下游位點有效連接。可使用其表達目的基因。可使用的啟動子的 實例包括病毒啟動子/增強子，例如人巨細胞病毒、逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴 病毒40 (SV40)和來源于哺乳動物細胞的啟動子/增強子例如延伸因子1 α (EFl α )。在大腸桿菌的情況下，可將可在大腸桿菌細胞中表達目的基因的啟動子、用于抗 體分泌的信號序列和待表達的抗體基因有效連接來表達目的基因。啟動子的實例包括Iacz 啟動子、araB啟動子、Trp啟動子和T7啟動子。在昆蟲細胞的情況下，可將可在昆蟲細胞中表達目的基因的啟動子、待表達的抗體基因和poly A信號與3’末端的下游位點有效連接 來表達目的基因。可使用的啟動子的實例包括多角體蛋白啟動子和桿狀病毒OpNMPV來源 的立即早期0pIE2啟動子。可以以與上述用于制備人源化單克隆抗體的方法相似的方法制備根據本發明的 具有含有如SEQ ID NO 52中所示的氨基酸序列的重鏈可變區和/或含有如SEQ ID NO 54 中所示的氨基酸序列的輕鏈可變區的抗體。(9)用作HCV感染的抑制劑當將根據本發明的對HCV感染具有抑制活性的抗體用作HCV感染的抑制劑時，抗 體用作闡明HCV感染機制的研究工具。此外，其優選用作藥物(例如，藥物組合物)，其更優 選用作抗丙型肝炎的治療劑或預防劑。當根據本發明的抗體用作抗丙型肝炎的治療劑或預 防劑時，其用于預防由來自供體器官的器官移植引起的HCV感染。此外，其可與現有的抗病 毒劑例如干擾素和三氮唑核苷(ribavirin)組合使用。根據本發明的對HCV感染具有抑制活性的抗體對于任意形式的丙型肝是有效的。 例如，其對于慢性肝炎或暴發性肝炎是有效的，其對由基因型2a或lb HCV誘導的丙型肝炎 尤其有效。當對患者施用本發明的抗丙型肝炎的治療劑或預防劑時，作為活性成分的本發明 的抗體的有效量為0. OOlmg至1，000mg/kg的體重。備選地，劑量可以是0. 01至100，OOOrng/ kg患者的體重，雖然劑量不限于此。此外，可在患者發生疾病的臨床癥狀之前或之后施用治 療劑或預防劑。按照常規技術(Remington，s Pharmaceutical Science, the latestedition,Mark Publishing Company, Easton, U. S. A.)制備本發明的抗丙型肝炎的治療劑或預防劑，此類 試劑可包含藥學上可接受的載體或添加劑。此類藥學上可接受的載體和添加劑的實例包括水、藥學上可接受的有機溶劑、膠 原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯(carboxyvinylpolymer)、羧甲基纖維素鈉、聚丙 烯酸鈉、s海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠 (xanthan gum)、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、；二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟 油、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和表面活性劑，其作為藥物 添加劑是可接受的。實際的添加劑根據本發明的抗丙型肝炎的治療劑或預防劑的劑型選自上述添加 劑，此類添加劑可單獨地或以適當地組合使用，雖然添加劑不限定于上述添加劑。當添加劑 用于注射制劑時，例如，將純化的抗HCV抗體溶解于溶劑例如生理鹽水、緩沖液或葡萄糖溶 液中時，向其中加入吸附抑制劑例如Tween SO.Tween 20、明膠、人血清白蛋白等，可使用所 得的混合物。備選地，可凍干添加劑以使其以允許其在使用前被溶解和重建的劑型存在。可 用于冷凍干燥的賦形劑的實例包括糖醇例如甘露醇或葡萄糖以及糖。(10)抗體用于HCV檢測的用途可將本發明的抗體用于用于HCV檢測的診斷組合物。例如，使已將本發明的抗體固定在其上的載體或板與可包含HCV抗原的受試樣品 接觸，以產生混合物。將所得的混合物在足以形成抗體/抗原復合物的條件下經歷反應，進 行一段時間。然后，將所產生的復合物與識別已結合信號酶、染料或放射性同位素的HCV抗原的抗體接觸，從而產生第二混合物。將第二混合物在足以形成抗體/抗原復合物的條件 下經歷反應，進行一段時間。借助于酶、染料或放射性同位素的信號，檢測HCV抗原的存在。備選地，將可含有HCV抗原的受試樣品點在可將蛋白質固定至其上的膜(例如，硝 酸纖維素膜或PVDF膜)上以固定受試樣品中含有的蛋白質。然后，將該膜浸漬于5%脫脂 牛奶或BSA溶液中以封閉膜。在清洗膜后，將膜浸漬于已結合酶、染料或放射性同位素 的本發明的抗體的溶液中，讓反應在足以允許固定在膜上的抗原與本發明的抗體形成復合 物的條件下進行一段時間。在清洗膜后，然后借助于酶、染料或放射性同位素的信號檢測固 定在膜上的HCV抗原A的存在。(11)用于抗HCV抗體檢測作為本發明的另一個用途，可檢測識別與本發明的抗體識別的表位相同的表位的 抗HCV抗體。本發明可用作與針對本發明的與HCV抗原反應的抗體和受試抗體的競爭性探 針。例如，將HCV抗原固定在板或膜上，加入已結合酶、染料或放射性同位素的本發明的抗 體和受試抗體，讓反應在足以允許HCV抗原與抗體形成復合物的條件下進行一定的時間。 通過分析酶、染料或放射性同位素信號與固相的結合的減少，可檢測受試抗體是否可檢測 由本發明的抗體識別的相同表位。實施例在下文中，參照實施例更詳細地描述本發明。應當指出這些實施例被提供用于舉 例說明目的，本發明的技術范圍不限定于這些實施例。[實施例1] JFH-1-HCV 顆粒、J6/JFH-1-HCV 顆粒和 TH/JFH-1-HCV 顆粒的制備如Wakita，T.等，Nat. Med.，11，2005，pp. 791-796 和國際公開案 W02004/104198 中所述，制備作為通過克隆cDNA (基因組長度的cDNA)獲得的質粒DNA的pJFH_l，所述cDNA 是通過逆轉錄PUC19質粒的T7RNA啟動子序列下游的丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株(基 因型2a)(所述病毒株是從暴發性肝炎患者分離的)的整個基因組RNA區域獲得的。來源 于JFH-1株的被插入pJFH-1的基因組長度的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO 1中所示。 用EcoRI消化pJFH-1，然后用Bell部分消化以制備質粒DNA片段，該片段缺少從EcoRI位 點至第一個Bell位點的大約2，840bp的片段，純化所得的片段。如國際公開案W0 2006/022422所述，制備作為通過克隆pUC19質粒的T7RNA啟動 子序列下游的來源于HCV J6CF株的基因組長度的cDNA(GenBank登錄號AF177036，Yanagi， M.，等，Virology 262 =250-263,1999)獲得的 pJ6CF。用 EcoRI 和 Bell 部分消化 pJ6CF，純 化所得的大約2，840bp的片段，將所得片段連接至缺少上述EcoRI-BclI的pJFH-1片段，從 而制備質粒DNA pJ6/JFH-l。克隆入PJ6/JFH-1的DNA(SEQ IDN0 2)是嵌合病毒基因組長 度的cDNA，其包含J6CF株的基因組長度的cDNA的5，非翻譯區、編碼核心的序列、E1、E2和 P7蛋白和編碼NS2蛋白的從N末端至氨基酸16的區域的序列；和與其連接的JFH-1株的 基因組長度的cDNA的編碼NS2蛋白的從氨基酸殘基17至C末端的區域的序列、按順序編 碼NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白以及3，非翻譯區的序列。然后以下列方式制備質粒DNA pTH/JFH-1。開始時，向作為模板的JFH-1中 的基因組長度的 cDNA 中加入 10 ii 1 的 Phusion High-FidelityDNA Polymerase 試劑 盒(FINNZYMES)提供的10x緩沖液、4 yl 2mMdNTP混合物、1 yl的各自10 y M的引物 JFH-1-A(SEQ ID NO 4 TGTAAAACGACGGCCAGT)禾口 JFH-l-B(SEQ ID NO 5 :GGTTTAGGATTCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC)，然后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 yl。然后，向其 中加入0. 5 ii 1 PhusionDNA聚合酶(FINNZYMES)，進行PCR以擴增DNA片段，所述DNA片段， 除了 JFH-1株的5’非翻譯區以外，還包含JFH-1-B引物序列中含有的HCV TH株的核心蛋 白編碼序列的一部分。使用30個循環(98°C下進行10秒，55°C下進行15秒和72°C下進行 30秒)來進行PCR。所得的PCR產物稱為1號PCR產物。然后，向作為模板的包含來源于 HCV TH 株的基因組長度的 cDNA 的 pTH 質粒(Wakita 等，J. Biol. Chem.，269 14205-14210， 1994 ；禾口 Moradpour 等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，246 :920_924，1998)中加入 10 u 1 的 Phusion High-FidelityDNA Polymerase 試劑盒(FINNZYMES)提供的 lOx 緩沖液、 2mMdNTP 混合物和 1 u 1 的各自 10 ii M 的引物 TH-C (SEQ ID NO 6 GGTCTCGTAGACCGTGCACCA TGAGCACGAATCCTAAACC)禾口 TH_D(SEQ ID NO :7 :AGATAGCACAACCACCACAGGAGCTTGGCGAGGAATG CCT)，然后加入去離子水以使總量最終達到49. 5 ill。向其中加入0.5 ill Phusion DNA聚 合酶(FINNZYMES)，進行PCR以擴增DNA片段，除了包含TH株的從核心蛋白編碼序列的大部 分至NS2蛋白編碼序列的一部分的區域的序列外，所述DNA片段還包含TH-C引物序列中含 有的JFH-1株的5’非翻譯區的一部分和YH-D引物序列中含有的JFH-1株的NS2蛋白編碼 序列的一部分。使用30個循環(98°C下進行10秒，55°C下進行15秒和72°C下進行30秒) 來進行PCR。所得的PCR產物命名為2號PCR產物。此外，向作為模板的上述pJFH-1中加 AlOu 1 由 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒(FINNZYMES)提供的 lOx 緩沖 液、4 u 1 2mM dNTP 混合物和 1 u 1 的各自 10 ii M 的引物 JFH-1-E (SEQ ID NO 8 :AGGCATTCC TCGCCAAGCTCCTGTGGTGGTTGTGCTATCT)和 JFH_1_F(SEQ ID NO :9 :CAGCTACCGAGGGGTTAAGC)， 然后加入去離子水以使最終總量達到49. 5 ill。向其中加入0.5 ill Phusion DNA聚合酶 (FINNZYMES)，進行PCR以擴增DNA片段，除了 JFH-1株的NS2和NS3蛋白編碼序列的一部 分外，所述片段還包含JFH-1-E引物序列中含有的TH株的NS2蛋白編碼序列的一部分。使 用30個循環(98°C下進行10秒，55°C下進行15秒和72°C下進行30秒)來進行PCR。將所 得的PCR產物命名為3號PCR產物。然后，使用如上制備的1號PCR產物、2號PCR產物和3號PCR產物，利用JFH-1-A 引物(SEQ ID NO 4)和JFH-1-E引物(SEQ ID NO 8)進行PCR。從而，獲得包含彼此連接 的JFH-1株的5’非翻譯區、TH株的從核心蛋白編碼序列至NS2蛋白質編碼序列的一部分 的區域和JFH-1株的從NS2蛋白編碼序列的一部分至NS3蛋白質編碼序列的一部分的區域 的片段(4號PCR產物)。然后，用EcoRI和Spel限制性內切酶處理pJFH-1和4號PCR產物，將所得的片段 連接以獲得質粒DNA pTH/JFH-1。克隆入所得的pTH/JFH-1的嵌合病毒基因組長度的cDNA 的核苷酸序列示于SEQ IDN0 3中。用Xbal切割pJFH-1、pJ6/JFH_l和pTH/JFH-1，然后將其經歷酚/氯仿提取和乙 醇沉淀。將切割的質粒各自用作模板，使用MEGAscriptT7試劑盒(Ambion)合成RNA (參見 W0 2006/022422)。如下所述將所合成的HCV RNA各自用于導入細胞。將Huh-7 細胞(3 X 106 個細胞)和 5 ii g HCV RNA 懸浮于 400 u ICytomix 溶液 (120mM KC1、0. 15mM CaCl2、10mM K2HP04/KH2P04、25mM H印es、2mM EGTA、5mM MgCl2、20mM ATP 和50mM谷光甘肽)中，將懸浮液轉移至4-mm小杯中，使用Gene Pulser (BioRad)以260V 和950 ii F將其經歷HCV RNA至Huh-7細胞內的電穿孔。然后，將已向其中導入HCV RNA的細胞接種在10cm2皿中，然后進行傳代培養。在傳代培養時，使用HCV antigen ELISA test 試劑盒(0RTH0)定量培養上清液中含有的HCV核心蛋白以確認HCV顆粒的產量。選擇含有 大量核心蛋白和具有高HCV顆粒產生活性的培養上清液并且以病毒原液的形式貯存。向已在10-cm培養皿中于10% FCS-DMEM培養基(1 % MEM非必需氨基酸溶液 (Invitrogen) UOmM HEPES-Tris (pH7. 3)和ImM丙酮酸鈉)中培養的Huh_7細胞中加入上 述獲得的大約100 u 1 JFH-1或J6/JFH-1病毒原液以用HCV病毒感染Huh_7細胞。將細胞充分地傳代培養，同時避免細胞培養物變得匯合，將其在225cm2的培養瓶 中從一個培養瓶至4個培養瓶，然后至12個培養瓶進行擴增培養。然后，從8個這樣的 225-cm2培養瓶中分離細胞，將其接種在兩個5層Cellstacks (Corning)中，以650ml/ cellstack的量向其中加入培養基。將獲自另外4個瓶中的細胞接種在12個瓶中，繼續有 效地產生病毒。在傳代培養的第二天，棄去培養基，加入650ml的2% FCS-DMEM培養基(1% MEM 非必需氨基酸溶液(Invitrogen)、10mM HEPES-Tris (pH7. 3)、ImM丙酮酸鈉)。在培養基更 換后3天回收培養基，將其通過0. 45- u m過濾器，然后將所得產物貯存于低溫冰箱中。此 外，在回收培養上清液后向Cellstack中加入650ml的2% FCS-DMEM培養基(1% MEM非必 需氨基酸溶液、10mM HEPES-Tris (pH7. 3)和ImM丙酮酸鈉)，然后繼續培養。在更換培養基 后2天重復相似的方法，回收培養上清液。然后再重復一次相似的方法。將如此回收的培 養上清液用于下面的實施例。由此，證明了在已向其中導入了各自從pJFH-1、pJ6/JFH-1和pTH/JFH_l合成的 RNA的細胞的培養上清液中產生了感染性HCV顆粒。[實施例2] JFH-1、J6/JFH-1 和 TH/JFH-1HCV 顆粒的純化通過下列4個步驟純化實施例1中產生的病毒顆粒。1)濃縮通過使用Pellicon 2Mini Ultrafiltration Module PLCMK V 0. lm2 (300kDa 截 斷值，登錄號P2C300V01，Millipore，在下文中稱為"pellicon 2 mini ”)，將上述實施例中 獲得的含有HCV顆粒的培養上清液濃縮大約30至50倍。將濃縮物通過0. 45-um過濾器 過濾，然后于-80°C下貯存。2)密度梯度超速離心向 Ultra-clear 25 X 89mm 離心管(登錄號 344058，Beckman Coulter)中力口入 3ml 含有冷 60%蔗糖的 TNE 緩沖液(10mM Tris-HCl (pH7. 4)、150mM NaCl,lmM EDTA)，然后在上 面覆蓋7ml含有20%蔗糖的TNE緩沖液。此外，將25ml樣品覆蓋在含有20%蔗糖的TNE 緩沖液上。使用SW-28 (Beckman Coulter)以28，OOOrpm在4°C進行超速離心4小時。使用25G注射針頭(Terumo)穿透管的底部，連續地獲得2. 5ml、3ml、4. 5ml和25ml 的級分。3)肝素柱子的純化用20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡5_ml Hi Trap Heparin HP柱子。將稀釋的級分 (不超過6個柱子)以5ml/分鐘或更慢的流速用于HiTrapH印arin。通過流過50ml 20mM 磷酸鹽緩沖液(PH7)清洗柱子。通過對其使用25ml含有500mM NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液 (pH7)來獲得洗脫級分。此外，通過流過50ml含有3. 8M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)來清洗柱子，然后用20mM磷酸鹽緩沖液(pH7)平衡柱子，并且貯存柱子。4)濃縮和緩沖液交換使用Amicon Ultra-15 離心式過濾器單位(Centrifugal Filter Unit) (Millipore)和TNE緩沖液將洗脫級分經歷濃縮和緩沖液交換。在下述的免疫步驟中，將所 獲得的濃縮物用作含有感染性病毒顆粒的病毒溶液。[實施例3]病毒滅活通過紫外線照射滅活通過實施例2中的步驟1)至4)獲得的濃縮的丙型肝炎病 毒。關于紫外線的來源，可使用GL-15 (Toshiba)。將含有純化的丙型肝炎病毒顆粒(JFH-1 株)的溶液(其具有lX106ffu/ml的感染效價)引入硅涂鋪的聚乙烯Eppendorf管(Assist Co.，Ltd，)中，將管以與紫外線源相距使得可以以20mW/cm2的強度使用紫外線的距離放置， 使用UV-C進行5分鐘。在紫外線照射后，將丙型肝炎病毒顆粒于Dulbecco’ s改良Eagle培養基(DMEM) 中系列稀釋 50 倍、250 倍、1，250 倍、6，250 倍、31，250 倍、156，250 倍和 781，250 倍。在前一天，將Huh-7細胞以1 X 104個細胞/孔接種在96孔多聚L賴氨酸涂鋪的板 (Corning 96孔透明平底多聚L賴氨酸涂鋪的微量培養板，Corning)，將系列稀釋的病毒顆 粒接種于其中，在37°C下培養72小時。在除去培養上清液后，將板浸漬于冰冷的甲醇中以固定細胞。然后，通過空氣干
燥除去甲醇，使用含有 0. 3%Trit()n -X lOO(GEHealthcare)的 Block Ace (Dainippon
Pharmaceutical Co.，Ltd.)透化細胞。使用克隆 2H9 抗 HCV 核心抗體(Wakita，T.等，Nat. Med. 11 791-796,2005)和山羊抗小鼠 IgG_Alexa488 (Molecular Probes)檢測 HCV 感染的 細胞，在熒光顯微鏡(IX-70 ；Olympus)下計數HCV感染的細胞的數目。發現紫外照射的丙 型肝炎病毒的感染效價低于檢測極限。在下列實施例中將被證明已完全喪失感染性的HCV 顆粒用于對小鼠施用。[實施例4]使用滅活的HCV顆粒進行的小鼠的免疫首先制備佐劑。向lOOiU含有已如實施例3中所述滅活的J6/JFH-1-HCV顆粒 (相當于1.4iig HCV核心蛋白；相當于lOyg總HCV蛋白)的溶液中加入等量的弗氏完全 佐劑(Difco)以產生乳劑。乳劑的產生通過在燒杯中制備足夠量的水，將相關混合物的小 滴滴在液體表面，然后觀察液體將不擴散來確認。用醚麻醉Balb/c小鼠(7周齡，雌性)，然 后對其腹膜內施用所制備的含有滅活的J6/JFH-1-HCV顆粒的乳劑來免疫小鼠。兩周后，向lOOiU含有J6/JFH-1-HCV顆粒的溶液(相當于1. 4 y gHCV核心蛋白； 相當于10yg總HCV蛋白)中加入等量的弗氏不完全佐劑(Difco)以產生乳劑，然后如上 所述通過腹膜內施用乳劑再次免疫小鼠。3周后再對小鼠腹膜內施用乳劑以進一步免疫。同樣，也以相同的方式按照上述免疫方案使用實施例3中滅活的JFH-1-HCV顆粒 來免疫小鼠。[實施例5]來源于用滅活的HCV顆粒免疫的小鼠的血清中對HCV感染的抑制活性 的測量在已在實施例4中免疫的小鼠中，將血清樣品經歷對HCV感染的抑制活性的測量， 所述血清樣品通過從用具有基因型2a的結構蛋白的滅活的HCV顆粒(J6/JFH-1-HCV顆粒 或JFH-1-HCV顆粒)免疫的小鼠部分血樣取樣獲得。
將Huh7細胞以5X 103個細胞/孔接種在96孔板上，然后將細胞培養過夜。向實 施例2的步驟1)中獲得的濃縮的J6/JFH-1-HCV病毒溶液中加入血清和肝素(10個單位/ ml)，將所得物在37°C下溫育1小時。在使用前用培養基(含有10%FCS(Invitrogen)、l% MEM 非必需氨基酸溶液(Invitrogen)、10mM HEPES-Tris (pH7. 3)和 ImM 丙酮酸鈉的 DMEM) 將血清稀釋20倍和100倍。在棄去培養基后，以50iU/孔加入病毒溶液，然后在37°C下 溫育3小時。在棄去培養基后，用PBS清洗板一次，以100 yl/孔加入培養基，然后在37°C 下溫育48小時。在棄去培養基后，用PBS清洗板一次，以lOOiil/孔加入Is0gen(Wak0 PureChemical Industries, Ltd.)，按照所附說明書提取總RNA。通過定量RT-PCR對總RNA 進行定量，測定每1 P g總RNA的RNA拷貝數。此外，以下列方式檢查來源于用具有基因型2a的結構蛋白的J6/JFH-1-HCV顆 粒免疫的小鼠的血清是否具有抑制具有基因型lb的結構蛋白的HCV的感染的活性。為 此目的，以與上所述方式相同的方式將實施例1和實施例2中制備的嵌合HCV顆粒(TH/ JFH-1-HCV)(其具有基因型lb的TH株的結構蛋白)和嵌合J6/JFH-1-HCV顆粒(其具有基 因型2a的結構蛋白)用作感染劑來測量血清抑制感染的活性。除了使用在施用HCV顆粒 之前取樣的正常小鼠的血清外，以相同的方式進行對照實驗。結果，發現在用J6/JFH-1-HCV顆粒對小鼠免疫后62天從其獲得的稀釋20倍的血 清具有與對照實驗(100% )相比較下降至15%的J6/JFH-1-HCV的感染水平，從而發現血 清具有抑制具有基因型2a (圖1A)的結構蛋白的HCV顆粒的感染的活性。此外，與對照實 驗(100% )相比較，稀釋20倍的血清使TH/JFH-1-HCV的感染水平下降至34%，從而發現 血清具有抑制具有基因型lb (圖1B)的結構蛋白的HCV顆粒的感染的活性。這些結果顯示 通過用基因型2a進行的HCV免疫誘導的抗體包括抑制基因型lb HCV的感染的抗體以及抑 制基因型2a HCV的感染的抗體。甚至當將從用JFH-1-HCV顆粒免疫后42天獲得的兩只小鼠獲得的血清稀釋100 倍以進行使用時，與對照實驗中HCV顆粒施用前收集的血清(100%)相比較，基因型2a JFH-1-HCV的感染水平降低，從而確認血清具有抑制感染的活性(圖2)。然后，將200 ill來自已對其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清和從HCV顆 粒施用前的正常小鼠收集的血清各自用于1-mlG蛋白瓊脂糖柱(GE Healthcare)，以1ml/ 級分的量用0. 1M甘氨酸緩沖液(pH3. 0)洗脫樣品，然后進行柱清洗。洗脫的蛋白質峰級分 命名為IgG級分，將IgG級分和非吸附級分(IgM級分)分別制備為純化的級分。如下，以 與上所述方式相似的方式測量它們對其HCV感染的抑制活性。以100 u g/ml或10 ii g/ml使用從已對其施用了 HCV顆粒的小鼠的血清獲得的純 化的IgG而非用于上述測量的血清樣品，或以100 y g/ml使用從正常小鼠血清獲得的純化 的IgG。將HCV顆粒(病毒溶液中的)與IgG等混合以獲得107個拷貝/ml，讓其在室溫下 靜置1小時。然后，棄去用于Huh-7細胞(所述細胞已在前一天以4X104個細胞/孔接種 在24孔板中并且在其中進行培養)的培養基，以200 u 1/孔向細胞加入上述病毒顆粒與 IgG抗體的混合物。將細胞在37°C下溫育3小時，棄去含有病毒顆粒的溶液，用PBS清洗孔 一次。向其中加入新鮮培養基，進行培養2天，棄去培養基，用PBS清洗孔一次，然后使用 Trizol試劑(Invitrogen)從細胞提取RNA。測定提取的RNA中含有的HCV RNA的拷貝數。 按照 Takeuchi 等(Gastroenterology，1999，116，pp. 636-42.)的方法測定 RNA 的拷貝數。
然后，以相同的方式測量不吸附至G蛋白瓊脂糖的級分(即，IgM級分)的抑制感 染的活性。作為陽性對照，使用獲自已對其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清(未純 化的)樣品。測量從已對其施用J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠獲得的血清樣品中的蛋白質含 量和IgM級分中蛋白質的含量，然后在向樣品加入相同量的蛋白質的情況下進行抑制感染 的活性的測量的實驗。特別地，將獲自已對其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清混合 以達到5%，將HCV顆混合以成為107個拷貝/ml的混合物。以這樣的量混合IgM級分，以 使包含與上述5%的小鼠血清中的量相同的量的蛋白，混合HCV顆粒以成為107個拷貝/ml。 讓混合物在室溫下靜置1小時。棄去用于Huh-7細胞(已在前一天將所述細胞以4X 104個 細胞/孔接種于24孔板上并且在其中進行培養)的培養基，將病毒顆粒和血清或IgM的混 合物以200 yl/孔加入其中。將細胞于37°C下溫育3小時，棄去含有病毒顆粒的溶液，用 PBS清洗孔一次。加入新鮮培養基，培養2天，棄去培養基，用PBS清洗孔一次，使用Trizol 試劑(Invitrogen)從細胞提取RNA。測定提取的RNA中含有的HCV RNA的拷貝數。按照 Takeuchi 等(Gastroenterology，1999,116, pp. 636-42.)的方法測定 RNA 拷貝數。結果，發現來源于獲自已對其施用了 J6/JFH-1-HCV顆粒的小鼠的血清的IgM級分 對HCV感染具有抑制活性，如圖3中所示。[實施例6]雜交瘤的制備在含有5X10_5M 2-巰基乙醇、100個單位/ml青霉素、100 iig/ml鏈霉素和10%胎 牛血清(FCS，Invitrogen)的Dulbecco，s改良MEM培養基(Invitrogen)中培養小鼠骨髓瘤 細胞系SP2/0細胞(獲自ECACC)，在對數生長期中獲得SP2/0細胞。用無血清Dulbecco’s 改良MEM清洗細胞3次。然后，從已對其施用了實施例4的HCV顆粒(JFH-1顆粒或J6/JFH-1顆粒)的小 鼠制備脾細胞，用無血清Dulbecco’ s改良MEM清洗3次。將SP2/0細胞和小鼠脾細胞以 1 5的比例導入50-ml離心管，以l，000rpm離心細胞10分鐘。將上清液完全吸出，用手 指輕敲管底以使細胞沉淀松散。向細胞中加入lml 50%的于37°C下加熱的聚乙二醇-1500 溶液(Roche)，進行1分鐘，讓反應在37°C下繼續進行1分鐘。然后，逐漸加入lml無血清 Dulbecco，s改良MEM進行1分鐘，再逐漸地加入lml無血清Dulbecco，s改良MEM，進行1 分鐘。最后，加入7ml無血清Dulbecco，s改良MEM進行3分鐘以稀釋聚乙二醇溶液。以 1，OOOrpm離心稀釋劑中的細胞10分鐘，向其中加入50ml HT培養基(含有5X 10_5M 2-巰 基乙醇、100個單位/ml青霉素、100 u g/ml鏈霉素、10% FCS，10_4M次黃嘌呤和1. 5X 10_5M 胸苷的Dulbecco's改良MEM培養基)，通過移液器吸打使細胞沉淀松散。將細胞轉移至兩 個75-cm2培養瓶中，在37°C下于5% C02的培養箱中培養過夜。以1，OOOrpm離心細胞10分鐘，回收細胞。通過輕敲松散細胞沉淀，重懸浮于10ml 的Dulbecco，s改良MEM中。將細胞懸浮液加入至且充分混合于90ml甲基纖維素HAT選擇 培養基(Stem CellTechnology)中，將所得的混合物以10ml/皿的量加入至10-cm培養皿， 將培養物在37°C下于5% C02的培養箱中進行培養。在培養10至14天后，用移液器尖頭吸出各自被認為長自單個細胞的雜交瘤集落， 將其各自導入已向其中加入了 200 ill的含有10%雜交瘤生長因子(Bio Veris)的各HT培 養基的96孔板的孔，然后繼續培養。[實施例7]產生抑制HCV感染的抗體的雜交瘤的篩選
當實施例6中制備的雜交瘤已充分增殖時，回收培養上清液，如下對其進行篩選。通過將E1蛋白和E2蛋白固定在板上，通過EIA評估雜交瘤上清液中的抗體是否 結合固定在板上的蛋白質，并且評估雜交瘤上清液中的抗體是否能夠抑制HCV感染。1)來源于J6CF株的E1和E2蛋白的制備如下制備J6CF菌株的E1和E2蛋白。通過使用來源于基因型2aJ6CF株的基 因組長度的cDNA(GenBank登錄號AF177036)作為模板，使用Advantage GC2PCR試劑盒 (Takara Bio)，禾lj 用 J6EldTM_s(SEQ IDN0 10 :CACAAGCTTGCCGAAGTGAAGAACATCAGT)及 J6EldTM-as(SEQ ID NO 11 :GCTCTAGATTAATGAGCCCCGCTAATGATGTC)通過 PCR 擴增編碼 缺少跨膜區的E1蛋白的基因，當氨基酸1始于J6CF株的全長蛋白質序列(S卩，由J6CF 株的基因組序列KenBank登錄號AF177036編碼的連續蛋白質序列)的N端上起始甲 硫氨酸時，所述跨膜區相當于從氨基酸192至352的區域。將擴增的DNA片段克隆入 pCR-TOPO(Invitrogen)，將3個克隆經歷核苷酸序列分析。包含具有正確核苷酸序列的插 入物的克隆被命名為pT0P0-J6EldTM。用Hindlll和Xbal部分消化pT0P0_J6EldTM，切取含有大約500bp的所得的DNA片 段(E1片段)的凝膠。使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。類似地，用Hindlll 和Xbal消化p3xFLAG-CMV-9 (SIGMA)，將所得產物在1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳，切取含有 大約6，400bp的片段的凝膠，使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。使用T4連接 酶(Takara Bio)將純化的DNA片段彼此連接，從而獲得已將J6CF E1片段整合入其中的動 物細胞表達載體CMV-3xFLAGJ6EldTM。然后，使用Advantage GC2PCR 試劑盒(Takara Bio)，利用 J6E2dTM_s (SEQ ID NO: 12 CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG)和 J6E2dTM_as(SEQ ID NO 13 :GCTCTAGATTACCATCGG ACGATGTATTTTGT)通過PCR克隆編碼缺少跨膜區的E2蛋白的基因，當氨基酸1始于J6CF株 的全長蛋白質序列的N端上的起始甲硫氨酸時，所述跨膜區相當于從氨基酸384至720的 區域。將擴增的DNA片段克隆入pCR-TOPO (Invitrogen)，將3個克隆經歷核苷酸序列分析。 包含具有正確核苷酸序列的插入物的克隆被命名為pT0P0-J6E2dTM。然后，借助于T4DNA連接酶將通過用Hindlll和Xbal消化p3xFLAG-CMV_9 (SIGMA) 而獲得的DAN連接至用Hindlll和Xbal從pT0P0_J6E2dTM切取的大約1，000bp的DNA片 段以進行環化。所得的載體被命名為CMV-3xFLAGJ6E2dTM。如下所述，將CMV-3xFLAGJ6E ldTM和CMV_3xFLAGJ6E2dTM導入來源于猴腎細胞 (登錄號RCB0143，獲自Riken細胞庫)的C0S1細胞以在其中表達蛋白質。將C0S1細胞培養于含有10%胎牛血清(Invitrogen)、100U/ml青霉素和100 ii g/ ml硫酸鏈霉素的Dulbecco’ s MEM(D_MEM Invitrogen)。將C0S1細胞在基因導入的前一 天以1 2的分流比(splitratio)接種在150-cm2培養瓶(Corning Coaster)中，將細胞 在37°C下于5% C02的培養箱中培養過夜。分別地，向D-MEM培養基(Invitrogen)中加入DEAE葡聚糖(Pharmacia)和氯奎 (SIGMA)以分別形成400iig/ml和100 y M的終濃度，每13ml的溶液以0. 1 y g/yl加入 50 u g表達載體(CMV-3xFLAGJ6EldTM或CMV_3xFLAGJ6E2dTM)，然后進行培養。然后吸除培 養的COS 1細胞的上清液，向其中加入10ml PBS(-) (Nissui)，清洗細胞一次。在將PBS(-) 吸除后，每150-cm2培養瓶向其中加入13ml的DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后在5% C02存在的情況下于37°C進行溫育4小時。4小時后，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后用10ml PBS清洗細胞一次。以每 瓶50ml的量向其中加入CH0-SFM培養基(Invitrogen)，在5% C02存在的情況下于37°C 進行培養。4天后將培養上清液收集在50-ml離心管(Corning Coaster)中。在4°C下以 6，OOOrpm(通過使用HITACHI RPR9-2轉子)離心收集的上清液，然后通過0. 2-y m過濾器 (Whatman)進行過濾。如下使用抗FLAG M2瓊脂糖(SIGMA)來純化培養上清液。向500ml培養上清液中 加入1ml抗FLAG M2瓊脂糖，讓反應在4°C (在低溫艙)中進行2小時，同時在轉瓶中進行 攪拌。2小時后，將上清液與抗FLAG M2瓊脂糖的混合物轉移至Econo-Column (BI0-RAD)， 收集流過級分。然后，用10ml TBS(50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH7. 4)清洗柱子2次。通 過使用0. 1M甘氨酸-HC1 (pH3. 5)洗脫6個級分(每一個級分1ml)。在洗脫后立即加入1M Tris-HCl (pH9. 5)進行中和。將級分(各20 yl)在還原條件下經歷SDS-聚丙烯酰胺凝膠 電泳，使用考馬斯亮藍染色。結果，發現來源于J6CF株的E1和E2蛋白被純化2)來源于JFH-1株的E1和E2蛋白的制備如下制備JFH-1株的E1和E2蛋白。通過使用來源于基因型2aJFH_l株的基因組 長度的 cDNA 作為模板，使用 Advantage GC2PCR試劑盒(Takara Bio)利用 JFHEldTM-s (SEQ ID NO 14 :CACAAGCTTGCCCAGGTGAAGAATACCAGT)和 JFHEldTM-as(SEQID NO :15 :GCTCTAGAT TAGTGAGCCCCGCTAACGATGTC)通過PCR擴增編碼El蛋白的基因，當氨基酸1始于J6CF株的 全長蛋白質序列(即，由JFH-1株的基因組序列編碼的連續蛋白質序列氨基酸序列公開于 GenBank 登錄號 AB047639 ；Kato, T.等，Gastroenterology, 125，2003，pp. 1808-1817)的 N 端上的起始甲硫氨酸時，所述El蛋白相當于從氨基酸192至352的區域。將擴增的DNA片 段克隆入pCR-TOPOanvitrogen)，將3個克隆經歷核苷酸序列分析。包含具有正確核苷酸 序列的插入物的克隆被命名為pTOPO-JFHEldTM。用Hindlll和Xbal消化pTOPO-JFHEldTM，切取含有大約500bp的所得的DNA片 段(E1片段)的凝膠。使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。類似地，用Hindlll 和Xbal消化p3xFLAG-CMV-9 (SIGMA)，將所得產物在1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳，切取含有 大約6，400bp的片段的凝膠，使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。使用T4連接 酶(Takara Bio)將純化的DNA片段彼此連接，從而獲得已將JFH-1E 1片段整合入其中的 動物細胞表達載體CMV-3xFLAGJFHEldTM。然后，使用Advantage GC2PCR 試劑盒(Takara Bio)利用 JFE2dTM_s (SEQ ID NO 16 CACAAGCTTGGCACCACCACCGTTGGAG)和 JFE2dTM_as (SEQ ID NO 17 :GCTCTAGATTATGTGATA GCAGGTGAGAGGCC)通過PCR克隆編碼缺少跨膜區的E2蛋白的基因，氨基酸1始于JFH-1株 的全長蛋白質序列的N端上的起始甲硫氨酸時，所述跨膜區相當于從氨基酸384至714的 區域。將擴增的DNA片段克隆入pCR-TOPO (Invitrogen)，將3個克隆經歷核苷酸序列分析。 包含具有正確核苷酸序列的插入物的克隆被命名為pT0P0-JFHE2dTM。用Hindlll和Xbal消化pT0P0_JFHE2dTM，切取含有大約1，000bp的所得的E2片 段的凝膠。使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。類似地，用Hindlll和Xbal消 化p3xFLAG-CMV-9載體(SIGMA)，將所得產物在1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳，切取含有大 約6，400bp的片段的凝膠，使用GeneElute (SIGMA)從凝膠純化DNA片段。使用T4連接酶(Takara Bio)將純化的DNA片段彼此連接，從而獲得已將JFH-1E2片段整合入其中的動物 細胞表達載體 CMV-3xFLAGJFHE2dTM。如下所述，將CMV-3xFLAGJFHEldTM和CMV_3xFLAGJFHE2dTM導入來源于猴腎細胞 (登錄號RCB0143，獲自Riken細胞庫)的C0S1細胞以在其中表達蛋白質。將C0S1細胞培養于含有10%胎牛血清(Invitrogen)、100U/ml青霉素和100 ii g/ ml硫酸鏈霉素的Dulbecco’ s MEM(D_MEM Invitrogen)。將C0S1細胞在基因導入的前一 天以1 2的分流比接種在150-cm2培養瓶(Corning Coaster)中，將細胞在37°C下于5% C02的培養箱中培養過夜。分別地，向D-MEM培養基(Invitrogen)中加入DEAE葡聚糖(Pharmacia)和氯奎 (SIGMA)以分別形成400 u g/ml和100 u M的終濃度，每13ml的溶液中以0. 1 y g/ yl加 A 50u g 表達載體(CMV-3xFLAGJFHEldTM 或 CMV_3xFLAGJFHE2dTM)，然后進行培養。隨后， 吸除培養的COS 1細胞的上清液，向其中加入10ml PBS(-) (Nissui)，清洗細胞一次。在將 PBS㈠吸除后，每150-cm2培養瓶向其中加入13ml的DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后在5% C02存在的情況下于37°C下溫育4小時。4小時后，吸除DEAE葡聚糖-DNA混合物，然后用10ml PBS清洗細胞一次。以每 瓶50ml的量向其中加入CH0-SFM培養基(Invitrogen)，在5% C02存在的情況下于37°C 進行培養。4天后將培養上清液收集在50-ml離心管(Corning Coaster)中。在4°C下以 6，OOOrpm (通過使用HITACHI RPR9-2轉子)離心收集的上清液，然后通過0. 2-y m過濾器 (Whatman)過濾。如下使用抗FLAG M2瓊脂糖(SIGMA)來純化培養上清液。向500ml培養上清液中 加入抗FLAG M2瓊脂糖，讓反應在4°C下(在低溫艙中)進行2小時，同時在轉瓶中進行攪 拌。2小時后，將上清液與抗FLAGM2瓊脂糖的混合物轉移至Econo-Column (BI0-RAD)，收集 流過級分。然后，用10ml TBS(50mM Tris_HCl、150mM NaCl、pH7. 4)清洗柱子2次。通過 使用0. 1M甘氨酸-HC1 (pH3. 5)洗脫6個級分(每一個級分1ml)。在洗脫后立即加入1M Tris-HCl (pH9. 5)進行中和。將級分(各20 yl)在還原條件下經歷SDS-聚丙烯酰胺凝膠 電泳，使用考馬斯亮藍染色。結果，發現來源于JFH-1株的E1和E2蛋白被純化。3)E1和E2蛋白固定板的制備用PBS洗脫來源于J6CF菌株的E1和E2蛋白以產生1 y g/ml的兩種蛋白的每一種 蛋白。向免疫板(immunoplate) (NUNC)的孔中加入E1和E2蛋白混合物的溶液(50 yl)，讓 板在4°C下放置過夜，從而使蛋白質固定在板上。除去蛋白質溶液，向每個孔中加入150 yl Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)，然后將板在室溫下經歷封閉，進行4小 時。用PBS洗脫來源于JFH-1的E1和E2蛋白以產生1 y g/ml的兩種蛋白中的每一種 蛋白。向免疫板(immunoplate) (NUNC)的孔中加入E1和E2蛋白混合物的溶液(50 yl)，讓 板在4°C下放置過夜，從而使蛋白質固定在板上。除去蛋白質溶液，向每個孔中加入150 yl Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)，然后將板在室溫下經歷封閉，進行4小 時。如下所述將這些板用于篩選雜交瘤的培養上清液中的抗HCV抗體。4)使用J6/JFH-1-HCV顆粒抗原制備的雜交瘤的培養上清液的篩選
用含有0.1% Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗上述步驟3)中制備的已在其上固定 了來源于J6CF株的El和E2蛋白的板4次，向孔中加入50 μ 1實施例6中獲得的雜交瘤上 清液樣品，讓反應在室溫下進行1小時，同時用板混合器搖動板。在反應后，用含有0. 1% Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗板4次，向各孔中加入50 μ 1已用含有0. 1 % Tween 20的 PBS稀釋了 5，000倍的HRP-標記的抗小鼠IgG抗體(AmershamBiosciences)，讓反應在室 溫下進行1小時，同時搖動板。在反應后，用含有0. Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗板 4次，使用針對過氧化物酶的顯色試劑盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)進行顯色，使用 Multi-Scan (Titer-Tech)測量450nm處的吸光率，并且選擇陽性克隆。然后，使用J6/JFH-1-HCV顆粒作為感染劑來評估對陽性克隆的培養上清液的HCV 的感染的抑制活性。隨后，將含有J6/JFH1-HCV顆粒的具有lX106fTu/ml的感染效價的 溶液與等量的雜交瘤上清液混合，將混合物在37°C下培養1小時。此后，向已在前一天將 Huh-7細胞以IX IO4個細胞/孔接種入其中的96孔多聚L賴氨酸涂鋪的板(Corning 96 孔透明平底多聚L賴氨酸包被的微量培養板，Corning)中加入J6/JFH-1-HCV顆粒與雜交 瘤培養上清液的混合樣品，在37°C下培養72小時。在除去樣品后，將板浸漬于冰冷的甲醇中以固定細胞。然后，通過空氣干燥除 去甲醇，使用含有 0. 3 % Triton -X 100 (GE Healthcare)的 Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co. ,Ltd.)透化細胞。使用克隆 2H9 抗 HCV 核心抗體(Wakita，T.等，Nat. Med. 11 791-796,2005)和山羊抗小鼠 IgG_Alexa488 (Molecular Probes)檢測 HCV 感染的 細胞，在熒光顯微鏡(IX-70 ;01ympUS)下計數HCV感染的細胞的數目。兩個各自展示更少 數目的感染細胞的樣品被選擇作為產生對HCV感染活性具有抑制作用的單克隆抗體的雜 交瘤細胞。通過有限稀釋克隆這些細胞系，獲得克隆J6/1G11_25(登錄號FERM BP-10980) 和 J6/4D4-2(登錄號FERM BP-10981)。5)使用JFH-I-HCV顆粒抗原制備的雜交瘤的培養上清液的篩選用含有0. 1% Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗上述步驟3)中制備的已在其上固定了 來源于JFH-I株的El和E2蛋白的板4次，向孔中加入50 μ 1實施例6中獲得的雜交瘤上 清液樣品，讓反應在室溫下進行1小時，同時用板混合器搖動板。在反應后，用含有0. 1% Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗板4次，向各孔中加入50 μ 1已用含有0. 1 % Tween20的PBS 稀釋了 5，000倍的HRP-標記的抗小鼠IgG抗體(AmershamBiosciences)，同時搖動板。在 反應后，用含有0. 1 % Tween 20 (SIGMA)的PBS清洗板4次，使用針對過氧化物酶的顯色試 劑盒(SumitomoBakelite Co. ,Ltd.)進行顯色，使用 Multi-Scan(Titer-Tech)測量 450nm 處的吸光率。從陽性克隆中選擇4個克隆作為產生識別JFH-I株的El和/或E2蛋白的 單克隆抗體的雜交瘤細胞系。然后，使用J6/JFH-1-HCV顆粒作為感染劑以與4)中相同的 方式評估對陽性克隆的培養上清液的HCV感染的抑制活性。作為結果，獲得陽性克隆JF/ M1-4 (登錄號FERM BP-10982)。陽性克隆JF/M1-4是產生識別JFH-I株的El和/或E2蛋 白的單克隆抗體和產生抑制J6/JFH-1-HCV感染的抗體的雜交瘤細胞系。[實施例8]抑制HCV感染的單克隆抗體的分析將實施例7中選擇的3個雜交瘤細胞系J6/1G11-25 (登錄號FERMBP_10980)、 J6/4D4-2(登錄號FERM BP-10981)和 JF/M1_4(登錄號FERM BP-10982)從 2007 年 7 月 19 HInternational PatentOrganism Depositary of the National Instituteof Advanced IndustrialScience and Technology(Central 6，1-1-1 Higashi, Tsukuba， Ibaraki,305-8566, Japan)。如下分析從此類雜交瘤細胞系產生的抑制HCV感染的單克隆抗體的性質。1)抗體亞類通過使用ImmunoPure Antibody Isotyping試劑盒(Pierce)分析陽性克隆的培養上清液來確定小鼠抗體亞類。作為克隆的同種型分析的結果，發現所有克隆具有μ-型 H鏈和K-型L鏈。因此，發現這些克隆為IgM亞類。2)分子量將雜交瘤培養在無血清培養基中，將培養上清液經歷使用50%硫酸銨的鹽析，然 后對PBS進行透析。之后，將所得產物在還原條件下經歷SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈，用考 馬斯亮藍染色，估計抗體的H鏈和L鏈的分子量。作為結果，發現來自所有克隆的抗體具有 分子量為70kDa的H鏈和分子量為23kDa的L鏈。3)單克隆抗體的對HCV感染的抑制活性的評估從各雜交瘤細胞系的培養上清液純化單克隆抗體。通過將適應于或培養在無血清 培養基雜交瘤-SFM中的雜交瘤的上清液經歷50%硫酸銨沉淀和對PBS的透析來進行抗體 的純化。通過使用純化的小鼠IgMK (Sigma)作為標準和使用考馬斯染色進行SDS-PAGE來 測定純化的抗體樣品的濃度。以與上所述方式相同的方式評估所制備的純化的來源于雜交瘤細胞系的單克隆 抗體的對HCV感染的抑制活性。S卩，向細胞加入抗體和感染性HCV顆粒，進行溫育，測量感 染細胞中HCV RNA的濃度，分析細胞中HCV RNA的量。由于細胞中HCV RNA是從感染性HCV 顆粒復制而來的，因此如果感染被單克隆抗體抑制，則細胞中HCV RNA的量應當減少。特別地，將純化的單克隆抗體各自與感染性HCV顆粒(J6/JFH-1-HCV顆粒)混合 以使單克隆抗體成為10μ g/ml的混合物以及感染性HCV顆粒達到IO7個拷貝/ml的混合 物，讓所得的產物在室溫下放置1小時。棄去用于已在前一天以4X IO4個細胞/孔接種于 24孔板并且在其中培養的Huh-7細胞的培養基，以200 μ 1/孔向其中加入J6/JFH-1-HCV 顆粒和純化的單克隆抗體的混合物。將細胞在37°C下溫育3小時，棄去含有病毒顆粒的溶 液，用PBS清洗孔一次。加入新鮮培養基，進行培養2天，棄去培養基，用PBS清洗孔一次， 使用Trizol試劑(Invitrogen)提取RNA。測定提取的RNA中含有的HCV RNA的拷貝。根 據 Takeuchi 等(Gastroenterology，1999，116，pp. 636-42.)的方法測定 RNA 拷貝數目。圖4顯示評估純化的來源于雜交瘤細胞系J6/1G11-25、J6/4D4_2和JF/M1-4的單 克隆抗體(分別稱為J6/1G11-25單克隆抗體、J6/4D4-2單克隆抗體和JF/M 1-4單克隆抗 體)和對照抗體(人IgG)對J6/JFH-1-HCV感染的抑制活性的結果。同樣地，圖5顯示評 估純化的來源于雜交瘤細胞系J6/JFH-1-HCV的單克隆抗體和對照抗體對J6/JFH-1-HCV感 染的抑制活性的結果。如圖4和圖5中所示，除了對照抗體外的所有抗體顯示抑制HCV感 染的活性。[實施例9]JF/M1-4單克隆抗體的表位的分析關于JFH-I株的El蛋白的氨基酸1至162 (SEQ ID NO 25)和JFH-I株的E2蛋白 的氨基酸1至337 (SEQ ID NO 26)，合成含有具有10個連續氨基酸的氨基酸序列的肽，所 述氨基酸序列被設計為各自從N端偏移3個氨基酸。對肽的N末端進行生物素化，C末端是甘氨酰胺(委托JPT合成肽)。將合成肽溶解于DMSO中，然后以0. Olnmol/μ 1的濃度溶解于PBS中。向鏈霉抗生物素蛋白涂鋪的板(Nunc)的孔中加入肽溶液(50 μ 1)，讓反應在室溫下進行1小時。然 后，棄去肽溶液，以200 μ 1/孔加入BlockingOne (Nacalai Tesque)，讓板在室溫下靜置5小 時。棄去Blocking One溶液，用150 μ 1/孔的含有0. 05% Tween 20的PBS (ρΗ7. 2)清洗板
4次，以 50 μ 1/ 孔加入用含有 0. 05% Tween 20 的 PBS (ρΗ7. 2)稀釋的 1 μ g/ml 的 JF/M1-4 單克隆抗體，讓反應在室溫下進行1小時。然后，棄去抗體溶液，用150 μ 1/孔的含有0. 05% Tween 2的PBS (ρΗ7. 2)清洗板5次，加入50 μ 1/孔的用含有0. 05% Tween 20的PBS稀釋 5，000倍的HRP-標記的抗小鼠IgG山羊抗體(GE Healthcare)，讓反應在室溫下進行1小 時。在反應后，棄去抗體溶液，用150 μ 1/孔的含有0. 05% Tween20的PBS (pH7. 2)清洗板 5次。在清洗后，使用針對HRP的顯色試劑盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)檢測結合至 肽的抗體。圖6A顯示JF/M1-4單克隆抗體對來源于JFH-I株的El蛋白的表位(肽編號1至 52)的結合強度，所述結合強度用如在OD 450nm處測定的抗體水平來表示。圖6B顯示JF/ M1-4單克隆抗體對來源于JFH-I株的E2蛋白的肽(肽編號1至110)的結合強度，所述結 合強度用如在OD 450nm處測定的抗體水平來表示。當在OD 450nm處的測量值(即，圖6A 或6B中沿著垂直軸的值)為高時，JF/M1-4單克隆抗體對肽的結合強度高，這表示抗體識 別表位。作為結果，JF/M1-4單克隆抗體不識別來源于JFH-I株的El蛋白的任何肽(圖 6A)但識別來源于JFH-I株的E2蛋白的一些肽(圖6B)。特別強的表位是LVHYPYRLWH(SEQ ID NO 18 ；圖6B中的肽編號77)，與所述強肽重疊的肽WLTPKCLVHY (SEQ ID NO :19 ;p圖6B 中的肽編號 75)、PKCLVHYPYR(SEQ ID NO 20 ；圖 6B 中的肽編號 76)和 YPYRLffHYPC(SEQ ID NO 21 ；圖6B中的肽編號78)是弱表位。此外，肽NFTIH(IRMY(SEQ ID NO 22 ；圖6B中的肽 編號82)和Ii7KIRMYVCG (SEQ ID NO 23 ；圖6B中的肽編號83)被鑒定為弱表位。因此，發現JF/M1-4單克隆抗體能夠識別JFH-1株的E2蛋白內的包含強表位的 WLTPKCLVHYPYRLffHYPC (SEQ ID NO 24)為表位。[實施例10]J6/1G11-25單克隆抗體和J6/4D4-2單克隆抗體對J6/JFH-1-HCV顆 粒的表位的分析關于J6CF株的El蛋白的氨基酸1至162 (SEQ ID NO :27)和J6CF株的E2蛋白的 氨基酸1至337 (SEQ ID NO :28)，合成含有具有10個連續氨基酸的氨基酸序列的肽，所述 氨基酸序列被設計為各自從N端偏移3個氨基酸。對肽的N末端進行生物素化，C末端是 甘氨酰胺(委托JPT合成肽)。將合成的肽溶解于DMSO中，然后以0. Olnmol/μ 1的濃度溶解于PBS中。向鏈霉 抗生物素蛋白涂鋪的板(Nunc)的孔中加入肽溶液(50 μ 1)，讓反應在室溫下進行1小時。 然后，棄去肽溶液，以200 μ 1/孔加入Blocking One (Nacalai Tesque)，讓板在室溫下靜置
5小時。棄去 Blocking One 溶液，用 150 μ 1/孔的含有 0. 05 % Tween 20 的 PBS (ρΗ7. 2) 清洗板4次，以50 μ 1/孔加入用含有0. 05% Tween 20的PBS (ρΗ7. 2)稀釋的1 μ g/ml的 J6/1G11-25或J6/4D4-2單克隆抗體，讓反應在室溫下進行1小時。然后，棄去抗體溶液， 用150 μ 1/孔的含有0. 05% Tween2的PBS(pH7. 2)清洗板5次，加入50 μ 1/孔的用含有0. 05% Tween 20的PBS稀釋5，000倍的HRP-標記的抗小鼠IgG山羊抗體(GEHealthcare)， 讓反應在室溫下進行1小時。在反應后，棄去抗體溶液，用150 μ 1/孔的含有0.05% Tween 20的PBS (ρΗ7. 2)清洗板5次。然后，借助于針對HRP的顯色試劑盒(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)，使用分光光度計(在OD 450nm)檢測結合至肽的抗體。圖7A顯示J6/1G11-25單克隆抗體對來源于J6CF株的El蛋白的表位(肽編號1 至52)的結合強度。圖7B顯示J6/1G11-25單克隆抗體對來源于J6CF株的E2蛋白的肽 (肽編號1至110)的結合強度。當在0D450nm處的測量值(即，圖7A或7B中沿著垂直軸 的值)高時，J6/1G11-25單克隆抗體對肽的結合強度高，這表示抗體特異性識別表位。作為結果，J6/1G11-25單克隆抗體不識別來源于J6CF的El蛋白的任何肽(圖 7A)但識別來源于J6CF株的E2蛋白的一些肽(圖7B)。由J6/1G11-25單克隆抗體識別的 肽是 NVTNPEDMRP (SEQ ID NO 29 ；圖 7B 中的肽編號 32)和與其重疊的 NPEDMRPYCW(SEQ ID N0:30 ；圖7B中的肽編號33)、和NYTIFKIRMY(SEQ ID NO :31 ；圖7B中的肽編號82)和與其 重疊的 IFKIRMYVGG(SEQ ID NO 32 ；圖 7B 中的肽編號 83)。圖8A顯示J6/4D4-2單克隆抗體對來源于J6CF株的El蛋白的表位(肽編號1至 52)的結合強度。圖8B顯示J6/4D4-2單克隆抗體對來源于J6CF株的E2蛋白的肽(肽編 號1至110)的結合強度。當在OD 450nm處的測量值(S卩，圖8A或8B中沿著垂直軸的值) 高時，J6/4D4-2單克隆抗體對肽的結合強度高，這表示抗體特異性識別肽。作為結果，J6/4D4-2單克隆抗體識別來源于J6CF的El蛋白的一些肽和來源于 J6CF株的E2蛋白的一些肽，如圖8中所示的。El來源的強肽是FIVSPQHHWF(SEQ ID NO: 33 ；圖8A中的肽編號34)，與所述強肽重疊的SPQHHWFVQD (SEQ ID NO :34 ；圖8A中的肽編 號35)和HHWFVQDCNC(SEQ ID NO :35 ；圖8A中的肽編號36)是弱表位。另一個強表位是 MAffDMMMNWS (SEQ ID NO 36 ；圖 8A 中的肽編號 43)。E2-來源的強表位是LIDYPYRLWH(SEQ ID NO 37 ；圖8B中的肽編號77)和與該肽 重疊的 YPYRLffHYPC(SEQ ID NO 38 ；圖 8B 中的肽編號 78)，禾口 DMRPYCffHYP (SEQ ID NO 39 ； 圖8B中的肽編號34)。與最后一個強肽重疊的NPEDMRPYCW(SEQ ID NO 40 ；圖8B中的肽編 號33)禾口 PYCWHYPPRQ(SEQ ID NO 41 ；圖8B中的肽編號35)是弱表位。相對強的表位是NYTinQRMY (SEQ ID NO :31 ；圖8B中的肽編號82)，與其重疊的 IFKIRMYVGG(SEQ ID NO 32 ；圖8B中的肽編號83)是弱表位。此外，STRPPLGSffF(SEQ ID NO :42 ；圖 8B 中的肽編號 54)和 GSffFGCTWMN (SEQ ID NO 43 ；圖8B中的肽編號56)被鑒定為弱表位。因此，發現J6/1G11-25單克隆抗體識別J6CF株的E2蛋白內的氨基酸序列 NVTNPEDMPRPYCff (SEQ ID NO 44)和 NYTIFKIRMYVGG(SEQ ID NO 45)為表位。此外，還發現J6/4D4-2單克隆抗體識別J6CF株的E1蛋白內的氨基酸序列FIVSPQHHWFVQDCNC (SEQ ID NO 46)和 MAWDMMMNWS (SEQ ID NO 36)為表位以及識別 J6CF 株的 E2 蛋白內的氨基酸序列 LIDYPYRLWHYPC(SEQ ID NO 47), NPEDMRPYCffHYPPRQ(SEQ ID NO 48)和 NYTIFKIRMYVGG(SEQID NO 45)作為為表位。[實施例11]編碼JF/M1-4單克隆抗體的V區的DNA的克隆如下克隆編碼抗HCV顆粒的JF/M1-4小鼠單克隆抗體的可變區的DNA。1)總RNA的制備
按照所附手冊中所述的方法使用PureLink Micro-to-Midi (Invitrogen)從JF/ M1-4雜交瘤細胞系制備總RNA。特別地，將2 X IO8個雜交瘤株JF/M1-4細胞懸浮于2. 4mlRNA 裂解溶液，使用18計量注射針將細胞通過注射器數次來進行勻漿。離心所得的勻漿，向相 同量的所得上清液中加入70%的乙醇，將混合物用于RNA旋轉藥筒(spincartridge)。通 過加入清洗溶液充分清洗藥筒，使用不含RNA酶的水洗脫RNA。2)單鏈cDNA的合成
通過使用μ -型H鏈-和κ -型L鏈特異性引物，如下從上述1)中制備的總RNA 合成鏈特異性引物、單鏈cDNA。i)編碼JF/M1-4單克隆抗體的μ -型H的cDNA的合成向 5 μ g RNA 中加入 50pmol 的 μ -型 H 鏈特異性引物 mCHm-as (SEQ ID NO 49 ；5， -AGGCTTACTAGTAGCTGGAATGGGCACATGCAGATC-3，)以進行退火，向其中加入 5 μ 1 0. IM DTT、 1. 25μ 1 20mM dNTP溶液和10μ1 SuperScriptII提供的5x RT緩沖液，向其中加入蒸餾水 (Dff)以使終體積達到49 μ 1。然后，加入1 μ 1逆轉錄酶SuperScriptII (Invitrogen)，在42°C下進行反應30分 鐘，和在50°C下進行反應30分鐘，然后將反應溶液直接用于下一步驟，即聚合酶鏈式反應 (PCR)。ii)編碼JF/M1-4單克隆抗體的κ -型L鏈的cDNA的合成向 5 μ g RNA 中加入 50pmol 的 κ -型 L 鏈特異性引物 mCKl-as (SEQ ID NO 50 ；5 ，-CATGTCTAGAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3，)以進行退火，向其中加入 5 μ 1 0. IM DTT、 1. 25 μ 1 20mM dNTP溶液和10 μ 1 SuperScriptII提供的5χ RT緩沖液，向其中加入蒸餾 水(Dff)以使終體積達到49μ1。然后，加入1μ 1逆轉錄酶SuperScriptII (Invitrogen)， 在42°C下進行反應30分鐘，和在50°C下進行反應30分鐘，然后將反應產物直接用于下一 步驟，即聚合酶鏈式反應(PCR)。3)通過PCR法進行的編碼JF/M1-4單克隆抗體的可變區的基因的擴增利用GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems)，使用 Advantage GC2DNA polymerase 試劑盒(TAKARA)進行 PCR。 i)編碼小鼠H鏈V區的cDNA的擴增按照所附手冊中描述的條件使用小鼠Ig引物組(69831-3，Novagen)進行PCR。特別地，使用試劑盒提供的MuIgVH5' -A至MuIgVH5' _F引物(與小鼠H鏈的前 導序列雜交的)和MuIgMVH3' -1引物(與小鼠μ -型H鏈C區雜交的)進行PCR。向5μ 1上面制備的因合成成編碼μ _型H鏈的單鏈cDNA而產生的反應混合物 中加入10 μ 1試劑盒提供的5x PCR緩沖液、10μ1 GCMelt、4yl 2. 5mM dNTP溶液、1.25 個單位的 Advantage GC2DNA 聚合酶混合物(TAKARA)、lyl IOpmol/μ 1 MuIgVH5'引物和 1 μ 1 5pmol/y 1 MuIgMVH3' -1引物。再加入蒸餾水(Dff)以使終體積達到50 μ 1。按如下 順序在94°C下溫育PCR溶液(50 μ 1)進行4分鐘，然后在94°C下加熱1分鐘，在50°C (在 MuIgVH5 ‘ -A 和 MuIgVH5 ‘ -B 的情況下)或 60°C (在 MuIgVH5 ‘ -C 至 MuIgVH5 ‘ -F 的情 況下)進行1分鐘，在72°C下進行2分鐘。重復該熱循環40次，然后將反應混合物在72°C 下再溫育6分鐘。ii)編碼小鼠L鏈V區的基因的擴增
按照所附手冊中所述的條件使用小鼠Ig引物組(69831-3，Novagen)進行PCR。特別地，使用試劑盒提供的MuIg κ VL5' -A至MuIgKVL5'引物(與小鼠κ-型L 鏈的前導序列雜交的)和MuIg κ VL3' -1引物(與小鼠κ-型L鏈C區雜交的)進行PCR。向5 μ 1上面制 備的因合成編碼κ -型L鏈的單鏈cDNA而產生的反應混合物中加 入10 μ 1試劑盒提供的5x PCR緩沖液、10 μ 1 GC Melt,4 μ 1 2. 5mM dNTP溶液、1. 25個單 位的 Advantage GC2DNA 聚合酶混合物(TAKARA)、1 μ 1 lOpmol/μ 1 MuIgK VL 5'引物和 1 μ 1 5pmol/y 1 MuIg κ VL3' -1引物。再加入蒸餾水(DW)以使終體積達到50 μ 1。按如 下順序在94°C下溫育PCR溶液(50 μ 1)進行4分鐘，然后在94°C下加熱1分鐘，在50°C (在 MuIgVL5 ‘ -A 和 MuIgVL5 ‘ -B 的情況下)或 60°C (在 MuIgVL5 ‘ -C 至 MuIgVL5 ‘ -F 的情 況下)進行1分鐘，在72°C下進行2分鐘。重復該熱循環40次，然后將反應混合物在72°C 下再溫育6分鐘。4) PCR產物的純化和其至質粒載體的克隆通過瓊脂糖凝膠電泳分離如上所述擴增的DNA片段PCR。使用GeneElute (Sigma) 純化長度為大約450bp的DNA片段。使用TOPO TACloning試劑盒(Invitrogen)克隆DNA 片段。加入試劑盒提供的pCR-TOPO載體、DNA片段和試劑盒提供的鹽溶液，讓所得物在室溫 下靜置5分鐘，向大腸桿菌Machl (Invitrogen)的感受態細胞中加入一部分反應溶液。將 大腸桿菌感受態細胞置于冰上進行30分鐘，然后于42°C下加熱30秒，再置于冰上進行1分 鐘。向其中加入SOC培養基(室溫)，將細胞在37°C下培養1小時，然后將其接種在瓊脂培 養基上，然后在37°C下培養過夜。從所得的轉化株制備質粒DNA，按照常規技術測定克隆的 DNA的核苷酸序列。5)編碼JF/M1-4單克隆抗體的V區的cDNA的核酸序列的分析如下分析克隆在質粒中的DNA，在上述步驟4)中確定了其核苷酸序列(其為編碼 JF/M1-4小鼠單克隆抗體的H鏈V區和L鏈V區的cDNA)。i)編碼小鼠H鏈V區的cDNA的核酸序列的分析發現許多所得的克隆中克隆的H鏈V區的核酸序列除了小鼠H鏈前導序列的區域 外都相同。這表明復數個所測試的克隆來源于使用不同的編碼小鼠H鏈前導序列的引物的 混合物通過PCR獲得的獨立的分離株。此外，通過就根據它們的核酸序列推導的編碼的氨 基酸序列搜索數據庫，推導了來自JF/M1-4小鼠單克隆抗體的H鏈V區的從構架1至J區 段(構架4)的區域的序列(SEQ ID N0s:55至61)。核酸序列和由其確定的氨基酸序列分 別示于序列表的SEQ ID N0s:51和52中。此外，從氨基酸序列推導的⑶Rl至⑶R3示于圖 9中。已顯示JF/M1-4小鼠單克隆抗體的H鏈V區(核酸序列SEQ ID NO :51 ；氨基酸序 列SEQ ID NO 52)在抗體對表位(即，WLTPKCLVHYPYRLWHYPC(SEQID NO 24)或其含有 10 或更多個連續氨基酸殘基的部分)的識別起著重要作用。ii)編碼小鼠L鏈V區的cDNA的核酸序列的分析除了小鼠L鏈的前導序列外，發現許多所得的克隆中克隆的L鏈的V區的核酸序 列是相同的。這表明復數個所檢測的克隆來源于使用不同的編碼小鼠L鏈前導序列的引物 的混合物通過PCR獲得的獨立的分離株。此外，通過就根據它們的核酸序列推導的編碼的 氨基酸序列搜索數據庫，可推導出JF/M 1-4小鼠單克隆抗體的L鏈V區的從構架1至J區 段(構架4)的區域的序列(SEQ ID N0:62至68)。核酸序列和由其確定的氨基酸序列分別示于序列表的SEQ ID NOs 53和54中。此外，從氨基酸序列推導的⑶Rl至⑶R3示于圖10中。已顯示JF/M1-4小鼠單克隆抗體的L鏈V區(核酸序列SEQ ID NO 53 ；氨基酸序 列SEQ ID NO 54)在抗體對表位(即，WLTPKCLVHYPYRLWHYPC(SEQID NO 24)或其含有 10 或更多個連續氨基酸殘基的部分)的識別起著重要作用。工業適用性根據本發明的具有對HCV感染的抑制活性的抗體可用作HCV感染的治療性或預防 性藥物。序列表自由正文SEQ ID NO 1公開了克隆入pJFH-Ι的HCV基因組長度的cDNA。SEQ ID NO 2公開了克隆入PJ6/JFH-1的嵌合HCV基因組長度的cDNA序列。SEQ ID NO 3公開了克隆入pTH/JFH-Ι的HCV基因組長度的cDNA序列。SEQ ID NO :4 公開了引物(JFH-I-A)的序列。SEQ ID NO :5 公開了引物(JFH-I-B)的序列。SEQ ID NO :6 公開了引物(TH-C)的序列。SEQ ID NO :7 公開了引物(TH-D)的序列。SEQ ID NO :8 公開了引物(JFH-I-E)的序列。SEQ ID NO 9 公開了引物(JFH-I-F)的序列。SEQ ID N0:10 公開了引物(J6EldTM_s)的序列。SEQ ID NO 11 公開了引物(J6EldTM_as)的序列。SEQ ID N0:12 公開了引物(J6E2dTM_s)的序列。SEQ ID N0:13 公開了引物(J6E2dTM_as)的序列。SEQ ID N0:14 公開了引物(JFHEldTM-s)的序列。SEQ ID N0:15 公開了引物(JFHEldTM-as)的序列。SEQ ID N0:16 公開了引物(JFHE2dTM_s)的序列。SEQ ID N0:17 公開了引物(JFHE2dTM_as)的序列。SEQ ID NOs 18至24公開了合成肽的序列。SEQ ID NO 25公開了包含JFH-1株的El蛋白的氨基酸1至162的氨基酸序列。SEQ ID NO 26公開了包含JFH-I株的E2蛋白的氨基酸1至337的氨基酸序列。SEQ ID NO 27公開了包含J6CF株的El蛋白的氨基酸1至162的氨基酸序列。SEQ ID NO 28公開了包含J6CF株的E2蛋白的氨基酸1至337的氨基酸序列。SEQ ID NOs 29至48公開了合成肽的序列。SEQ ID N0:49 公開了引物(mCHm-as)的序列。SEQ ID N0:50 公開了引物(mCKl-as)的序列。SEQ ID NO 51公開了編碼JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(即，重鏈可變區)的 基因的核苷酸序列。SEQ ID NO 52公開了編碼JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區(即，重鏈可變區)的 基因的氨基酸序列。SEQ ID NO 53公開了編碼JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(即，輕鏈可變區)的 基因的核苷酸序列。
SEQIDNO 54公開了編碼JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區(即，輕鏈可變區)的 基因的氨基酸序列。SEQIDNO 55公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區的構架1的氨基酸序列。SEQIDNO 56公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區的CDRl的氨基酸序列。SEQIDNO 57公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區的構架2的氨基酸序列。SEQIDNO 58公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區的CDR2的氨基酸序列。SEQIDNO 59公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區的構架3的氨基酸序列。SEQIDNO 60公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區的CDR3的氨基酸序列。SEQIDNO :61公開了 JF/M1-4單克隆抗體的H鏈V區的構架4 (即，J區段)的氨 基酸序列。SEQIDNO 62公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區的構架1的氨基酸序列。SEQIDNO 63公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區的CDRl的氨基酸序列。SEQIDNO 64公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區的構架2的氨基酸序列。SEQIDNO 65公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區的CDR2的氨基酸序列。SEQIDNO 66公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區的構架3的氨基酸序列。SEQIDNO 67公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區的CDR3的氨基酸序列。SEQIDNO :68公開了 JF/M1-4單克隆抗體的L鏈V區的構架4 (即，J區段)的氨 基酸序列。
權利要求
抗體，其識別獲自丙型肝炎病毒(HCV)的基因組的丙型肝炎病毒(HCV)顆粒為抗原并且對丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性，其中所述丙型肝炎病毒(HCV)的基因組包括彼此連接的下列(i)和(ii)(i)(a)丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株的5’非翻譯區、核心蛋白編碼序列、E1蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列，或(b)丙型肝炎病毒(HCV)的J6CF株的5’非翻譯區、核心蛋白編碼序列、E1蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列；和(ii)JFH-1株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’非翻譯區。
2.權利要求1的抗體，其中所述丙型肝炎病毒(HCV)基因組是含有序列表的SEQID NO :1或2中所示的核苷酸序列的核酸(條件是當所述核酸是RNA時，將核苷酸序列中的核 苷酸“T”讀為“U”)。
3.權利要求1或2的抗體，其中所述抗體類別是IgM。
4.權利要求1至3的任一項的抗體，其識別序列表的SEQIDNO 24中所示的氨基酸序 列中的至少10個連續氨基酸。
5.權利要求4的抗體，其具有含有序列表的SEQID NO :52中所示的氨基酸序列的重 鏈可變區。
6.權利要求4或5的抗體，其具有含有序列表的SEQID NO :54中所示的氨基酸序列 的輕鏈可變區。
7.權利要求4至6的任一項的抗體，其由登錄號為FERMBP-10982的雜交瘤細胞系產生。
8.權利要求1至3的任一項的抗體，其識別序列表的SEQID NO 44或45中所示的氨 基酸序列中的至少10個連續氨基酸。
9.權利要求8的抗體，其由登錄號為FERMBP-10980的雜交瘤細胞系產生。
10.權利要求1至3的任一項的抗體，其識別序列表的SEQID NO :36、45、46、47或48 中所示的氨基酸序列中的至少10個連續氨基酸。
11.權利要求10的抗體，其由登錄號為FERMBP-10981的雜交瘤細胞系產生。
12.丙型肝炎病毒(HCV)感染的抑制劑，其包含權利要求1至11的任一項的抗體作為 活性成分。
13.藥物，其包含權利要求1至11的任一項的抗體作為活性成分。
14.用于丙型肝炎的治療劑或預防劑，其包含權利要求1至11的任一項的抗體作為活 性成分。
15.用于檢測丙型肝炎病毒(HCV)的方法，其包括使用權利要求1至11的任一項的抗 體檢測丙型肝炎病毒(HCV)顆粒。
全文摘要
本發明的目的是提供抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染的抗體。為此目的，本發明提供了抗體，所述抗體將獲自丙型肝炎病毒(HCV)基因組的丙型肝炎病毒(HCV)顆粒識別為抗原并且對丙型肝炎病毒(HCV)感染具有抑制活性，所述基因組包含下列彼此連接的(i)和(ii)(i)(a)丙型肝炎病毒(HCV)的JFH-1株的5’-非翻譯區、核心蛋白編碼序列、E1蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列或(b)丙型肝炎病毒(HCV)的J6CF株的5’-非翻譯區、核心蛋白編碼序列、E1蛋白編碼序列、E2蛋白編碼序列和p7蛋白編碼序列；和(ii)JFH-1株的NS2蛋白編碼序列、NS3蛋白編碼序列、NS4A蛋白編碼序列、NS4B蛋白編碼序列、NS5A蛋白編碼序列、NS5B蛋白編碼序列和3’-非翻譯區。
文檔編號G01N33/576GK101809033SQ20088010858
公開日2010年8月18日 申請日期2008年7月25日 優先權日2007年7月25日
發明者中村紀子, 尾見法昭, 森川賢一, 脅田隆字, 赤澤大輔, 鈴木哲朗 申請人:日本國立感染癥研究所;東麗株式會社