具有單讀出的通用激酶/磷酸酶測定法的制作方法

專利名稱：具有單讀出的通用激酶/磷酸酶測定法的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測激酶或磷酸酶活性的通用測定法及其在生命科學和藥物發 現中的用途。
背景技術：
在最近數年中，已經開發出用于體外藥理學和高通量篩選(HTS)的檢測肽或蛋白 的磷酸化(激酶活性)或去磷酸化(磷酸酶活性)的數種方法。對于這些應用而言，最吸 引人的是具有熒光讀出(readout)的檢測方法，它們為勻相的、混合并度量的測定法，因此 適用于微型化。常用測定法基于特異性抗體與磷酸基團的結合，但是由于針對磷酸絲氨酸 或磷酸蘇氨酸的抗體是序列特異性的，所以基于抗體的測定法不是通用性的。基于固定化 金屬離子親和力的測定法(IMAP)是無需抗體的，因此是通用性的。另一種用于檢測激酶活 性的通用測定法是測量ADP產量的Transcreener測定法。在所有這些測定法中，激酶/磷 酸酶活性的檢測是基于熒光偏振(FP)或熒光能量共振轉移技術(FRET、TR-FRET、HTRF)。但是，這些熒光測量法需要有關不同光參數的多個讀出，所述光參數例如偏振、波 長、延時型檢測(需要更復雜的儀器操作而不是簡單的熒光強度測量)。ADP測定法僅適用 于高ATP/ADP濃度和高轉換的酶，并且可能很容易跑出線性的反應范圍。而且，這種檢測僅 僅是間接的，因為監控的是ATP/ADP消耗，而這種消耗可能不是特異性的，不是特定磷酸酶 或激酶底物的(去_)磷酸化。因此，需要改良的通用激酶和磷酸酶測定法，其允許激酶或磷酸酶活性的有效檢 測。

發明內容
本發明的一個目的是提供用于檢測激酶活性或磷酸酶活性的方法，其通過穩健且 可靠的熒光讀出實現這種需要。該方法包括以下步驟a)孵育激酶或磷酸酶活性樣品與包含具有可檢測讀出的熒光團的激酶或磷酸酶 底物分子，b)孵育步驟a)的混合物與包含芳族基的檢測實體和結合配偶體(binding partner)，其中磷酸化底物分子和檢測實體能與結合配偶體結合，并且底物分子和檢測實 體與結合配偶體的結合產生改變的熒光團讀出，和c)測量步驟b)的混合物中的熒光團讀出，其中與空白相比改變的熒光團讀出指 示樣品中激酶或磷酸酶活性的存在。第二目的，本發明涉及用于檢測激酶活性或磷酸酶活性的方法。所述方法包括以 下步驟a)孵育激酶或磷酸酶活性樣品與包含芳族基的底物分子，b)孵育步驟a)的混合物與包含具有可檢測讀出的熒光團的檢測實體和結合配偶
4體，其中磷酸化底物分子和檢測實體可與結合配偶體結合，并且底物分子和檢測實體與結 合配偶體的結合產生改變的熒光團讀出，和c)測量步驟b)的混合物中的熒光團讀出，其中與空白相比改變的熒光團讀出指 示樣品中激酶或磷酸酶活性的存在。在本發明的一個實施方案中，熒光團選自由熒光素(Fluorescein)、羅丹明 B (Rhodamine B)、四甲基羅丹明(Tetramethylrodamine)、ATTO 590、ATT0 655, ATTO 680、 Atto 700,MR 121、Bodipy 630/650和Bodipy FL組成的組。優選的熒光團選自由MR 121、 ATTO 590、ATT0 655、Atto 680和ATTO 700組成的組。用于本發明方法的特別優選的熒光 團是MR 121和Atto 700。這些熒光團中的一些的分子結構可在Bioconjugate Chem. 2003, 14，1133-1139 中發現。ATT0 分子可商業得自 Atto-Tec GmbH, Siegen, Germany 在本發明的一個實施方案中，芳族基選自由具有芳族系統的氨基酸組成的組，優 選色氨酸。用于本發明方法的其他適合的芳族基選自如cGMP或cAMP衍生物的分子。底物分子優選為包含至少一個酪氨酸和/或絲氨酸和/或蘇氨酸的肽。在另一個實施方案中，該方法用于檢測酪氨酸激酶活性且底物肽包含至少一個酪 氨酸。在又一個實施方案中，該方法用于檢測絲氨酸激酶活性且底物肽包含至少一個絲氨酸。在又一個實施方案中，該方法用于檢測蘇氨酸激酶活性且底物肽包含至少一個蘇氨酸。在進一步的實施方案中，該方法用于檢測磷酸酶活性且底物分子為包含磷酸基、 優選磷酸酪氨酸或磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸的肽。在進一步的實施方案中，該檢測實體為包含磷酸酪氨酸和/或磷酸絲氨酸和/或 磷酸蘇氨酸的肽。在另一個實施方案中，底物分子和檢測實體與結合配偶體的結合牽涉離子相互作 用。優選地，結合配偶體選自硬路易斯酸金屬離子(例如In3+)或固體如在其表面具有離 子的珠子，例如IMAP珠子。第三目的，本發明涉及用于檢測激酶或磷酸酶活性的試劑盒，其包括包含具有可 檢測讀出的標記的激酶和/或磷酸酶活性底物、檢測實體和結合配偶體。第四目的，本發明涉及用于檢測激酶或磷酸酶活性的試劑盒，其包括包含芳族基 的激酶和/或磷酸酶活性底物、包含具有可檢測讀出的標記的檢測實體和結合配偶體。發明詳述如本文所用的術語“激酶活性”是指激酶對底物的磷酸化。如本文所用的術語“磷酸酶活性”是指磷酸酶對底物的去磷酸化。如本文所用的“熒光團”是指使分子具有熒光的分子的組分。它是分子中的官能 團，可吸收特定波長的能量并以不同(但同樣地為特定的)波長再發射。如本文所用的術語“底物分子”是指由激酶或磷酸酶修飾的分子。如本文所用的“檢測實體”是指攜帶具有可檢測讀出的標記(例如熒光團)的分 子或包含芳族基、例如酪氨酸、色氨酸、cGMP、cAMP衍生物的分子。如本文所用的“結合配偶體”是指能結合磷酸化底物分子和檢測實體兩者的實體，例如分子。本發明描述了通用的激酶/磷酸酶測定法，其基于以下事實熒光團如噁嗪染料MR121或Atto 700可以被含有芳族基如色氨酸的分子有效地淬滅，形成非熒光基態復合 物。觀點就是通過包含芳族基的實體和熒光團實體與結合配偶體的結合，使含有芳族基的 實體和熒光團緊靠，以致于可以通過分子軌道的直接相互作用一或者通過非熒光基態復 合物的形成(“靜態淬滅”)或通過碰撞淬滅(“動態淬滅”)一而發生淬滅。與現有淬滅測定法比較，這種淬滅機制比偶極_偶極相互作用如熒光共振能量轉 移技術(FRET)的優勢在于相互作用長度短得多，淬滅僅在非常高的局部濃度(通常為 mM)發生。對于能量轉移，需要供體與受體之間的光譜重疊。當受體游離于溶液中時，這意 味著具有兩個適宜分子的雙重標記和對供體發射的剩余光吸收。總體上說，由此描述的更 有利的淬滅系統導致更少的非_特異性信號和更高的靈敏度。芳族基和熒光團中的一個是所研究的激酶或磷酸酶活性的底物肽的一部分，而另 一個是檢測實體的一部分。結合配偶體結合磷酸化的底物肽和檢測實體但不結合未磷酸化 的底物肽，由此可以通過熒光團讀出(熒光強度)的減少測量激酶活性，而磷酸酶活性導致 熒光團讀出(熒光強度)的增加。熒光團讀出可以是例如熒光強度、熒光偏振、發射波長分 布或熒光壽命。結合配偶體是能夠結合磷酸基團的實體，優選硬路易斯酸金屬離子(例如In3+) 或在表面上具有離子的固體如珠子(例如IMAP珠子)，或類似物。

圖1針對用適宜的熒光團(例如MR121或Atto 700)標記的示例性激酶底物和包 含磷酸基和色氨酸的檢測實體，顯示了測定法原理。底物被激酶磷酸化。當生物化學反應 完成時，加入結合配偶體和檢測實體，然后測量熒光。被磷酸化的底物越多，檢測到的熒光 越少。穩健且靈敏的熒光讀出和簡單易行的操作方案使本發明的測定法也適于進行測 定法的微型化(例如在高密度微量滴定板中)或適于在微流體系統中進行處理和讀出。附圖簡述圖1顯示了通用測定法的原理。熒光標記的底物(用例如MR121或Atto 700標記) 被激酶磷酸化。為了檢測磷酸化的底物，將結合配偶體和含有磷酸基和色氨酸的檢測實體 加入至底物。磷酸化底物和檢測實體都與結合配偶體結合，導致色氨酸對熒光的淬滅；圖2顯示了在InCl3的存在下MR121( □)和Atto 700(口)熒光的減少。將 20nM MR121-CGpY 或 Atto 700-CGpY 與 1 μ M WGpY 和不同濃度的 InCl3 混合，測量MR121 和 Atto 700熒光。對于MR121實體在40 μ Μ-60 μ MInCl3時達到最高淬滅(初始MR121熒光 的20%)，對于Atto 700實體則在10 μ Μ-100 μ M時達到最高淬滅(初始Atto 700熒光的 15% ) (b)；圖 3 顯示了在恒定的 MR121-CGpY 和 InCl3 濃度(20nMMR121_CGpY，50 μ M InCl3) 時WGpY的滴定。在700nM WGpY時達到最高淬滅；圖 4 顯示了在恒定的 WGpY 和 InCl3 濃度(800nM WGpY, 50 μ MInCl3)時 MR121_CGpY 的滴定；圖5顯示了通過相應地混合MR121-CGpY和MR121-CGY，MR121-CGY肽的O %至 100%磷酸化。800nM WGpY和50 μ M InCl3用作檢測實體和結合配偶體。熒光強度隨著磷酸化的增加而減至初始熒光的20%。對于>20%的磷酸化，z'因子(十字形)高于0.5， 對于> 40%的磷酸化，高于0. 7 ；和圖6顯示了在恒定的MR121_CGpY濃度(20nM終濃度)時WGpY(a)和IMAP珠子(b) 的滴定。對于(a)，IMAP珠子的稀釋度為1 1000，對于(b)，WGpY的終濃度為80 y M。熒 光強度隨著WGpY濃度的增加而減至初始強度的20% (在80 y M WGpY時)。珠子稀釋度為 1 500或1 1000時，熒光強度同等地被淬滅至初始強度的20%，珠子稀釋度更高，淬滅 效率越低。
實施例材料與方法所有肽底物由Biosyntan GmbH，Berlin合成，純度為95 %。熒光團MR121的活 性形式由 Roche Diagnostics，Penzberg 提供，Atto 700 的活性形式由 Atto-Tec GmbH, Sieger^Germany提供。按照用馬來酰亞胺標記底物的標準操作方案，內部完成MR121-馬來 酰亞胺和Atto 700-馬來酰亞胺與底物肽的半胱氨酸殘基的巰基的共價偶合，然后經使用 C18 柱(Marchery-Nagel，ccl25/4，Nucleosil 100-5，保護 1)的分析型 HPLC (MerckHitachi D-6000)純化。當InCl3(Sigma-AldriCh Co.，目錄號303440)用作結合配偶體時，反應緩沖液為 pH 5. 2 的 lOOmM NaAc/HAc (無水 NaAc，> 99%，S8750，Sigma-Aldrich Co.)。當 IMAP 珠子 作為結合配偶體時，緩沖液為隨著IMAP試劑盒(Molecular Devices, 13110rleans Drive, Sunnyvale, CA 94089)提供的80% lx IMAP結合緩沖液A和20% lx IMAP結合緩沖液B。 對于所有實驗而言，將10 Pi色氨酸實體、10 yl熒光團實體和20 yl結合配偶體混合，得到 40 u 1的總測定體積。在讀熒光強度之前，在RT將板于暗處孵育60分鐘。所有測量在384 孔微量滴定板(Cornig B. V.，Koolhovenlaan 12， 1119Schiphol-Rijk, Netherlands，編號3723，通用光學板，透明，非結合表面)中進行。 借助于裝備有高壓Xe弧光燈的板視覺多功能讀出器(EvotecTechnologies GmbH, Schnackenburgallee 114，22525Hamburg，Germany)，對于 MR121 使用 630nm (帶寬 50nm)的 激發濾光片和695nm(帶寬55歷)的發射濾光片、對于Atto 700使用655nm(帶寬50歷)的 激發濾光片和710nm(帶寬40nm)的發射濾光片，進行所有熒光強度測量。通過使用衰減濾 光片以及改變暴露時間，將熒光強度調至所用CCD照相機的最大信號的約60%。結果A. InCl3作為結合配偶體P032_是硬路易斯堿，并與硬路易斯酸金屬離子形成復合物。磷酸基的氧可與單個 金屬離子配位或與一些金屬離子交聯以形成聚合物型復合物。因此，硬路易斯酸金屬離子 可用作結合配偶體，使熒光團實體和色氨酸實體密切靠近以形成非熒光基態復合物。對于 原理的驗證，使用分別含有磷酸酪氨酸、酪氨酸和/或色氨酸的短肽作為熒光團_和色氨酸 實體。使用在Cys殘基用MR121和Atto 700標記的序列Cys-Gly-Tyr的磷酸化和未磷酸化 肽作為熒光團實體(此后稱為 MR121-CGY，MR121-CGpY, Atto700_CGY 和 Atto 700-CGpY)， 檢測實體為序列Trp-Gly-pTyr的肽(此后稱為WGpY)，其中pTyr為磷酸化酪氨酸。圖2 顯示了在固定的 MR121-CGpY 或 Atto 700-CGpY 和 WGpY 濃度(終濃度MR121_CGpY 20nM,
7Atto700-CGpY 20nM, WGpY 1 u M)時對 InCl3 作為結合配偶體的滴定。在 50 ii M-100ii M InC13的存在下MR121的熒光發射被淬滅至初始MR121熒光(在缺少InC13時的熒光)的 20%。隨著更高的InCl3濃度，MR121熒光增至初始MR121熒光的70% (圖2a)，表明MR121 實體和色氨酸實體不再與相同的In-復合物結合。圖2b顯示了對10 ii M至140 ii M InCl3 的放大，以尋找最佳InCl3濃度。在10iiM 11^13時々《0 700熒光已經被淬滅至其初始熒光 的15%。與MR121實體相同，Atto 700熒光隨著更高的InCl3濃度而再次增加。用50 y M InCljnMR121實體進行所有隨后的試驗。在下一步驟，對WGpY濃度進行優化。圖3顯示了 在 20nM MR121-CGpY (終濃度)禾口 50 ii M InCl3 (終濃度)時 WGpY 的滴定。在 700nM WGpY 時 熒光強度達到其最小值(圖3b)。隨著MR121-CGpY濃度升高，熒光強度略微增加(從20nM 時的30%初始強度至lOOnm時的45% )(圖4)。在終實驗中，測量0% -100%底物磷酸化 的熒光強度(圖5)。將MR121-CGpY和MR121-CGY相應地混合，以隨著磷酸化肽的增加，得 到20nMMR121-CG(p)Y終濃度。800nM WGpY用作檢測實體，50 ii M InC13用作結合配偶體。 熒光強度隨著磷酸化增加而線性減少，從初始強度的100%至20%。作為該測定法的質量 的量度，計算了 z'因子。自20%磷酸化起z'因子高于0.5 (理論最大值1)，自40%起高 于 0. 7。B. IMAP珠子作為結合配偶體對于IMAP珠子作為結合配偶體的實驗而言，與InCl3作為結合配偶體時相同的短 模型肽用作MR121和色氨酸實體。IMAP珠子具有 lOOnM的直徑，顯著大于In3+離子，因 此必需高4倍的WGpY濃度以實現MR121實體的良好淬滅。盡管在需要更高試劑濃度這一 意義上IMAP珠子不如InCl3，但是此新的靈敏測定法允許該系統用作結合配偶體。圖6a顯 示了在IMAP珠子稀釋成1 1000時20nM MR121_CGpY的強度隨著WGpY濃度升高而減少。 在80iiM WGpY時，MR121熒光淬滅至初始強度的20%。在80 y M WGpY的恒定濃度時，稀釋 度更高的IMAP珠子不導致更好的淬滅(圖6b)，最佳稀釋度在1 500與1 1000之間。結論用本文所述的實施例，我們論述了激酶或磷酸酶活性可通過測量適宜熒光團(例 如MR121，Atto 700)的熒光強度的減少(激酶)或增加(磷酸酶)而進行檢測。色氨酸對 熒光團的淬滅是通過非熒光基態復合物的形成而發生的靜態淬滅或碰撞淬滅，該淬滅是一 個短程相互作用，其確保只有在熒光團實體和色氨酸實體與結合配偶體結合時才發生。這 與常規FRET測量相反，FRET測量中在高濃度的熒光團時未與結合配偶體結合也可發生受 體對供體發射的吸收。類似于FP測量，此處描述的淬滅測定法需要僅一個標記，但是在FP 中需要兩個讀出，而該熒光淬滅測量僅需要單讀出。穩健且靈敏的熒光讀出和操作方案的 簡單易行使本測定法還適用于例如在高密度微量滴定板中進行或在微流體系統中的處理 和讀出。因為所用的熒光團例如MR121和Atto 700在紅光中激發，而在近紅外中熒光發 射，所以它已被證明非常靈敏并顯示受到例如化合物、生物材料和塑料的自身熒光的干擾 最低。三種組分_熒光團實體、色氨酸實體和結合配偶體_可彼此滴定以找到每一測定試 驗的最佳條件，從而提供獨特的靈活性。盡管已經列出并描述了本發明的優選實施方案，但是應清楚地理解，本發明并不 限于此，而是可在下述權利要求的范圍內另外進行各種變更和實踐。
權利要求
檢測激酶活性或磷酸酶活性的方法，其包括以下步驟a)孵育激酶或磷酸酶活性樣品與包含具有可檢測讀出的熒光團的激酶或磷酸酶底物分子，b)孵育步驟a)的混合物與包含芳族基的檢測實體和結合配偶體，其中磷酸化底物分子和檢測實體能與結合配偶體結合，并且底物分子和檢測實體與結合配偶體的結合導致改變的熒光團讀出，和c)測量步驟b)的混合物中的熒光團讀出，其中與空白相比改變的熒光團讀出指示樣品中激酶或磷酸酶活性的存在。
2.檢測激酶活性或磷酸酶活性的方法，其包括以下步驟a)孵育激酶或磷酸酶活性樣品與包含芳族基的底物分子，b)孵育步驟a)的混合物與包含具有可檢測讀出的熒光團的檢測實體和結合配偶體， 其中磷酸化底物分子和檢測實體能與結合配偶體結合，并且底物分子和檢測實體與結合配 偶體的結合導致改變的熒光團讀出，和c)測量步驟b)的混合物中的熒光團讀出，其中與空白相比改變的熒光團讀出指示樣 品中激酶或磷酸酶活性的存在。
3.權利要求1或2的方法，其中熒光團選自由熒光素、羅丹明B、TMR、ATT0590、ATT0 655、ATT0 680、Atto 700、MR 121、Bodipy 630/650 和 Bodipy FL 組成的組，更優選選自由 ATTO 590、ATT0 655、ATT0 680、Atto 700 和 MR 121 組成的組。
4.權利要求3的方法，其中熒光團為MR121或Atto 700。
5.權利要求1-4的方法，其中芳族基選自由氨基酸——色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸組 成的組，優選色氨酸。
6.權利要求1-5的方法，其中底物分子和檢測實體與結合配偶體的結合涉及離子相互 作用。
7.權利要求1-6的方法，其中結合配偶體選自硬路易斯酸金屬離子或在其表面具有離 子的固體如珠子。
8.權利要求1-7的方法，其中檢測實體為包含磷酸酪氨酸和/或磷酸絲氨酸和/或磷 酸蘇氨酸的肽。
9.權利要求1-8的方法，其中底物分子為包含至少一個酪氨酸和/或色氨酸和/或蘇 氨酸的肽。
10.權利要求9的方法，其中所述方法用于檢測酪氨酸激酶活性且所述底物肽包含至 少一個酪氨酸。
11.權利要求9的方法，其中所述方法用于檢測色氨酸激酶活性且所述底物肽包含至 少一個色氨酸。
12.權利要求9的方法，其中所述方法用于檢測蘇氨酸激酶活性且所述底物肽包含至 少一個蘇氨酸。
13.權利要求1-9的方法，其中所述方法用于檢測磷酸酶活性且所述底物分子為包含 磷酸基、優選磷酸酪氨酸或磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸的肽。
14.權利要求1-13的方法，其中所述熒光團讀出為熒光強度。
15.用于檢測激酶或磷酸酶活性的試劑盒，其包括包含具有可檢測讀出的熒光團的激酶和/或磷酸酶活性底物、檢測實體和結合配偶體。
16.用于檢測激酶或磷酸酶活性的試劑盒，其包括包含芳族基的激酶和/或磷酸酶活 性底物、包含具有可檢測讀出的熒光團的檢測實體和結合配偶體。
17.基本上如前文所述、尤其參考前面的實施例描述的方法和試劑盒。
全文摘要
本發明涉及用于檢測激酶或磷酸酶活性的通用方法。該方法包括以下步驟孵育激酶或磷酸酶活性樣品與包含具有可檢測讀出的熒光團或具有充當熒光團淬滅劑的芳族基的分子的激酶或磷酸酶底物分子，孵育步驟a)的混合物與包含熒光團或具有芳族基的分子的檢測實體和結合配偶體，其中底物分子和檢測實體能與結合配偶體結合，并且底物分子和檢測實體與結合配偶體的結合導致改變的熒光團讀出，以及測量步驟b)的混合物中的熒光團讀出，其中與空白相比改變的熒光團讀出指示樣品中激酶或磷酸酶活性的存在。
文檔編號G01N33/542GK101802214SQ200880106373
公開日2010年8月11日 申請日期2008年9月1日 優先權日2007年9月10日
發明者D·羅特, T·恩德勒 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司