專利名稱：具有雙光子激發的sted熒光顯微術的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于使樣本中的用熒光染料標記的結構高空間分辨地成像的具有獨 立權利要求1前序部分特征的方法和具有獨立權利要求11前序部分特征的裝置。
背景技術：
獨立權利要求1前序部分中所定義的方法也被稱為STED (受激發射損耗)熒光顯 微術。通過該方法，在遠場光顯微方法中通常表示分辨率極限的衍射極限不被超過。在衍 射受限制的焦點區域中，激發光原則上激發樣品中的熒光染料自發發射熒光，在此，通過用 使被激發的熒光染料在熒光發射之前又退激的退激光覆蓋焦點區域的一些部分，該焦點區 域減小到衍射極限以下的大小。由此僅保留一個相對于焦點區域縮小的測量區域，由熒光 染料自發發射的熒光可源于該測量區域。通過記錄該熒光，在樣品中用熒光染料標記的結 構可以以超過衍射極限的空間分辨率來成像。當退激光以干涉圖案的形式指向樣品時，空 間分辨率特別好，該干涉圖案在測量區域處具有零點并且在其它位置在熒光染料的用激發 光激發的狀態退激時達到飽和。具有獨立權利要求1前序部分特征的方法和具有獨立權利要求11前序部分特 征的裝置已由US 5，731，588公知。在此提一下，激發光源可以是連續波激光器(英文 continous wave Laser = 激光器)，而退激光源可以是脈沖激光器，該脈沖激光器與探 測器同步，以便分別在退激光的一個脈沖衰退之后才記錄樣本的熒光。以此方式避免探測 器檢測到由樣本反射的退激光或其發射由退激光激勵并且因此不是源于所感興趣的測量 區域的熒光。作為提取自發發射的熒光的替換可能性，描述了激發光的極化和在相對于激 發光的極化正交的方向上由樣本投射到探測器上的光的極化濾波。在具有獨立權利要求1前序部分特征的STED熒光顯微術的一個方法中，為了當 在激發光的每個脈沖之后在測量區域外部使熒光染料又退激時實現期望的飽和，有意義的 是，供退激光使用的平均光強度也集中于脈沖，這些脈沖盡可能在時間上接近激發光脈沖 地施加在樣本上，以便給熒光染料在測量區域外部盡可能少地提供自發發射熒光的條件。 所述在時間上接近可通過直接序列或者部分或甚至完全的時間重疊來實現。但該序列的前 提條件是必要時除了探測器與退激光脈沖同步之外退激光脈沖與激發光脈沖同步。因此，實際實現STED熒光顯微鏡的投入或者用于STED熒光顯微術的傳統熒光顯 微鏡的改裝的投入之所以高，只是因為用于激發光和退激光的可同步的脈沖激光器昂貴。 還有就是激光脈沖不是從一開始就具有STED熒光顯微術所需的脈沖持續時間。除了同步 之外，脈沖的所需的時間延續和通過色散光學元件如光柵或玻璃纖維裝置的準備導致技術 財力上的投入高并且導致功能易受干擾。在CW-激光器的領域內，原則上可提供成本較低廉的激光器，例如呈所謂二極管激光器的形式，這種二極管激光器具有一個或多個電泵浦激光二極管。由此自動取消脈沖 準備和同步化。但如果將二極管激光器改變用于輻射脈沖，則通過這種二極管激光器原則 上不能在技術財力上帶來優點。
在STED熒光顯微術的公知形式中，被證實困難的是，使測量區域沿著光學軸線收 縮，因為通過熒光染料的單光子激發原則上不可將激發限制到焦平面或焦體積上。完全一 樣，也不可將退激光限制到焦平面上。這意味著，熒光染料在焦平面的下方或上方被激發并 且由此也通過退激光退激或必須通過退激光退激。雖然可通過在探測器之前使用共焦孔眼 光闌來使測量區域沿著光學軸線減小到焦平面，但這意味著，熒光染料在焦平面外部被多 余地激發和退激，這導致熒光染料通過退激射束顯著脫色，由此在染料很多的情況下妨礙 3D圖像的拍攝。作為將樣本的熒光顯微成像限制到焦平面上并且沿著光學軸線實現選擇性的可 能性，已經公知，用激發光通過多光子過程激發熒光染料。在此，激發光原則上可具有不同 波長的份額，并且，三個或者甚至更多個單個光子可參與多光子過程。但在熒光染料的多光 子激發的實際中，通常用僅一個波長的激發光進行雙光子激發，其中，光子分別為多光子過 程所需全部光子能量的一半作出貢獻。在焦平面上激發的選擇性在此基于激發光的強度與 熒光染料在其通過多光子過程發熒光的狀態中的激發概率之間的非線性。在雙光子激發 中，這種激發概率與激發光強度的平方相關，由此集中到樣本中激發光的焦點區域的衍射 主最大值上。鑒于熒光染料基于多光子過程的躍遷概率原則上較小，為了獲得樣本的熒光 的足夠增益，而無需用極大強度的激發光加載樣本，已經公知，將激發光在時間上聚集成單 個脈沖。只是由于激發光的這種在時間上的集中以及激發光的每一個脈沖中隨之而來的提 高的光子集中，熒光的增益相對于連續地、即以在時間上恒定的強度入射到樣本上的激發 光明顯提高。例如在雙光子激發的情況下，激發光在時間上集中到時間的十分之一使得激 發光的強度在時間的十分之一中提高到十倍，由此使得在時間的該十分之一期間熒光的增 益提高到IO2 = 100倍。由此，平均在該時間上在平均功率相同的情況下熒光強度總是上 升 100/10 = 10 倍。由DE 102005027896. 5A1例如在STED熒光顯微術中、但也在熒光染料的多光子 激發下的熒光顯微術中已經公知，投射到樣本上的光學信號的在時間上的重復間距在至少 0. 1 μ s至2μ s的范圍內變化，以便使熒光增益最大化。在此，如果設置有一個用于用光學 信號在空間上掃描樣本的掃描裝置，則光學信號可來自連續波激光器，所述掃描裝置具有 這樣的掃描速度，使得出現期望的重復間距。通過重復間距提供的停頓允許使熒光染料從 暗態、尤其是三重態衰減返回到其能發熒光的單態中。由WO 2007/030835Α2公知了一種用于使樣本中的用熒光染料標記的結構高空間 分辨地成像的方法以及適用于該方法的裝置。熒光染料涉及具有暗態和熒光狀態的化合 物，在該暗態中，該化合物不可被激發出熒光，在該熒光狀態中，該化合物可被激發光激發 出熒光。化合物可通過接通光從暗態接通到熒光狀態中，其中，到熒光狀態的躍遷應經由中 間狀態進行，化合物應可在接通光的一個脈沖之后通過轉回光的一個脈沖從該中間狀態躍 回到暗態中。接通的狀態通過該轉回光而相對于接通光的焦點區域縮小到測量區域。真 正的測量于是通過激發光進行，該激發光在熒光狀態中將化合物激發出熒光。該激發光可 具有與轉回光相同的波長，但具有不同的空間分布并且在任意情況下同時作為關斷光起作 用，該關斷光使接通到熒光狀態中的化合物關斷返回到其暗態中。為了在此之后可繼續測 量，必須將接通光的另一個脈沖與轉回光的下一個脈沖投射到樣本上。脈沖化的接通光可 具有這樣的波長，使得該接通光將化合物通過多光子過程接通到其熒光狀態中。同時作為關斷光起作用的激發光可通過連續波激光器、例如二極管激光器來提供，該連續波激光器 按照需求可被接通和關斷。根據W02007/030835A2不使用在自發發射熒光之前又使被激發 出熒光的化合物退激的退激光。由該文獻公知的方法以及為此所使用的裝置的投入大，因 為必須提供具有至少三個不同波長的光和/或空間分布，即接通光、轉回光和也作為關斷 光起作用的激發光。此外必須提供彼此間精確同步的脈沖形式的接通光和轉回光，因為其 上可作用轉回光的可轉換的化合物的中間狀態壽命短。在此，可轉換的熒光團的使用已經 是基本投入，該基本投入遠遠超過了簡單熒光染料的投入。在具有獨立權利要求1前序部分特征的方法和具有獨立權利要求11前序部分特 征的裝置中，由US 6，958，470B2已經公知，通過具有大約80MHz重復率的兩個彼此同步的 脈沖化的激光來提供激發光和退激光。
發明內容
本發明的任務在于，提供一種用于使樣本中的用熒光染料標記的結構高空間分辨 地三維(3D)成像的方法和裝置，該方法和該裝置可用相對小的投入來實現，該方法避免樣 本由于退激射束提前脫色，但允許在全部空間方向上空間分辨率顯著提高到衍射極限之 上。本發明的任務通過具有獨立權利要求1前序部分特征的方法以及通過具有獨立 權利要求11前序部分特征的裝置來解決。該新方法的優選實施形式在從屬權利要求2至 10中定義，而從屬權利要求12至20描述了新裝置的優選實施形式。在該新方法中，這樣選擇激發光的波長，使得激發光通過多光子過程激發該熒光 染料。通常在此涉及雙光子過程。將退激光脈沖化用于多光子激發，這以公知方式有利地影 響基于多光子激發的熒光增益，而具有比激發光短的波長的退激光在激發光的多個脈沖上 連續地或在一定程度上連續地指向樣本。由于用激發光通過多光子過程激發熒光染料，其 中進行熒光染料有效激發的焦點區域與通過單光子過程進行的可能激發相比明顯在空間 上得到限制。尤其是這種非線性的激發在大孔徑物鏡的情況下被限制到典型地 1 μ m的 焦深上，該焦深相應于沿著光學軸線其衍射主最大值的大小。激發在空間上在3D上受到限 制，由此，也必須使處于焦平面上方和下方的熒光染料很少退激或者甚至不退激。否則，尤 其是處于焦點主最大值之外的熒光染料必須能通過單光子過程激發，不通過退激光退激。優選這樣選擇退激光的波長，使得該波長落到染料的發射譜的紅端中。因此原則 上適用的是，用退激光加載不被激發的樣本不導致褪色，因為該退激光的光子能量對于激 發熒光染料而言太小。退激光因此可使已經被激發的熒光染料不僅如期望的那樣退激，而 且也脫色。通過退激光進行的脫色僅在已經被激發的熒光染料上進行。即因為通過多光子激發進行的激發從一開始就三維地收縮到衍射主最大值，所以 熒光染料在其中必須退激的區域也減小。因為每熒光染料分子不必要的退激的數量降低， 所以脫色也降低，這顯著簡化并且在多種染料的情況下甚至剛好允許通過STED熒光顯微 術進行的納米級3D成像。如果多光子激發僅在1 μ m厚的層中進行，則在10 μ m厚的樣本 的情況下不必要的退激的數量降低10倍。即如果樣本的在其中需要退激光的區域相對于 測量區域可顯著縮小，則通過退激光造成的脫色相應地降低。這通過將熒光染料通過多光 子過程激發出熒光來實現。
由此可實現退激光以連續的形式即以特別有利的方式施加到樣本上，而在此不 使熒光染料承受過載。在此意義下不僅由于放棄退激光脈沖而且由于由此取消建立激發光 脈沖與退激光脈沖之間的同步的必要性而產生成本優點。因此，尤其是用于通過反正已經 被改裝來多光子激發熒光染料的熒光顯微鏡執行該新方法的投入僅與最小的附加投入相 聯系。僅僅還須用簡單的連續波激光器提供退激光并且以合適的方式將其輸入耦合到熒光 顯微鏡的物鏡中。也可完全取消用于由熒光染料自發發射的熒光的探測器與激發光或退激光的某 些脈沖的任意同步。因此，探測器可在激發光的多個脈沖上連續地記錄由熒光染料自發發 射的熒光。在此，探測器可將熒光例如通過邊緣濾波器或窄帶帶通濾波器從退激光提取出 來，但或者通過極化濾波器提取出來，為此則也將退激光有目的地極化。在該新方法中特別優選的是，用二極管激光器提供退激光。這種二極管激光器可 作為連續波激光器來提供，其成本大致是用于在STED熒光顯微術的情況下提供退激光的 否則常用的脈沖激光器的成本的十分之一。在該新方法中也可積極地看出，通過激發光對樣本的有效的多光子激發在任意時 刻也被限制到較小的空間區域，與熒光染料脫色的危險相應的激發光總負荷與熒光增益相 比也降低。在該新方法中，可以以至少80MHz、優選至少100MHz、更優選至少120MHz、最優選 至少150MHz的相對高的頻率將激發光脈沖化。至少通過最后兩個數據超過通常在STED熒 光顯微術中使用的脈沖激光器的頻率范圍。該范圍大致為80至100MHz。由于激發光的脈 沖的非常高的頻率，激發光的脈沖之間的停頓非常短。由此防止退激光的非常大的份額投 射到樣本上，而在那里熒光染料的非常大的份額不處于基本狀態中。激發光的各個脈沖如在熒光顯微術中那樣在熒光染料被多光子激發的情況下與 其脈沖間距相比優選相對短。因此，激發光的各個脈沖可具有其脈沖間距的最高十分之一、 優選最高百分之一、更優選最高千分之一、最優選最高萬分之一的持續時間。如開頭已經解 釋的那樣，在激發射束的平均功率保持相同的情況下，樣本的熒光的相對增益由此提高。通過該新方法尤其是可對具有測量區域或多個同類測量區域的樣本在三維上進 行掃描，對來自所述多個同類測量區域的、由熒光染料自發發射的熒光在空間上分開地進 行記錄，其中，對在樣本中用熒光染料標記的結構在三維上進行分辨。為了尤其是在ζ方向上即在激發光的光學軸線的方向上獲得所述分辨，有意義 的是，退激光剛好在所述的方向上在測量區域之前和之后指向樣本，如由文獻Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 97,8206 (2000)所公知的那樣。在此，在測量區域處退激光的強度零點旁邊 的各一個最大值足以使在焦點區域中通過多光子激發來激發出熒光的熒光染料又退激。已 經普遍公知了多個用于改變退激射束的方法和裝置，這些方法和裝置使得焦點測量區域 有利地收縮Phys. Rev. E，64，066613(2001) ；Appl. Phys. B 77 11 (2003) ；New J. Phys. 8 106(2006)。也有利的是，在探測器之前設置一個共焦孔眼光闌，在多個焦點測量區域的情況 下設置孔眼光闌的共焦陣列。孔眼光闌抑制退激射束和激發射束的散射光。在另一個特殊 的實施形式中，熒光不通過光學掃描裝置返回，而是以簡化的光學方式、即如對于專業人員 而言已經公知的“non-descanneddetection”被記錄。
在該新方法的一個特殊實施形式中，激發光和退激光分別在激發光的多個脈沖之 后中斷一個有限時間間隔。這種中斷的目的在于，期望在暗態在激發光的當前脈沖期間通 過激發光已經以顯著的程度遷移之后熒光染料從該暗態、尤其是其三重態衰減返回到其熒 光單態中。暗態的這種遷移導致樣本的熒光的增益減小，此外可與熒光染料的脫色危險的 提高相聯系。但在0. 5至3μ S、典型地1至2μ s范圍內的相對短的時間間隔上，暗態又逐 漸衰退，由此，激發的相應中斷導致樣本的熒光的增益總體提高。有意義的是，與激發光的 輸入并行地也使退激光中斷所述的時間間隔，以便并非不必要地對樣本加載退激光。在激 發光的停頓之間激發光的多個脈沖的時間間隔據此典型地取值為IOOns至50 μ S、優選為 0. 5至2μ s，在其上退激光連續地施加在樣本上。該時間間隔的精確持續時間取決于三重 態或暗態實際上遷移多快。在根據本發明的裝置中，激發光源輻射出激發光，該激發光具有這樣的波長，使得 激發光通過多光子過程激發熒光染料，退激光源使退激光在激發光的多個脈沖上連續地指 向樣本，該退激光具有比激發光短的波長。所述裝置的探測器也在激發光的多個脈沖上連續地記錄由熒光染料自發發射的 熒光。當退激光源具有連續發射的二極管激光器時，該新裝置的實現是特別有利的。而 激發光源具有脈沖激光器，該脈沖激光器輸出激發光，該激發光呈脈沖形式，所述脈沖具有 上述頻率和就其間距而言相對的持續時間。在該新裝置中設置有掃描裝置，用于對具有測 量區域或多個同類測量區域的樣本在三維上進行掃描，探測器對來自所述多個同類測量區 域的、由熒光染料自發發射的熒光在空間上分開地進行記錄，該掃描裝置原則上可使樣本 相對于熒光顯微鏡的其余部分運動。但優選也通過光學元件的移動來進行，該光學元件不 僅屬于使激發光聚焦到樣本中的光學裝置而且屬于使退激光指向樣本的光學裝置。用于掃 描被聚焦到樣本上的射束的不同的裝置對于專業人員已經充分由激光掃描顯微術的文獻 公知。為了使激發光和退激光的入射分別在激發光的多個脈沖之后中斷有限時間間隔， 該新裝置可具有控制裝置，該控制裝置優選可調節，以便調節有限時間間隔以及多個脈沖 的處于兩個這樣的有限時間間隔之間的時間間隔。這種控制裝置優選包括聲光或電光的射 束調制器。該新裝置的探測器在其它方面也不必與激發光和退激光中斷的有限時間間隔同 步，而是該探測器也可在這些時間間隔上連續記錄由熒光染料自發發射的熒光，但這不發 生。從權利要求書、說明書和附圖中得到本發明的有利的進一步構型。說明書前序部 分中提到的特征和多個特征的組合的優點僅僅是示例性的并且可作為替換方案或累積地 產生作用，而這些優點不必強制性地由根據本發明的實施形式來獲得。其它特征可從附圖、 尤其是所示的幾何結構和多個構件彼此間的相對尺寸以及其相對布置和作用連接中獲知。 本發明不同實施形式的特征或不同權利要求的特征的組合也可與權利要求的所選擇的引 用不同并且由此被進一步發掘。這也涉及在分開的附圖中所示或者在其說明中所提及的特 征。這些特征也可與不同權利要求的特征組合。權利要求書中描述的特征對于本發明其它 實施形式也可取消。
下面借助于實施例參照附圖對本發明進行詳細描述和說明。圖1示出了一個新裝置的實施形式的示意性結構，圖2在上方示出了激發光的強度的示意性時間變化曲線，在中間示出了退激光的強度的示意性時間變化曲線，在下方示出了在該新方法的實施形式中用于記錄樣本的熒光 的探測器的靈敏度的示意性時間變化曲線。
具體實施例方式圖1中草圖所示的裝置1用于使樣本2中的用熒光染料標記的結構高空間分辨地 成像。為此，用脈沖激光器4形式的激發光源3將脈沖化的激發光5通過光學裝置6在物 鏡7的焦點區域中指向樣本。在該焦點區域中，樣本2中的熒光染料通過雙質子過程激發 出熒光，即自發發射熒光。焦點區域在此被定義為這樣的區域在該區域中，熒光染料的有 效激發通過雙光子過程來進行以便自發發射熒光。在焦點區域的一個子區域上，確切地說 在一個相對于焦點區域縮小的測量區域外部，通過用二極管激光器9形式的退激光源8使 退激光10連續地指向樣本而使熒光染料立即又退激。在此，用一個相位調制器11使激發 光10的平面波這樣變形，使得在焦點區域中出現激發光10的具有中央零點和與該中央零 點鄰接的覆蓋焦點區域剩余部分的強度最大值的強度分布。因此，一個記錄由樣本2的熒 光染料自發發射的熒光的探測器12僅還檢測來自測量區域的熒光，該測量區域具有所使 用波長的光的衍射極限以下的尺寸。激發光5通過一個二色性鏡14與探測器12隔開，該 二色性鏡將激發光5的光路和熒光13的光路分開。退激光10通過一個二色性鏡15與探 測器12隔開，該二色性鏡將退激光10的光路和熒光13的光路分開。一個掃描裝置16可 被設置用于使光學裝置6的一個被激發光5以及退激光10和樣本的熒光13穿過的光學元 件17這樣運動，使得在樣本中用熒光染料標記的兩個結構在三維上被掃描。圖2在上方示出了激發光5的強度的時間變化曲線。在激發光的強度為零的有 限時間間隔18之間，激發光由單個脈沖構成，所述脈沖具有比所述脈沖的間距短的脈沖持 續時間。有限時間間隔18具有1 μ s的典型持續時間。激發光5的脈沖19的頻率大致在 120MHz以上，其中，所述脈沖的間距至少是所述脈沖的持續時間的10倍。這些數值情況在 圖2中沒有完全反映出來。圖2在中間示出了退激光10在時間上的強度變化曲線。退激 光10連續地即以恒定的強度施加在樣本2上——除了在有限時間間隔18中，在所述有限 時間間隔中該退激光的強度也為零。圖2在下方示出了根據圖1的探測器12在時間上的 靈敏度20。該靈敏度是連續地、即也在有限時間間隔18上給出的。參考標號清單1 裝置2 樣本3 激發光源4 脈沖激光器5 激發光6 光學裝置7 物鏡
8退激光源9二極管激光器10退激光11相位調制器12探測器13自發發射的熒光14二色性鏡15二色性鏡16掃描裝置17光學元件18有限時間間隔19脈沖20敏感度
權利要求
用于使樣本中的用熒光染料標記的結構高空間分辨地成像的方法，其中，將脈沖化的激發光聚焦到該樣本中，以便激發處于一個焦點區域中的熒光染料自發發射熒光，其中，使具有與激發光不同的波長的退激光指向該樣本，以便使被激發的熒光染料在一個相對于該焦點區域縮小的測量區域外部在該熒光染料自發發射之前退激，其中，記錄由該熒光染料自發發射的熒光，其特征在于這樣選擇該激發光(5)的波長，使得該激發光(5)通過多光子過程激發該熒光染料；該退激光(10)具有比該激發光(5)短的波長，該退激光在該激發光(10)的多個脈沖(19)上連續地指向該樣本(2)。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于在該激發光(5)的多個脈沖(19)上連續地記 錄由該熒光染料自發發射的熒光(13)。
3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于用二極管激光器(9)提供該退激光(10)。
4.根據權利要求1至3之一的方法，其特征在于以至少80MHz、優選至少100MHz、更 優選至少120MHz、最優選至少150MHz的頻率將該激發光(5)脈沖化。
5.根據權利要求1至4之一的方法，其特征在于該激發光(5)的各個脈沖(19)具有 其脈沖間距的最高十分之一、優選最高百分之一、更優選最高千分之一、最優選最高萬分之 一的持續時間。
6.根據權利要求1至5之一的方法，其特征在于對具有該測量區域或多個同類測量 區域的所述樣本(2)在三維上進行掃描，對來自所述多個同類測量區域的、由該熒光染料 自發發射的熒光(13)在空間上分開地進行記錄。
7.根據權利要求1至6之一的方法，其特征在于該退激光(10)在該激發光(5)的光 學軸線的方向上在該測量區域之前和之后指向該樣本(2)。
8.根據權利要求1至7之一的方法，其特征在于該激發光(5)和該退激光(10)分別 在該激發光(5)的多個脈沖(19)之后中斷一個有限時間間隔(18)。
9.根據權利要求8的方法，其特征在于所述中斷的有限時間間隔(18)具有0.5至 50 μ s、優選1至2 μ s的持續時間。
10.根據權利要求8或9的方法，其特征在于該激發光(5)的多個脈沖(19)的一個 時間間隔是IOOns至50 μ s、優選0. 5至2 μ S。
11.用于使樣本中的用熒光染料標記的結構高空間分辨地成像的裝置，該裝置具有 用于脈沖化的激發光的激發光源；將該激發光聚焦到該樣本中的光學裝置，用于激發處于 一個焦點區域中的熒光染料自發發射熒光；用于退激光的退激光源，該退激光具有與該激 發光不同的波長；使該退激光指向該樣本的光學裝置，用于使該熒光染料在一個相對于該 焦點區域縮小的測量區域外部退激；以及探測器，該探測器記錄由該熒光染料自發發射的 熒光，其特征在于該激發光源(3)輻射出該激發光(5)，該激發光具有這樣的波長，使得該 激發光(5)通過多光子過程激發該熒光染料；該退激光源(8)使該退激光(10)在該激發光 (5)的多個脈沖(19)上連續地指向該樣本(2)，該退激光具有比該激發光(5)短的波長。
12.根據權利要求11的裝置，其特征在于該探測器(12)在該激發光(5)的多個脈沖 (19)上連續地記錄由該熒光染料自發發射的熒光(13)。
13.根據權利要求11或12的裝置，其特征在于該退激光源(8)具有二極管激光器(9)。
14.根據權利要求11至13之一的裝置，其特征在于該激發光源(5)具有脈沖激光器(6)，該脈沖激光器輸出該激發光(5)，該激發光呈脈沖(19)形式，所述脈沖具有至少 80MHz、優選至少100MHz、更優選至少120MHz、最優選至少150MHz的頻率。
15.根據權利要求11至14之一的裝置，其特征在于該激發光源(3)具有脈沖激光器 (4)，該脈沖激光器輸出該激發光(5)，該激發光呈單個脈沖(19)形式，所述脈沖具有所述 脈沖的間距的最高十分之一、優選最高百分之一、更優選最高千分之一、最優選最高萬分之 一的持續時間。
16.根據權利要求11至15之一的裝置，其特征在于設置有掃描裝置(16)，該掃描 裝置對具有該測量區域或多個同類測量區域的所述樣本(2)在三維上進行掃描，該探測器 (12)對來自所述多個同類測量區域的、由該熒光染料自發發射的熒光(13)在空間上分開 地進行記錄。
17.根據權利要求11至16之一的裝置，其特征在于使該退激光(10)指向該樣本的 光學裝置(6)這樣改變該退激光的平面波前，使得該退激光(10)在該激發光(5)的光學軸 線的方向上在該測量區域之前和之后具有強度最大值。
18.根據權利要求11至17之一的裝置，其特征在于設置有控制裝置，該控制裝置使 該激發光(5)和該退激光(10)的入射分別在該激發光(5)的多個脈沖(19)之后中斷一個 有限時間間隔(18)。
19.根據權利要求8的裝置，其特征在于所述有限時間間隔(18)至少可在1至2μS、 優選0. 5至3 μ s的持續時間的范圍內調節。
20.根據權利要求8或9的裝置，其特征在于該激發光(5)的多個脈沖(19)的一個 時間間隔至少可在IOOns至50ys、優選0. 5至2ys的范圍內調節。
全文摘要
本發明涉及一種用于使樣本中的用熒光染料標記的結構高空間分辨地成像的方法，其中，將脈沖化的激發光(5)聚焦到該樣本中，以便激發處于一個焦點區域中的熒光染料自發發射熒光，其中，使具有與激發光(5)不同的波長的退激光(10)指向該樣本，以便使熒光染料在一個相對于該焦點區域縮小的測量區域外部在自發發射熒光之前退激，其中，記錄由該熒光染料自發發射的熒光，其中，這樣選擇該激發光(5)的波長，使得該激發光(5)通過多光子過程激發該熒光染料，該退激光(10)具有比該激發光(5)短的波長，該退激光在該激發光(5)的多個脈沖(19)上連續地指向該樣本。
文檔編號G01N21/63GK101821607SQ200880103629
公開日2010年9月1日 申請日期2008年8月14日 優先權日2007年8月18日
發明者K·維利希, S·W·黑爾 申請人:馬克思-普朗克科學促進協會