分子相互作用的檢測方法

專利名稱：分子相互作用的檢測方法
技術領域：
本發明涉及檢測細胞中各種生物活性分子之間的動態相互作用的方法以及測定 調節生物活性分子的相互作用和功能的分子的方法。
背景技術：
一般說來，各種生理功能受到各種生物活性分子之間的動態相互作用的調節。如 果這種相互作用不能正確發生，出現的問題是引起疾病。例如，蛋白質在體內通過與其他蛋 白質相互作用執行它們的功能。一般說來，具有互補結構的兩種蛋白質彼此相互作用，并且 生物活性化合物專一性地與三維蛋白質結構的特定部分相互作用。通常，兩種蛋白之間的 相互作用強烈暗示它們功能上相關。此外，跟與疾病相關的蛋白的特定部分專一性相互作 用的生物活性化合物通過控制蛋白質的活性具有作為可診斷、預防、治療或者減輕疾病的 治療劑的可能性。因此，在新藥開發領域，已經研究了用于測定新目標蛋白或者通過測定其功能和 性質已知的“誘餌(bait)，，與作為待分析和檢測的相互作用伴侶的“捕獲物(prey)，，之間 的相互作用來篩選生物活性分子作為藥物候選的各種方法。因此，通過分析生物活性分子 之間的相互作用識別和分離新的目標蛋白對于得到有關生物活性化合物的活性、有效性和 反作用的有用信息來說被認為是非常重要的研究課題。另外，目標蛋白促進了生物學途徑 和信號轉換系統的理解，并提供了有關基礎細胞調節和疾病機制方面的信息。這種信息對 于通過分析并測定與目標蛋白相互作用的生物活性化合物以開發新藥物、改進現有藥物并 揭示現有藥物的新治療用途來說是非常強有力的工具。現代醫學面臨著開發更安全和更有效的療法的挑戰。但是，目前正在使用的許多 藥物都由在疾病模型中的生物學效果所規定，而不由它們的目標蛋白質和分子靶標所規定 (L. Burdine 等人，Chem. Biol. 11 :593，2004 ； J. Clardy 等人，Nature 432:829,2004)。天 然生物活性產品是藥物開發的重要來源，但是它們的作用模式常常是未知的(J. Clardy等 人，Nature 432 :829，2004)。它們的生理學目標和分子靶標的說明對于理解它們的治療效 果和副作用來說是必不可少的，從而能夠改進第二代治療劑的開發。此外，臨床證實的化合 物的新靶標的發現可建議新的治療應用(T. T. Ashburn等人，Drug Discov. 3 =673,2004)。在采用基于高通量細胞篩選的化學_生物領域，“目標篩選”被用于從大的化 合物文庫中識別具有所需表型的小分子(R. L. Strausberg等人，Science300 =294,2003 ； B. R. Stockwe 11, Nature 432 :846，2004)。盡管這種篩選具有巨大利益，但該途徑還是受到 目標識別的驚人的工作量的阻礙。但是，這種識別技術的發展在各種生物科學領域都非常 重要，包括基因組學、蛋白質組學和系統生物學，因為各種各樣的細胞內分子相互作用的有 效檢測，包括蛋白(或者小分子)_蛋白質的有效測定對于理解動態生物學過程和調節網絡 來說是必須的。在目標篩選領域，一些技術，包括親和色譜法(Phizicky，E.M.等人，Microbiol. Rev. ,59 94,1995 ；Mendelsohn A. R.等人，Science，284 1948，1999)，蛋白質小分子微陣列，噬菌體展示(Sche, P.P.等人，Chem. Biol.，6:707，1999)，酵母雙/三雜交測定 (Licitra, E.J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 :12817，1996)，表達譜分析以及具有異 源缺失的酵母菌株的平行分析(Zhenget等人，Chem. Biol.，11 =609,2004)已經被用于分析 生物活性分子之間的相互作用。但是，這些技術都受到多種問題的困擾，包括高背景噪聲、 假陽性、低靈敏度、蛋白質表達后的不適當折疊、間接性(indirectness)、蛋白質表達后缺 乏修飾，或者包括細胞相容性的限制目標的可接近性(accessibility)。另外，人工實驗環 境的使用，例如體外結合條件或者非哺乳動物細胞有時導致實驗結果的錯誤。因此，最優選的是在生理或者藥物條件下考慮了高靈敏度和選擇性的狀態下直接 檢查生物活性分子之間的相互作用。探測活的哺乳動物細胞內的分子相互作用的技術例如 熒光共振能量轉移技術(FRET) (Moshinsky，D. J.等人，Screen.，8(4) =447,2003)或者蛋白 質片段互補測定技術(PCA)都是可以利用的，但是它們受到特定空間定向或者相互作用伴 侶之間的距離的要求的限制。因此認為，開發上述的基本技術以便提供現有技術所不具備的各種優點是非常重 要的。首先，通過探測生理或者藥物相關的生物活性物質或者分子之間的相互作用，可 極大地減少由人為實驗設置所產生的誤導性的結果。第二，不同于依賴總體表達譜或者復 雜的生物表型的間接讀出方法，能夠直接將生物活性分子之間的相互作用轉化成清楚的讀 出信號。因此，可避免有關生物活性分子和分子靶標的內在假陽性/陰性或者錯誤傾向的 推導。第三，對于生物活性分子之間的相互作用來說能夠進行動態的單細胞分子的分析。單 個活細胞的動態分析提供了可在生理和藥物條件下的廣泛范圍內分析異源細胞間不同時 發生的細胞內過程的有效方法。因此，上述的基本技術可被用于檢測在廣泛的組織和疾病狀態的范圍內在活細胞 內的各種生物相互作用(例如生物活性小分子和蛋白質之間的相互作用)和蛋白質修飾 (例如磷酸化)。為了滿足上述的基本技術的需要并解決現有技術中出現的問題，本發明的發明人 不僅已經在體外研究了動態分子生物活性分子之間的相互作用，而且還研究了在體內的相 互作用。結果，本發明的發明人發現，生物活性分子之間的相互作用可通過分析各種生物活 性分子是否導致納米組裝陣列的形成或者生物活性分子是否共同定位在納米組裝陣列上 來分析和測定，由此完成本發明。

發明內容
發明目的本發明的目的在于提供直接測定作為專一性生物活性分子的誘餌與用于測定與 作為待測生物活性分子的捕獲物之間的相互作用的方法，以及用于測定與誘餌相互作用的 捕獲物的方法。本發明的另一目的在于提供分析和測定阻斷、抑制、活化或者誘導誘餌和捕獲物 之間的相互作用的目標分子的方法。為了實現上述目的，在第一種實施方式中，本發明提供了測定分子相互作用的方 法，所述方法包括下列步驟(i)將納米組裝陣列形成物質、誘餌和捕獲物提供到同一場合
7或者系統；(ii)通過誘餌與捕獲物之間的相互作用形成納米組裝陣列；以及(iii)檢查納 米組裝陣列是否形成，由此測定誘餌_捕獲物的相互作用。這里，誘餌-捕獲物相互作用通 過分析捕獲物與誘餌是否相互作用形成納米組裝陣列來檢測。在第二種實施方式中，本發明提供了測定分子相互作用的方法，包括下列步驟
(i)將媒介(調節)物質和具有與其結合的誘餌的納米組裝陣列提供到同一場合或系統；
(ii)通過媒介物質之間的相互作用形成納米組裝陣列；(iii)為形成的納米組裝陣列提供 捕獲物；以及(iv)通過與在形成的納米組裝陣列上存在的誘餌的相互作用測定捕獲物的 結合位置，以便測定捕獲物是否與誘餌共同定位，由此測定誘餌_捕獲物的相互作用。這 里，分子相互作用通過分析捕獲物與納米組裝陣列上的誘餌是否共同定位來測定。在第三種實施方式中，本發明提供了測定分子相互作用的方法，包括下列步驟 (i)將結合有第一媒介(調節)物質的納米裝配陣列形成物質和結合有第二(調節)物質 的誘餌提供到同一場合或系統；(ii)通過第一媒介(調節)物質之間的相互作用形成納 米組裝陣列，并通過第二媒介物質之間的相互作用將誘餌結合到形成的納米組裝陣列上；
(iii)給形成的納米組裝陣列提供捕獲物；以及(iv)通過與結合到形成的納米組裝陣列上 的誘餌的相互作用測定捕獲物的結合位置以便確定捕獲物是否與誘餌共同定位，由此測定 誘餌_捕獲物相互作用。這里，誘餌_捕獲物相互作用通過分析捕獲物是否與納米組裝陣 列上的誘餌共同定位來測定。此外，本發明提供了測定阻斷(抑制)或者活化(誘導)誘餌與捕獲物之間的相 互作用的目標分子的方法。通過下列詳細描述和隨附的權利要求書，本發明的其他特征和實施方式將更加明顯。


圖1是顯示根據本發明的第一種方法構造的用于測定X和Y之間的直接相互作用 或者X和Y通過A的間接相互作用的示意圖。在圖1中，X、Y和A是相同或不同物質，并且 N是納米組裝陣列形成物質；圖2(a)是顯示根據本發明的第二種方法構造的當通過A和B之間的直接相互作 用或者A和B通過C的間接相互作用誘導的納米組裝陣列形成時用于測定探針X和Y之間 的相互作用的示意圖。在圖2中，A、B和C是相同或不同物質，X和Y是相同或不同物質， 并且N是納米組裝陣列形成物質；圖2(b)是顯示根據本發明的第三種方法構造的當通過第一種媒介(調節)物質 A、B、C和D之間的相互作用誘導的納米組裝陣列形成時測定X和Y之間的相互作用同時通 過第二種媒介(調節)物質E和F之間的相互作用測定物質X與形成的納米組裝陣列結合 的示意圖。這里，A、B、C和D是相同或不同物質，E和F是相同或不同的物質，X和Y是相 同或不同物質，并且N是納米組裝陣列形成物質；圖3示出了通過鐵蛋白的自組裝形成的納米單元陣列的結構；圖4是顯示測定物質FKBP和FRB通過媒介雷帕霉素(雷帕霉素)彼此相互作用 形成納米組裝陣列的示意圖；圖5是顯示通過細胞中的FKBP-FRB相互作用的納米組裝陣列形成的熒光顯微照片；圖6是顯示在各個時間點通過FKBP-FRB相互作用的納米組裝陣列形成的共聚焦 顯微照片；圖7是顯示與FKBP和FRB結合的熒光蛋白彼此交換的情形的熒光顯微照片；圖8和圖9是顯示兩種蛋白質FKBP和FRB之間的專一性相互作用的熒光顯微照 片；圖10是顯示人干細胞中通過FKBP-FRB相互作用形成納米組裝陣列的熒光顯微照 片；圖11是顯示其中使用雷帕霉素的競爭性化合物處理H(506的情形的熒光顯微照 片；圖12和圖13是顯示對于各種熒光蛋白的粘附的影響的觀察結果的熒光顯微照 片；圖14是顯示在細胞核中通過使用連接有NLS(核定位信號)的鐵蛋白，并通過 FKBP-FRB相互作用形成納米組裝陣列的熒光納米照片；圖15是顯示IkB a和RelA的測定材料以各種方式(A、B和C)彼此相互作用形成 納米組裝陣列的示意圖；圖16是顯示如圖15A的情況下，通過IkB a和RelA蛋白之間的相互作用的納米 組裝陣列形成的熒光顯微照片；圖17是顯示如圖15B的情況下，通過FRB和FKBP之間的相互作用以及使用雷帕 霉素處理的IkB a和RelA之間的相互作用的納米組裝陣列形成的熒光顯微照片；圖18是顯示如圖15B的情況下，通過FRB和FKBP之間的相互作用以及使用雷帕 霉素處理的IkBa和RelA之間的相互作用的另一種大的納米組裝陣列形成的熒光顯微照 片；圖19是顯示各種熒光蛋白的影響的熒光顯微照片；圖20是顯示通過使用雷帕霉素處理的FRB和FKBP之間的相互作用以及使用生理 信號TNFa處理的IkB a and bTrCP之間的相互作用的大的納米組裝陣列形成的熒光顯微 照片；圖21是顯示根據通過TNFa的IKKb_IkB a相互作用的大納米組裝陣列形成的熒 光顯微照片；圖22是顯示通過鐵融合蛋白的RNA與調節蛋白之間的多重相互作用的大納米組 裝陣列形成的示意圖；圖 23 是顯示通過 PAZ 與 miRNA 結合、let_7b (miRNA)與 lin28_MS2bs (mRNA)結合 以及lin28-MS2bs(mRNA)與MS2CP結合的大納米組裝陣列形成的熒光顯微照片；圖24和圖25顯示根據由雷帕霉素在96孔板中的FRB-FKBP相互作用的納米組裝 陣列的形成，使用In-Cell Analyzer 1000 (GE)高速成像的熒光顯微照片；圖26是顯示通過使用In-Cell Developer (GE)的算法定量分析成像結果得到的 結果的示意圖；圖27是顯示通過FKBP蛋白的專一性突變(mt)和FRB-FKBP相互作用的納米組裝 陣列的形成和對接的示意圖28是顯示通過FKBP蛋白的專一性突變(mt)和FRB-FKBP相互作用的納米組裝 陣列的形成和對接的熒光顯微照片；
圖29是顯示競爭性化合物H(506對與圖28的納米組裝陣列的表面對接的抑制效 果的熒光顯微照片；圖30和圖31是顯示通過FKBP (F36M)突變和DHFR蛋白-MTX化合物相互作用的 納米組裝陣列的形成和對接的熒光顯微照片；圖32是顯示FKBP (F36M)突變蛋白的數量受到調節的情況下得到的納米組裝陣列 的熒光顯微照片；圖33是顯示在FKBP (F36M)突變蛋白的數量受到調節的情況下得到的變化時間點 的納米組裝陣列的模式的熒光顯微照片；圖34是顯示通過FRB-FKBP相互作用，包括使用作為FKBP相互作用媒介(調節) 化合物的AP1510處理的納米組裝陣列的形成和對接的示意圖；圖35和圖37是顯示通過FRB-FKBP相互作用，包括使用作為FKBP相互作用媒介 (調節)化合物的AP1510處理的納米組裝陣列形成和對接的熒光顯微照片；圖36是顯示對于各種熒光蛋白的影響的觀察結果的熒光顯微照片。
具體實施例方式在本發明中使用的術語定義如下。在本文中，術語“生物活性化合物“指的是與生物分子包括蛋白質、核酸、多糖或脂 類，在體內結合以調節生物分子的功能或活性的化合物。所述生物活性化合物從有機體中 提取或者通過化學合成制備。各種抗生素例如在器官移植之后用于減少免疫排斥的“環孢 霉素A” (Novartis AG)和“H(506” (Fujisawa)是從微生物、植物或者海洋生物中提取的。 在檢驗其藥物活性并使用動物模型和人類模型進行臨床實驗之后，這些天然或合成的生物 活性化合物被開發為新藥。在本文中，術語“生物活性分子”可被定義為在有機體的生命過程中執行調節功能 例如促進或抑制有機體的功能的物質。這種生物活性分子可通過天然產物例如動物或植 物得到，或者從微生物、動物和植物細胞系的代謝產物中提取或純化。此外，其還可以通過 化學合成得到。生物活性分子的例子可包括核酸、核苷酸、蛋白質、縮氨酸、氨基酸、多糖、脂 類、維生素和化學化合物。在本文中，術語“誘餌”指的是用于測定與其他生物活性分子相互作用的生物活性 分子。在本文中，術語“捕獲物”指的是待探測(分析)或者測定的生物活性分子，其為 “誘餌”的相互作用伴侶。在本文中，術語“目標分子”指的是待測物質。根據所需用途，目標分子可以是與 誘餌相互作用的捕獲物。目標分子也可以是活化、誘導、阻斷或者抑制誘餌與捕獲物之間的 相互作用的物質。也就是說，目標分子包括所有待識別的分子。在它們中，阻斷或抑制誘餌 與捕獲物之間的相互作用的分子被定義為“阻斷劑分子”，活化或誘導其相互作用的分子被 定義為“活化劑分子”。在本文中，術語“納米組裝陣列”指的是可以通過分子的重復組裝或相互作用很容易觀察到的大的陣列。所述組裝包括自組裝。術語“納米組裝陣列形成物質”指的是具有 能夠形成納米組裝陣列的性質和功能的所有物質。在本文中，術語“媒介(調節)物質”指的是誘導納米組裝陣列形成的物質。這意 味著包括能夠通過與納米組裝陣列形成物質直接或間接結合、相互作用或融合以誘導形成 納米組裝陣列的所有物質。介導或調節媒介(調節)物質的物質還可被定義為廣義上的媒 介(調節)物質。媒介(調節)分子不僅包括誘導納米組裝陣列形成的特定化合物或者蛋 白質，還包括例如特定突變等現象和特定生理信號。例如，納米組裝陣列的形成可通過來自 生理信號的蛋白質之間的相互作用、RNA和蛋白質之間的相互作用、特定蛋白質的特定突變 的使用或者僅僅與特定化合物相互作用的蛋白質的使用而被誘導，在本發明的說明書中這 些現象和信號被稱為“媒介(調節)物質”。下面，將詳細描述本發明。在一個方面，本發明涉及體外或體內測定特定分子“誘餌”(例如特定生物活性分 子)與待分析和測定的分子“捕獲物”(例如另一種生物活性分子)之間的相互作用的方法。在第一方面中，本發明提供了測定分子相互作用的方法，包括下列步驟(i)將納 米組裝陣列形成物質、誘餌和捕獲物提供到同一場合或者系統；(ii)通過誘餌與捕獲物 之間的相互作用形成納米組裝陣列；以及(iii)檢查納米組裝陣列是否形成，由此測定誘 餌-捕獲物相互作用。優選地，每種誘餌和捕獲物可以以連接標記物的狀態被提供。這里， 在步驟(i)中，能夠介導或調節誘餌和捕獲物之間的相互作用的媒介(調節)物質可被另 外提供。媒介(調節)物質還可以以連接標記物的狀態被提供。能夠形成納米陣列的物質(此后稱為“納米組裝陣列形成物質”)可以以直接或間 接與其連接的任何檢測物質誘餌的狀態被提供，同時納米組裝陣列形成物質與待分析的另 一種測定物質捕獲物結合。此外，納米組裝陣列形成物質可以以連接媒介(調節)物質的 狀態被提供，同時誘餌分子和捕獲物分子可以以連接媒介物質(調節物質)的狀態被提供。在根據本發明的第一方面的測定分子相互作用的方法中，當納米組裝陣列形成 時，誘餌-捕獲物相互作用或者誘餌_捕獲物_媒介物質相互作用可被確定發生，并且當納 米組裝陣列沒有形成時，可確定所述物質沒有相互作用。第一種方法的示意圖在圖1中示出。在該方法中，檢查了納米組裝陣列是否通過 誘餌_捕獲物相互作用形成。例如，如果物質之間的相互作用未知的話，該方法可被用于測 定誘餌、捕獲物和媒介(調節)物質之間的相互作用。這里，誘餌-捕獲物相互作用可以是兩種分子之間的直接作用，或者是由介導(調 節)誘餌與捕獲物之間的相互作用的物質引起的間接相互作用。在后一種情況下，媒介(調 節)物質可以是兩種或者兩種以上的組合。在一個例子中，圖4適宜性地示出了測定物質FKBP(對應于圖1中的“X”)和 FRB(對應于圖1中的“Y”)通過雷帕霉素(對應于圖1中的“A”)彼此相互作用以形成通 過鐵融合蛋白的納米組裝陣列。根據本發明的第一方面的實施例的示意圖在圖15中示出。也就是說，圖15示意 性地示出了測定物質IkB α和RelA以各種方式彼此相互作用(A、B和C)通過鐵融合蛋白 形成納米組裝陣列形成物質。
首先，圖15中的“Α”示出了納米組裝陣列通過分別與鐵蛋白融合的IkBa與 RelA(捕獲物和誘餌)之間的直接相互作用形成的情形。同樣，圖15中的“B”示出了大納 米組裝陣列在細胞中通過將誘餌IkB α和媒介(調節)物質FRB蛋白與鐵蛋白融合、將媒介 (調節)物質FKBP與捕獲物RelA蛋白融合，然后引起媒介(調節)物質FRB和FKBP之間 的相互作用以及誘餌與捕獲物分子IkB α和RelA之間的相互作用而形成的情形。圖15中 的“C”示出了更大的納米組裝陣列僅僅通過將媒介(調節)物質FRB與鐵蛋白融合，將媒 介物質(調節)物質FKBP與IkB α和RelA(捕獲物和誘餌)的每種融合并引起媒介(調 節)物質FRB和FKBP之間的相互作用以便將FKBP與鐵蛋白的FRB連接而形成的情形。圖15中的“B”和“C”的情形采用了 IkBa和RelA之間的間接相互 作用，由于這 種原因，使用了媒介(調節)物質FRB和FKBP之間的相互作用。特別是，媒介(調節)物 質FRB和FKBP以及捕獲物-誘餌IkBa和RelA彼此相互作用形成大納米組裝陣列。這里， 雷帕霉素作為另一種介導(調節)媒介(調節)物質FRB和FKBP之間的相互作用的物質 可另外使用。特別是，圖15中的情形“C”示出了更大的納米組裝陣列可通過僅僅將媒介(調 節)物質FRB與鐵蛋白連接的物質之間的多重相互作用形成。除了上述的通過測定由測定物質之間的直接或間接相互作用引起的納米組裝陣 列的形成來測定分子相互作用的方法之外，本發明提供了其他兩種檢測方法，如下所述。在 這兩種方法中，納米組裝陣列通過媒介(調節)物質形成，然后測定能夠與在形成的納米組 裝陣列上存在的誘餌相互作用的捕獲物。特別是，在第二方面，本發明提供了測定分子相互作用的方法，包括下列步驟(i) 將媒介(調節)物質和結合有誘餌的納米組裝陣列提供到同一場合或系統；(ii)通過媒介 物質之間的相互作用形成納米組裝陣列；(iii)將捕獲物提供給形成的納米組裝陣列；以 及(iv)通過與在形成的納米組裝陣列上存在的誘餌的相互作用測定捕獲物的結合位置以 便確定捕獲物是否與誘餌共同定位，由此測定誘餌_捕獲物分子相互作用(見圖2的(a))。在第三方面，本發明提供了測定分子相互作用的方法，包括下列步驟(i)將結合 有第一媒介(調節)物質的納米組裝陣列形成物質和結合有第二(調節)物質的誘餌提 供到同一場合或系統；(ii)通過第一媒介(調節)物質之間的相互作用形成納米組裝陣 列，并通過第二媒介物質之間的相互作用將誘餌結合到形成的納米組裝陣列上；(iii)將 捕獲物提供到形成的納米組裝陣列上；以及(iv)通過與結合到形成的納米組裝陣列上的 誘餌的相互作用測定捕獲物的結合位置以便確定捕獲物是否與誘餌共同定位，由此測定誘 餌_捕獲物相互作用(見圖2的(b))。在根據第二和第三方面的每種方法的步驟(ii)中，與媒介(調節)物質相互作用 以誘導納米組裝陣列形成的另一種媒介(調節)物質可另外被提供。在步驟(iv)中，介導 或調節誘餌與捕獲物之間的相互作用的物質可另外被提供。優選地，誘餌、捕獲物和媒介 (調節)物質的每種可以以連接有標記物的狀態被另外提供。第二和第三種方法共同地包括通過已知彼此將發生相互作用的媒介(調節)物質 之間的相互作用形成納米組裝陣列，然后測定作為能夠與在形成的納米組裝陣列上存在的 誘餌相互作用的伴侶分子的捕獲物。但是，本發明的第二和第三種方法的最大差別在于，在第二種方法中的通過媒介(調節)物質之間的相互作用形成納米組裝陣列的步驟中，在納米組裝陣列通過媒介(調 節)物質的形成中，結合到納米組裝陣列形成物質上的誘餌參與了，相反，在第三種方法 中，納米組裝陣列僅僅由納米組裝陣列形成物質和媒介(調節)分子(第一種媒介(調節) 分子)形成，然后另一種媒介分子(第二種媒介(調節)分子)與得到的物質結合。這里， 介導或調節第一種媒介(調節)分子或者第二種媒介(調節)分子的物質可另外被使用。在測定分子相互作用的第二或第三種方法中，當確定捕獲物與誘餌共同定位時， 可確定誘餌和捕獲物彼此相互作用，而當確定捕獲物沒有與誘餌共同定位時，可確定捕獲 物和誘餌沒有彼此相互作用。本發明的第二種方法的示意圖在圖2中示出。將參照圖2描述本發明的一個實施例。圖30示意性地示出了通過下列方式得到 的實驗結果將誘餌DHFR(與圖2中的“X”對應)結合到納米組裝陣列形成物質，鐵蛋白 (對應于圖2中的“N”)上；在細胞中以單體分布的FKBP蛋白質(對應于圖2中的“A”和 “B”)中制造特定突變(對應于圖2中的“C”)，以便允許FKBP蛋白質彼此結合，從而誘導納 米組裝陣列的自發形成；然后允許MTX化合物(與圖2中的“Y”對應)與DHFR相互作用， 使MTX化合物對接或者補充到納米組裝陣列。在第二種方法的另一種實施例中，圖34示意性地示出了包括下列步驟的實驗過 程將誘餌FKBP(對應于圖2中的“A”、“B”和“X”)結合到納米組裝陣列形成物質，鐵蛋白 (對應于圖2中的“N”)上；通過媒介(調節)物質AP1510(對應于圖2中的“C”)形成納 米組裝陣列；然后允許存在于納米組裝陣列上的FKBP(誘餌)與FRB(捕獲物)(對應于圖 2中的“Y”)相互作用，使FRB(捕獲物)對接或者補充到納米組裝陣列，從而FKBP(誘餌) 和FRB (捕獲物)彼此共同定位。這里，FKBP通過與AP1510化合物相互作用起到形成納米 組裝陣列的媒介(調節)物質的作用，同時起到與FRB(捕獲物)相互作用的誘餌的作用。本發明的第三種方法的示意圖在圖2(b)中顯示。參見圖2(b)，本發明的第三種方法的實施例包括將第一種媒介(調節)物質 FKBP(A、B和D)結合到納米組裝陣列形成物質，鐵蛋白(N)上；通過第一種媒介物質FKBP 與AP1510化合物(C)相互作用形成納米組裝陣列；允許得到的物質與結合有第二種媒介 (調節)物質FRB (E)的特定誘餌(X)相互作用；并通過調節第二種媒介(調節)物質的作 用的雷帕霉素(F)將誘餌結合到納米組裝陣列(FKBP-FRB相互作用)。而且，作為誘餌(X) 的伴侶物質的捕獲物(Y)與納米組裝陣列上存在的誘餌相互作用，使其對接或者補充到納 米組裝陣列，從而使FKBP (誘餌)與FRB (捕獲物)彼此共同定位。這里，第二種媒介(調節)物質還可通過與結合到納米組裝陣列形成物質上的第 一種媒介(調節)物質直接相互作用而被轉移到形成的納米組裝陣列上，而不使用獨立的 另外的媒介(調節)分子(例如，不使用物質F)。在上述的本發明的方法中，在本發明中使用的物質包括納米組裝陣列形成物質、 誘導納米組裝陣列形成的媒介(調節)物質、誘餌、捕獲物和標記物之間的結合可包括物 理、化學、靜電或者生物直接或者間接結合。在這些結合方式中，當生物結合發生時，包括抗 體、蛋白質、蛋白質域、基因序列、縮氨酸以及類似物的探針都可被使用。下面，將描述在上述的方法中使用的特定構造元件。在本文中，“納米組裝陣列形成物質”是具有多種相同或不同結合半分子并可通過它們之間的相互作用或者自組裝形成陣列的物質。優選地，使用可通過自組裝形成陣列的 物質。這些陣列優選由納米粒子構成。通過自組裝形成納米組裝陣列的物質的優選例子包括鐵蛋白、類鐵蛋白、磁小體 蛋白(magnetosome protein)或者病毒蛋白。此外，各種化學合成的納米粒子也可形成納 米組裝陣列。例如，各種納米粒子，包括金納米粒子、量子點(Q dot)或者磁納米粒子可被 使用。在本發明的一種實施例中，在可通過自組裝形成納米單元陣列的分子或蛋白質中，使 用鐵蛋白。鐵蛋白通過24個鐵蛋白的自組裝形成球形納米粒子陣列，具有大約12nm的外徑 和大約9nm的內徑，并含有超過2500個鐵原子(Chasteen，N. D. Struc. Biol. 126 182-194， 1999)。如果納米組裝陣列通過由鐵蛋白形成的納米微粒陣列的表面上發生的誘餌與捕獲 物之間的相互作用或者媒介(調節)物質之間的相互作用形成，該相互作用可通過分析標 記物例如結合到誘餌、 捕獲物或者媒介(調節)物質上的熒光、發光、磁性或者放射性物質 使用分析裝置例如顯微鏡動態測定。圖3示出了由24個鐵蛋白自組裝形成的具有8nm內徑的納米粒子陣列。在圖3 中，綠色小珠示出了本發明的實施例中的各種待分析物質與其結合的氨基末端部分。當結 合到鐵蛋白納米陣列的表面上的物質彼此相互作用時，它們以陣列形式彼此連接以形成納 米組裝陣列，如在本發明的實施例中觀察到的那樣。磁小體蛋白是在在細胞中積累磁性的磁細菌的細胞器磁小體中積累的大約 100-nm的磁粒子的膜中存在的蛋白質。這種磁小體蛋白也可在本發明中使用，因為它們可 通過由它們之間的磁性自組裝形成納米粒子陣列。作為與測定物質對應的誘餌和與誘餌的伴侶對應的捕獲物，任何與其彼此相互作 用的候選分子都可被使用。優選地，使用生物活性分子。生物活性分子包括所有在體內顯示生理活性的物質，并且作為生物活性分子，可 在體內與生物物質相互作用以調節生物物質的功能或活性的任何分子都可被使用。生物活 性物質的優選例子包括核酸、單核苷酸/寡核苷酸/多聚核苷酸、蛋白質、單肽/寡肽/多 肽、氨基酸、單糖/寡聚糖/多糖、脂類、維生素和化學物質以及此外的構成所述分子的小分 子。誘餌與捕獲物之間的相互作用的特定例子可包括作為雷帕霉素化合物的藥物學 相關的結合伴侶的FRB與FKBP之間的相互作用，Π(506化合物與作為其藥物學相關伴侶的 FKBP蛋白質之間的相互作用，ΑΡ1510化合物與FKBP蛋白質之間的相互作用，IkBa蛋白 質與作為其結合伴侶的RelA之間的相互作用，根據TNFa的生理信號而被調節的IkBa蛋 白質與作為IkB α蛋白質的結合伴侶的bTrCP或者IKKb蛋白質之間的相互作用，miRNA與 mRNA的細胞內相互作用(與lin-28 mRNA結合的let_7b miRNA)，Ago2蛋白質與miRNA的 相互作用，MS2蛋白質與MS2-結合mRNA位點的相互作用，DHFR蛋白質與MTX化合物的細胞 內相互作用，等等。調節誘餌_捕獲物相互作用的媒介(調節)物質是活化誘餌_捕獲物相互作用以 介導(調節)誘餌與捕獲物之間的結合的物質，并且作為媒介(調節)物質，任何生物活性 分子或者化合物都可被使用而沒有限制，只要它們顯示了上面的功能。但是，與誘餌_捕獲 物對專一性相互作用的分子優選被使用。由于納米組裝陣列通過誘餌與捕獲物之間的相互作用形成，介導誘餌-捕獲物相互作用的物質被認為屬于誘導如在本發明中定義的納米組裝陣列形成的物質的媒介(調節)物質的范圍。為了介導(調節)捕獲物_誘餌相互作用，受到外部信號調節的蛋白質可被使用。 作為替代，專一性結合目標mRNA的miRNA的性質也可被使用。在一個實施例中，圖22示意 性地示出了大納米組裝陣列通過RNA與調節蛋白之間的相互作用由鐵融合蛋白形成。具體 地說，根據外部信號被調節的蛋白質的使用使其能夠分析在細胞中由生理信號發生的非常 靈敏的測定物質之間的相互作用。在本發明的一個實施例中，當使用FKBP-FRB對時，雷帕霉素被用作媒介(調節) 物質，當使用IkB α -bTrCP對和IkB α -IKKb對時，根據外來信號受到調節的TNFa被用作媒 介(調節)物質。另外，當使用 PAZ-MS2CP 對時，let-7b (miRNA)與 lin28_MS2bs (mRNA)之 間的結合被用作媒介(調節)物質。在本發明中誘導納米組裝陣列形成的媒介(調節)物質意味著包括可直接或間接 在納米組裝陣列形成物質的表面上彼此相互作用以形成納米組裝陣列的所有物質。介導或 者調節媒介(調節)物質活性的這些物質也可被認為是廣義上的媒介(調節)物質。如上 所述(第一種方法)，當納米組裝陣列受到誘餌_捕獲物相互作用誘導時，調節或者介導誘 餌-捕獲物相互作用的物質也可包括在廣義上的媒介(調節)物質范圍內。作為這種媒介(調節)物質，任何物質都可被使用而沒有限制，只要它們顯示了誘 導納米組裝陣列形成的功能。因此，可通過特定現象例如彼此專一性相互作用的物質之間 的結合或者突變誘導納米組裝陣列形成的所有物質和現象都可被理解為媒介(調節)物 質。也就是說，這里使用的術語“媒介(調節)物質”意味著包括所有特定物質、特定現象 或者特定相互作用。所述媒介(調節)物質可以兩種或多種組合使用。如果使用誘餌-捕獲物對對捕獲物進行檢測，同時使用誘餌的性質形成納米組裝 陣列，則認為所使用的誘餌是誘導納米組裝整列形成的媒介(調節)物質，同時其顯示了用 于測定與伴侶捕獲物的相互作用的誘餌功能。在一個實施例中，FKBP蛋白質通過特定突變彼此結合誘導了納米組裝陣列的形 成，然后FRB蛋白質通過FKBP蛋白質與伴侶蛋白FRB之間的相互作用，通過雷帕霉素被對 接或者補充到納米組裝陣列中(圖27)。在這種情況下，FKBP蛋白質顯示了通過突變形成 納米組裝陣列的功能(起到媒介(調節)物質的作用)，并且同時顯示了與FRB蛋白相互作 用的功能(起到誘餌的作用)。另外，介導(調節)FRB-FKBP相互作用的雷帕霉素還與另一 種媒介(調節)物質對應[實施例6-⑴]。在另一實施例中，通過將FKBP蛋白質與鐵蛋白連接并使用AP1510 (介導(調節) FKBP相互作用的化合物)處理該蛋白質誘導納米組裝陣列的形成，然后將作為FKBP的伴侶 物質的FRB蛋白質結合并對接或者補充到通過經雷帕霉素的FKBP與FRB相互作用的納米 組裝陣列的表面上。在這種情況下，FKBP蛋白質同時顯示了由AP1510(起到媒介(調節) 物質的作用)形成納米組裝陣列的功能和與FRB蛋白質(起到誘餌的作用)相互作用的功 能。同樣地，介導(調節)FRB-FKBP相互作用的雷帕霉素也與另一種媒介(調節)物質對 應[實施例7]。同時，在本發明的方法中，優選地是使用標記物來檢查捕獲物_誘餌相互作用。特 別是，誘餌、捕獲物和/或媒介(調節)物質更優選結合有標記物的狀態被使用。
可通過使用標記物測定待測捕獲物與誘餌是否彼此共同定位在通過專一性物質 之間的相互作用形成的納米組裝陣列上來動態測定誘餌與捕獲物之間的相互作用。作為本發明的標記物，放射性標記、熒光物質或者發光物質可被使用。作為放射 性標記，所有通常可使用的標記物，例如32P，35S, 3H和4C都可被使用。自身顯示熒光或者通 過分子相互作用顯示熒光的熒光物質的例子可包括熒光染料，例如FITC和羅丹明；熒光 蛋白，例如 ECFP、TagCFP, mTFPl、GFP、YFP、CFP 和 RFP ；四-半胱氨酸基序(tetracystein motifs)；和熒光納米粒子。作為發光物質，自身發出光或者通過分子間相互作用發出光的 發光物質可被使用。例如，熒光素酶可被用作發光物質。在本發明中，標記物的位置和運動的變化通常可使用廣泛已知的方法測定，例如 光學儀器，包括顯微鏡、掃描儀、放射性標記物檢測裝置，熒光偏振閱讀儀(FP閱讀儀)，分 光光度計，MRI (核磁共振成像)、SQUID,熒光探測儀，發光探測儀等等。在根據本發明的第一方面的方法中，分子相互作用通過誘餌-捕獲物相互作用的 納米組裝陣列的形成來測定。這里，納米組裝陣列還可通過結合到納米組裝陣列形成物質 上的誘餌與捕獲物之間的直接結合形成，但是誘餌和捕獲物也可通過分別與誘餌和捕獲物 的相互作用的另一種媒介(調節)物質彼此間接結合(圖1)。也就是說，在第一種方法中， 納米組裝陣列是否形成通過誘餌-捕獲物相互作用來測定。在根據本發明的第二和第三方面的方法中，通過納米組裝陣列形成物質的納米組 裝陣列的形成使用媒介(調節)物質(誘導納米組裝陣列形成的物質)來進行。這里，納 米組裝陣列形成物質可以以結合到媒介(調節)物質和誘餌的狀態提供(第二種方法)，也 可以以只結合到媒介(調節)物質的狀態提供(第三種方法)。在后一種情況下，誘餌被單 獨提供而不與納米組裝陣列形成物質結合，但優選以能夠使其被轉移到形成納米組裝陣列 表面上的媒介(調節)物質融合的狀態提供。在本發明中，為了便于描述，在納米組裝陣列 形成中涉及的媒介(調節)物質被稱為第一媒介(調節)物質，而使誘餌能夠被轉移的媒 介(調節)物質被稱為第二媒介(調節)物質。根據本發明的第二和第三種方法，納米組裝陣列由媒介(調節)物質形成，并且誘 餌直接與納米組裝陣列結合或者存在于由媒介(調節)物質形成的納米組裝陣列的一部分 上。因此，當存在于形成的納米組裝陣列上的誘餌與伴侶捕獲物相互作用時，捕獲物 和誘餌都彼此共同定位，并且當誘餌不與捕獲物相互作用時，它們不共同定位。換言之，在 本發明的第二和第三方面，捕獲物不直接在納米組裝陣列的形成中涉及，并且通過對接或 補充到形成的納米組裝陣列的捕獲物位置的測定被認為是測定分子相互作用的標準。捕獲 物的對接或者補充通過與形成的納米組裝陣列上存在的誘餌相互作用來實現。“捕獲物和誘餌在納米組裝陣列上的共同定位”不意味著誘餌和捕獲物彼此結合以便形成納米組裝陣列的狀態，但是意味著定位在與形成納米組裝陣列的結合半分子不同 的獨立位置處的誘餌以及作為第二種構造被引入的捕獲物通過相互作用彼此結合的狀態， 因此共同定位在相同納米組裝陣列上。因此，在第二和第三種方法中，納米組裝陣列的形成通過媒介(調節)物質誘導，并且誘餌與捕獲物之間的相互作用決定了捕獲物與納米組裝陣列的誘餌共同定位。因此， 在納米組裝陣列形成過程中，如果捕獲物不能與誘餌相互作用，捕獲物被保持在其他位置，例如同源狀態。在本發明的第一、第二和第三種方法中，統計結果可在誘餌-捕獲物相互作用或 者其他媒介(調節)物質相互作用完成之后得到，并且通過媒介(調節)物質形成納米組 裝陣列的過程甚至在相互作用完成之前就可動態觀察。特別是，在第二和第三種方法中，共 同定位的動態分析是可能的。這種動態分析方法的優點在于信噪比可被增加。本發明的方法可在體外或體內進行。如果本發明的方法在體內進行，其可在如下 場所進行在原核細胞和真核細胞中；在哺乳動物的器官、組織或細胞中；以及在植物的器 官、組織或細胞中。特別是，本發明的方法可在斑馬魚、線蟲、酵母、蒼蠅或者青蛙的器官、組 織或細胞中進行。在本發明中使用的納米組裝陣列形成物質、誘餌、捕獲物、媒介(調節)物質(誘 導納米組裝陣列形成的物質)和標記物可通過通常廣泛已知的方法被引入到細胞中。例 如，它們可通過使用跨膜肽(transducible ρ印tide)(或者融合肽)、脂類(或者脂質體) 基因轉運體或者其復合物、或者通過將它們與細胞在OPTI-MEM中一起培養；或者通過電轉 化或磁轉染被引入到細胞中。特別是，當本發明的方法在體內進行時，其可在活細胞內在培 養板/盤上或者在微陣列化的活細胞內進行。為了使用所述方法測定專一性捕獲物與專一性誘餌的相互作用，捕獲物作為文庫 被提供。特別是，根據本發明的第一種方法，提供了用于測定與誘餌相互作用的捕獲物的 方法，所述方法包括下列步驟(i)將納米組裝陣列形成物質、誘餌和捕獲物文庫提供到 同一場合或者系統；(ii)通過誘餌文庫與捕獲物文庫之間的相互作用形成納米組裝陣列； (iii)檢查納米組裝陣列是否形成，由此測定誘餌-捕獲物相互作用；以及(iv)選擇、分離 和識別與誘餌相互作用形成納米組裝陣列的目標捕獲物。根據本發明的第二種方法，提供了測定與誘餌相互作用的目標捕獲物的方法，該 方法包括下列步驟(i)將媒介(調節)物質和結合有誘餌的納米組裝陣列提供到同一場 合或系統；(ii)通過媒介(調節)物質之間的相互作用形成納米組裝陣列；(iii)將捕獲物 文庫提供給形成的納米組裝陣列；(iv)通過與在形成的納米組裝陣列上存在的誘餌的相 互作用測定捕獲物的結合位置以便測定捕獲物是否與誘餌共同定位，由此測定誘餌-捕獲 物相互作用；以及(ν)選擇、分離和識別與誘餌相互作用以便與納米組裝陣列上的誘餌共 同定位的目標捕獲物。根據本發明的在第三方面，提供了測定與誘餌相互作用的目標捕獲物的方法，該 方法包括下列步驟(i)將結合有第一媒介(調節)物質的納米組裝陣列形成物質和結合 有第二(調節)物質的誘餌提供到同一場合或系統；(ii)通過第一媒介(調節)物質之間 的相互作用形成納米組裝陣列，并通過第二媒介物質之間的相互作用將誘餌結合到形成的 納米組裝陣列上；(iii)將捕獲物文庫提供到形成的納米組裝陣列上；(iv)通過與結合到 形成的納米組裝陣列上的誘餌的相互作用測定捕獲物的結合位置以便確定捕獲物是否與 誘餌共同定位，由此測定誘餌-捕獲物相互作用；以及(ν)選擇、分離和識別與誘餌相互作 用以便與納米組裝陣列上的誘餌共同定位的目標捕獲物。每種方法的詳細描述與上面描述的相同。使用上述方法，與誘餌相互作用以便共 同定位在納米組裝陣列上的捕獲物可作為目標分子被選擇、分離和識別。
而且，本發明提供了測定誘餌與捕獲物之間的相互作用并分析和測定影響該相互 作用的第三種分子目標分子的方法。特別是，根據本發明的第一種方法，提供了用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌與捕獲物之間的相互作用的目標分子的方法，所述方法包括下列步驟(i)將媒介(調 節)物質和結合有誘餌的納米組裝陣列形成物質提供到同一場合或者系統；(ii)在目標候 選物的存在下通過媒介(調節)物質之間的相互作用形成納米組裝陣列；(iii)將捕獲物 提供到形成的納米組裝陣列；以及(iv)選擇與在目標候選物不存在下誘餌與捕獲物共同 定位的程度相比，目標候選物存在下誘餌與捕獲物共同定位的程度被阻斷(抑制)或者活 化(誘導)的情況對應的目標候選物作為目標阻斷劑分子或者目標活化劑分子。根據本發明的第二種方法，提供了用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌與捕 獲物之間的相互作用的目標分子的方法，所述方法包括下列步驟(i)將媒介(調節)物質 和誘餌結合到納米組裝陣列形成物質并將這些物質提供到同一場合或者系統；(ii)在目 標候選物的存在下通過媒介(調節)物質之間的相互作用形成納米組裝陣列；(iii)將捕 獲物提供到形成的納米組裝陣列；以及(iv)選擇與在目標候選物不存在下誘餌與捕獲物 共同定位的程度相比，在目標候選物存在下誘餌與捕獲物共同定位的程度被阻斷(抑制) 或者活化(誘導)的情況對應的目標候選物作為目標阻斷劑分子或者目標活化劑分子。根據本發明的第三種方法，提供了用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌與 捕獲物之間的相互作用的目標分子的方法，所述方法包括下列步驟(i)將結合有第一媒 介(調節)物質的納米組裝陣列形成物質和結合有第二媒介(調節)物質的誘餌提供到同 一場合或者系統；(ii)在目標候選物的存在下通過第一媒介(調節)物質之間的相互作用 形成納米組裝陣列，并通過第二媒介(調節)物質之間的相互作用將誘餌結合到形成的納 米組裝陣列；(iii)將捕獲物提供到形成的納米組裝陣列；以及(iv)選擇與在目標候選物 不存在下誘餌與捕獲物共同定位的程度相比，在目標候選物存在下誘餌與捕獲物共同定位 的程度被阻斷(抑制)或者活化(誘導)的情況對應的目標候選物作為目標阻斷劑分子或 者目標活化劑分子。每種方法的詳細描述與上面描述的相同。使用上述方法，影響誘餌與捕獲物之間 的相互作用，即阻斷(抑制)或者活化(誘導)誘餌與捕獲物之間的相互作用的目標候選 物可被測定。
實施例此后，將參照實施例進一步詳細描述本發明。但是，應當理解，這些實施例僅僅用 于說明的目的，而不解釋為限制本發明的范圍。實施例1 通過化合物(雷帕霉素)與蛋白質(FKBP和FRB)之間的相互作用形成 納米組裝陣列鐵蛋白基因FTH1(基因庫BC013724)和FTL (基因庫BC016346)購自美國Open BioSystems 公司。在本發明中，將各種蛋白與鐵蛋白的末端連接并在分析中使用。WpcDNA 3.1為 基礎的重組基因被制備，其可在哺乳動物細胞中通過CMV啟動子通過將各種檢測蛋白(例 如Π(ΒΡ和FRB)和熒光蛋白(例如mRFP、EGFP, ECFP和YFP)與鐵蛋白(FT)的氨基末端連接表達各種融合蛋白。使用電轉化(1000V，35ms, 2 脈沖)將重組基因 H(BP-mRFP-FT 和 FRB-mRFP-FT 單獨或者共同引入到事先培養的Hela細胞(ATCC No. CCL-2)中。然后，將細胞在16孔室載 玻片(Nunc)中涂平板并在5% CO2培養箱中37°C下培養24小時以表達融合蛋白。為了便 于成像，將含有10% FBS的DMEM(Gibco)替換成OPTI-MEM(Gibco)，然后使用250nM(原液 濃度lmM原液；溶解在DMSO中)的雷帕霉素(Calbiochem)處理細胞，并使用熒光顯微鏡 (Olympus, 1X51)觀察細胞中鐵融合蛋白的分布(圖5)。圖4示意性地示出了通過媒介物質雷帕霉素測定通過分子FKBP與FRB之間間接 相互作用而形成納米組裝陣列的這種實施例，并且該實施例的結果在圖5中示出。作為陰性對照組，使用僅僅表達重組基因FKBP-mRFP-FT和FRB-mRFP_FT中的一種 的細胞。在這些細胞中，使用和不使用雷帕霉素處理細胞的所有情況下都不形成納米組裝 陣列。但是，在在細胞中表達蛋白質FKBP-mRFP-FT和FRB_mRFP-FT的情況下，僅僅當使用 雷帕霉素處理細胞的情況下，在細胞中形成納米組裝陣列。也就是說，與鐵蛋白結合的檢測分子FKBP和FRB通過與它們相互作用的媒介(調 節)物質雷帕霉素交聯，由此在細胞中形成納米組裝陣列。(1)納米組裝陣列隨著經過時間的形成FKBP、雷帕霉素和FRB之間的相互作用被實時觀察以便觀察鐵蛋白納米組裝陣列 的形成模式。將重組基因FKBP-EGFP-FT和FRB_mRFP-FT —起引入到培養的Hela細胞中，然后 在細胞中表達鐵融合蛋白。然后，將細胞使用250nM雷帕霉素處理，并且使用熒光顯微鏡在 10分鐘內以2分鐘為間隔分析鐵融合蛋白在細胞中的分布。結果，如同從圖6中看到的那樣，在FKBP-EGFP-FT和FRB_mRFP-FT蛋白質在細胞 中一起表達的情況下，這些蛋白質通過使用雷帕霉素的處理迅速彼此相互作用，并且納米 組裝陣列在細胞中在10分鐘內形成。(2)無熒光蛋白的納米組裝陣列的形成為了支持鐵蛋白的納米組裝陣列依賴于雷帕霉素處理而產生的事實，通過從圖6 的對中交換熒光蛋白制備的重組基因FKBP-mRFP-FT和FRB-EGFP-FT被引入到培養的Hela 細胞中，然后在細胞中表達鐵融合蛋白。然后，使用熒光顯微鏡觀察使用250nM雷帕霉素處 理的細胞和沒有使用雷帕霉素處理的細胞10分鐘。結果，如圖7中所示，在FKBP-EGFP-FT和FRB_mRFP-FT蛋白質在細胞中一起表達 的情況下，僅僅當使用雷帕霉素處理的情況下，這些蛋白質迅速彼此相互作用以形成納米 組裝陣列。(3)通過專一性相互作用形成納米組裝陣列為了顯示鐵蛋白的納米組裝陣列由FKBP、雷帕霉素和FRB之間的專一性相互作用 形成的事實，將鐵融合蛋白作為通過除去FRB制備的FKBP-EGFP-FT與mRFP-FT的組合在 Hela細胞中表達。然后，使用250nM雷帕霉素對細胞進行處理。結果，如圖8所示，與圖6和7的結果不同，僅僅FKBP作為鐵融合蛋白被表達，因 此FKBP與FRB之間通過雷帕霉素的專一性結合沒有出現，表明在細胞中沒有形成納米組裝 陣列。
而且，根據上面的方法，作為通過除去HiBP制備的由FRB-mRFP-FT與EGFP-FT組合的鐵融合蛋白在Hela細胞中被表達，并且細胞使用雷帕霉素進行處理。結果，如圖9所 示，僅僅FRB被表達為鐵融合蛋白，因此在細胞中沒有形成納米組裝陣列。這種結果表明，鐵蛋白的高組裝陣列由于雷帕霉素通過FKBP和FRB之間的專一性 相互作用而形成。(4)在干細胞中納米組裝陣列的形成將重組基因FKBP-mRFP-FT和FRB-EGFP-FT —起引入到來自人骨髓的人間葉細胞 干細胞中，然后在細胞中表達鐵融合蛋白。然后，使用250nM雷帕霉素(Calbiochem)對細 胞進行處理，并使用熒光顯微鏡分析鐵融合蛋白在細胞中的分布。結果，如圖10所示，在FKBP-mRFP-FT和FRB-EGFP-FT蛋白質在細胞中一起表達的 情況下，FKBP和FRB在干細胞中彼此相互作用以形成納米組裝陣列。測試實施例1-1 納米組裝陣列的形成是否依賴于媒介(調節)物質如圖11所示，為了驗證雷帕霉素介導的納米組裝陣列的專一性，將僅僅與FKBP蛋 白質專一性結合并且不與FRB蛋白質結合的Π(506用作雷帕霉素的競爭性化合物，并且使 用該競爭性化合物處理細胞。特別是，將細胞使用25 μ M FK506處理10分鐘，然后將250ηΜ雷帕霉素加入到細 胞中。在這種情況下，由于Π(506干擾了雷帕霉素與FKBP之間的結合，與圖6和7的結果 不同，不能觀察到由于雷帕霉素通過FKBP與FRB之間相互作用形成的納米組裝陣列。測試實施例1-2 納米組裝陣列的形成是否依賴于熒光物質除 H(BP-mRFP-FT 與 FRB-mRFT-F 組合(圖 5)或者 H(BP-mRFP-FT 與 FRB-EGFP-FT 組合(圖6和7)以外，在FKBP-EGFP-FT與FRB-ECFP-FT的組合以及FKBP-YFP-FT與 FRB-mRFP-FT的組合中，當使用250nM雷帕霉素處理細胞時，FKBP和FRB蛋白質在10分鐘 內有效地彼此專一性相互作用形成納米組裝陣列。也就是說，發現由于雷帕霉素通過FKBP與FRB蛋白之間相互作用形成的納米組裝 陣列不受影響，甚至當其他各種熒光蛋白與鐵蛋白連接時也是如此(圖12和圖13)。測試實施例1-3 納米組裝陣列的形成是否依賴于位置由于鐵蛋白是定位在細胞質中的蛋白質，FKBP與FRB蛋白質之間通過雷帕霉素的 相互作用主要在細胞質中被觀察。為了檢查是否可通過鐵蛋白的納米組裝陣列形成看到在細胞中的各種細胞器中 分子的相互作用，將NLS(核定位信號)與鐵蛋白連接，使鐵融合蛋白可被移位到核中。在 這種狀態下，使用250nM雷帕霉素對細胞進行處理。結果，觀察到納米組裝陣列可在核中通 過FKBP與FRB蛋白之間的相互作用形成，但形成的效率低于在細胞質中形成的情況下(圖 14)。實施例2 通過蛋白質之間的相互作用形成納米組裝陣列以如圖15所示的各種方式(A、B和C)檢查了納米組裝陣列是否通過測定分子 IkBa與RelA之間的相互作用形成。(1)圖15中的“A”方法當將IkB α和RelA與鐵蛋白直接融合時，進行檢測以便檢查納米組裝陣列在細胞 中通過IkB α和RelA在細胞中的表達自發形成。
將重組基因IkBa -YFP-FT (pcDNA 3. 1)和 RelA-mRFP-FT (pcDNA 3. 1)引入到在實 施例1中培養的Hela細胞中，然后在細胞中表達鐵融合蛋白。結果，如圖16所示，納米組 裝陣列在細胞中通過IkB α與RelA蛋白質之間的相互作用形成。(2)圖15中的“B”方法將IkBa和FRB蛋白質分別與鐵蛋白融合，并將RelA蛋白質與FKBP融合。使用 250nM雷帕霉素對融合蛋白進行處理。也就是說，對于媒介(調節)物質(FRB-FKBP)，將雷 帕霉素用作調節媒介(調節)物質之間的相互作用的另一種媒介(調節)物質。將重組基因FRB-ECFP-FT、FKBP-mRFP-RelA 和 IkB a -YFP-FT 一起引入到 Hela 細 胞中，然后在細胞中表達鐵融合蛋白。結果，如圖17所示，觀察到當使用雷帕霉素對細胞進 行處理時，FRB和FKBP蛋白質作為媒介(調節)物質彼此相互作用，同時IkB α和ReIA蛋 白質作為捕獲物和誘餌彼此相互作用，由此在細胞中形成大的納米組裝陣列。(3)圖15中的“C”方法將FKBP蛋白與IkB α和RelA融合，并僅僅FRB與鐵蛋白融合。進行檢測以觀察 IkB α和RelA中的FKBP蛋白是否可通過雷帕霉素與鐵蛋白的FRB連接形成納米組裝陣列。將重組基因FRB-ECFP-FT、FKBP-mRFP-RelA 和 IkB α -YFP-FKBP 一同弓丨入到 Hela 細胞中，然后在細胞中表達每種融合蛋白。結果，如圖18所示，觀察到當使用雷帕霉素對細 胞進行處理時，FRB和FKBP蛋白質作為媒介(調節)物質彼此相互作用，同時IkB α和ReIA 蛋白質彼此相互作用，由此在細胞中形成大納米組裝陣列。也就是說，發現當僅僅將媒介(調節)物質FRB與鐵蛋白連接時，更大的納米組裝 陣列可通過檢測分子之間的多重相互作用形成，這與實驗(2)中的結果不同。通過這些結果可以看出，納米組裝陣列在細胞通過檢測分子例如lego之間的相 互作用以各種適應性(flexibilities)形成，因此可以各種適應性分析檢測分子之間的相
互作用。(4)熒光蛋白的不同組合以與實驗(3)中相同的方式進行檢測，但如圖19所示，將與實驗(3)中不同的熒 光蛋白組合與IkBa、RelA和鐵蛋白融合。將重組基因FRB-mRFP-FT、FKBP-YFP-RelA 和 IkB α -ECFP-FKBP —同弓丨入到 Hela 細胞中，然后在細胞中表達鐵融合蛋白。當使用雷帕霉素對細胞進行處理時，FRB和FKBP蛋 白質彼此相互作用，同時IkB α和RelA蛋白質彼此相互作用，由此在細胞中形成大納米組 裝陣列。結果，如圖19所示，即便當各種熒光蛋白的組合與每種蛋白質連接時，通過IkBa 與RelA蛋白質之間的相互作用形成的納米組裝陣列也沒有受到影響。實施例3 通過生理信號由蛋白質之間的相互作用形成納米組裝陣列進行測試檢查根據外部信號受到調節的蛋白質之間的相互作用是否可被分析。外 部信號作為介導(調節)捕獲物與誘餌之間的相互作用的物質而被使用。將重組基因FRB-ECFP-FT、H(BP-mRFP-bTrCP 和 IkB α -YFP-FKBP 一同引入到 Hela 細胞中，然后在細胞中表達每種融合蛋白。雖然在實施例2中使用的IkBa總是與RelA蛋 白相互作用，而不管是否有細胞外的刺激，僅僅當將外來生理信號TNFa傳遞到細胞時其與 bTrCP蛋白質相互作用。由于這種原因，使用TNFa對細胞進行處理。
結果，如圖20所示，通過IkBa與bTrCP蛋白質之間的彼此相互作用，以及FRB和 FKBP蛋白質作為媒介(調節)物質通過使用另一種媒介(調節)物質雷帕霉素處理彼此相 互作用，由此在細胞中形成鐵蛋白的納米組裝陣列。在另一個實施例中，IKKb-IkB α蛋白質被用作捕獲物-誘餌，并且TNFa被用作用 于介導(調節)它們之間的相互作用的物質。僅僅當將外來生理信號TNFa傳遞到細胞時， IkB α和IKKb蛋白質彼此相互作用。已知磷酸化酶(例如IKKb)與作為其底物的IkB α之間 的相互作用是細胞中最微弱的相互作用的一種。將重組基因FRB-ECFP-FT、IKKb-HiRFP-FKBP 和IkBa-YFP-FKBP—同引入到Hela細胞中，然后在細胞中表達每種融合蛋白。結果，如圖 21所示，在細胞中使用TNFa處理通過IkB α與IKKb之間的相互作用形成大的納米組裝陣 列。通過上述結果發現，在細胞中由生理信號出現的非常靈敏的檢測分子之間的相互 作用可通過納米組裝陣列分析。實施例4 通過RNA與蛋白質之間的相互作用的納米組裝陣列的形成如圖22所示，設計了實驗使納米組裝陣列通過RNA與調節蛋白之間的相互作用形 成。在實驗中使用的蛋白質Ago2是與miRNA相互作用的調節蛋白，并由多個功能域構 成。在這些功能域中，PAZ功能域在與miRNA相互作用中是重要的。具有該功能域的鐵融 合蛋白可與miRNA相互作用，并且miRNA專一性地結合目標mRNA。該實驗被設計成當MS2 結合序列與目標mRNA的末端連接時，其與鐵融合蛋白包括MS2蛋白相互作用，也就是說， miRNA與目標mRNA結合，由此形成大納米組裝陣列。首先，基于與miRNA相互作用的Ago2的PAZ功能域和PiWi功能域，全長突變、 PAZ-Piffi功能域缺失突變、PiWi功能域缺失突變和PAZ功能域缺失突變被構造。然后，MS2 蛋白通過其能夠結合的MS2結合序列(5' -AAA CAT GAG GAT CAC CCA TGT-3' :SEQ ID NO 1)可被連接到作為目標mRNA的lin28_MS2bs的末端，由此構造了 MS2CP-mRFP_FT。通過電轉化將PAZ-CFP-FT、lin28-MS2bs (mRNA)和 MS2CP-mRFP_FT 引入 Hela 細胞 中，然后在細胞中表達16小時。然后，將let7b miRNA表達載體另外引入到細胞中，20小時 后，觀察細胞。結果，如圖23所示，大的納米組裝陣列通過PAZ-CFP-FT融合蛋白與miRNA之間 的結合、let-7b (miRNA)與 lin28_MS2bs (mRNA)之間的結合以及 lin28_MS2bs (mRNA)與 MS2CP-mRFP-FT(鐵融合蛋白)之間的結合而形成。實施例5 納米組裝陣列形成的高通篩選為了檢測和篩選各種生物活性分子之間的相互作用，使用HTS (高通量篩選)系統 (圖 24)。為了建立該系統，將Hela細胞在96-孔板(Greiner bio-one)中培養，然后將 FKBP-mRFP-FT和FRB-EGFP-FT基因同時引入到細胞中并在其中表達。24小時之后，在96 個孔中僅僅選擇12個孔并使用250nM雷帕霉素處理30分鐘，并且通過由于雷帕霉素的FRB 與FKBP之間的相互作用的納米組裝陣列的形成使用In-Cell Analyzer 1000 (GE)高速成像。在96孔板中通過由于雷帕霉素的FRB與FKBP之間的相互作用的納米組裝陣列形成使用In-Cell Analyzer 1000 (GE)檢查(圖25)。在孔中使用250nM雷帕霉素處理30分 鐘，在細胞質中與鐵蛋白融合的FKBP和FRB蛋白彼此相互作用形成納米組裝陣列，相反，在 不使用雷帕霉素處理的孔中，鐵蛋白納米組裝陣列甚至在30分鐘后都沒有形成，并且蛋白 質均勻分布在細胞質中。 使用3. 5%多聚甲醛固定細胞，將細胞核使用Hoechst染色，然后對在96孔板中得 到的納米組裝陣列的形成進行系統分析。使用In-Cell Developer(GE)算法，通過由于雷 帕霉素的FRB與FKBP之間相互作用的納米組裝陣列的形成作為顆粒被識別，并且成像結果 被有效并定量地分析和篩選。在96孔板的每個孔中篩選和定量可使用其中具有形成的納 米組裝陣列的細胞的百分比(％ )或者每個細胞中納米組裝陣列的數目而有效地進行(圖 26)。實施例6 使用專一性突變作為媒介(調節)物質形成的納米組裝陣列上的檢測 分子的相互作用的檢查(1)通過突變的FKBP和FKB之間的相互作用的納米組裝陣列的形成將FKBP蛋白質突變，使納米組裝陣列的形成通過蛋白質之間的結合自發誘導。將FKBP的第36位氨基酸苯丙氨酸替換成甲硫氨酸，使單體FKBP轉變成二聚體形 式。將所述突變FKBP與鐵蛋白融合，并將FKBP (F36M) -mRFP-FT和FRB-EGFP融合蛋白在 Hela細胞中表達以便檢查細胞中納米組裝陣列的自發形成(圖28)。而且，使用250nM雷 帕霉素處理形成的納米組裝陣列。從結果可以看到，納米組裝陣列表面上的FKBP (F36M)與FRB被誘導，并且 FRB-EGFP在10分鐘內迅速被結合并對接或者補充到納米組裝陣列的表面上(圖28)。也 就是說，FKBP通過突變起到媒介(調節)物質的作用，同時起到與FRB(捕獲物)相互作用 的誘餌的作用。另外，為了檢查檢測分子(FKBP(F36M)_FRB)之間的相互作用是否對作為調節相 互作用的雷帕霉素專一，將25 μ M Π(506用作用于FKBP(F36M)與雷帕霉素之間的相互作用 的競爭性化合物。結果，如圖29所示，FRB-EGFP從納米組裝陣列的表面上被拆下。這表明 FKBP (F36M)和FRB的對接過程可被可逆地調節。另外，證實檢測分子FKBP-FRB之間的相互 作用通過媒介(調節)物質雷帕霉素專一性地出現。(2) DFX-DHFR相互作用的檢測以與實驗(1)相同的方式,將重組基因FKBP(F36M)-mRFP-FT和DHFR-mRFT_FT — 起引入到Hela細胞中，然后在細胞中表達鐵融合蛋白。然后，使用ΙΟμΜ MTX-BODIPYiFL 處理細胞。特別是，納米組裝陣列的形成通過FKBP (F36M)突變蛋白被誘導，并且將DHFR蛋 白(誘餌)與鐵融合蛋白連接，使其被暴露到納米組裝陣列的表面，然后在細胞中表達DHFR 蛋白。鐵融合蛋白在細胞中的分布使用熒光顯微鏡進行分析(圖30)。在上述狀態下，使用附著有BODIPY染色的MTX化合物(誘餌)對細胞進行處理， 然后在各個變化的時間點對MTX是否與DHFR結合進行分析。結果，如圖30所示，觀察到在不具有DHFR的納米組裝陣列的情況下，MTX不對接 或者補充到納米組裝陣列上，相反，在其表面上具有DHFR的納米組裝陣列的情況下，MTX化 合物在使用MTX化合物進行處理之后大約1小時結合并對接到納米組裝陣列上。
圖31是顯示在使用MTX化合物處理之后150分鐘時的照片，MTX化合物在細胞中結合并對接到具有DHFR的納米組裝陣列的表面上。測試實施例6-1 依賴于所連接的FKBP (F36M)突變蛋白質數目被誘導而形成的納 米組裝陣列為了優化通過FKBP (F36M)突變-鐵融合蛋白的納米組裝陣列形成的誘導，將連接 的FKBP (F36M)突變蛋白質的數目連續增加到6，同時觀察其表達結果。結果，如圖32所示，當連接的突變蛋白質數目超過2時，在細胞中蛋白質表達后從 12小時開始納米組裝陣列有效形成。但是，當連接的突變蛋白質數目超過4時，突變蛋白的 細胞內表達明顯減少。測試實施例6-2 依賴于連接的FKBP(F36M)突變蛋白質數目和時間被誘導形成的 納米組裝陣列以與測試實施例6-1中相同的方式，將FKBP (F36M)突變蛋白質的數目從1增加到 3，同時將突變蛋白質與鐵蛋白融合以誘導納米組裝陣列自發形成。在各個變化的時間點觀 察形成的模式。結果，如圖33所示，當FKBP(F36M)突變蛋白質的數目為1時，在蛋白質引入Hela 細胞之后36小時納米組裝陣列開始形成，相反，當突變蛋白質的數目為2或3時，納米組裝 陣列在將蛋白質引入到細胞中之后12小時內有效形成。 通過上述測試結果，通過FKBP (F36M)突變-鐵融合蛋白的納米組裝陣列形成的誘 導優化條件可被預見。實施例7 其形成使用專一性化合物與作為媒介(調節)物質的蛋白質之間的相 互作用被誘導的納米組裝陣列上的檢測分子的檢查在該實驗中，將FKBP (野生型)蛋白質用作用于誘導納米組裝陣列形成的物質，同 時將AP1510化合物用作用于介導FKBP蛋白質之間結合的物質。AP1510化合物為Π(506_狀 化合物并且是媒介(調節)物質，其具有能夠與FKBP蛋白質結合并通過連接物彼此連接的 兩種基序，使其可同時與FKBP蛋白質的兩個分子相互作用。將兩種FKBP(野生型)蛋白質連續與鐵蛋白融合并在Hela細胞中表達。將細胞 使用作為FKBP相互作用媒介(調節)物質的1 μ M ΑΡ1510化合物處理，并且通過In-Cell Analyzer 1000 (GE)在1小時內觀察納米組裝陣列的形成(圖35)。在納米組裝陣列形成 被誘導3小時之后，將細胞使用250nM雷帕霉素處理1小時。結果看到，FRB蛋白質(捕獲物)與FKBP相互作用，使其被結合并對接或者補充 到納米組裝陣列的表面上(圖35和37)。這里，FKBP起到通過與AP1510化合物相互作用起到形成納米組裝陣列的媒介(調 節)物質的作用，同時起到與FRB(捕獲物)相互作用的誘餌作用。測試實施例7-1 不受連接的熒光蛋白質種類影響的納米組裝陣列對于在實施例7中mRFP與FKBP蛋白質連接的情況來說，各種熒光蛋白質，例如 ECFP、TagCFP和mTFPl與FKBP蛋白質連接以檢查AP1510對納米組裝陣列形成誘導的效果。將FKBP與鐵蛋白融合，并將三種不同熒光蛋白質連接在FKBP與鐵蛋白之間，然后 在Hela細胞中表達。表達24小時之后，將每個細胞使用1 μ ΜΑΡ1510化合物進行處理。結果，如圖36所示，在TagCFP-mTFPl和mTFPl的情況下納米組裝陣列的形成比通過AP1510化合物的ECFP情況下更有效地被誘導。此外，如圖37所示，觀察到在TagCFP的情況下，當其形成已經被AP1510化合物誘導的納米組裝陣列使用雷帕霉素處理時，FRB蛋 白質(捕獲物)(用于FKBP的伴侶檢測物質)與FKBP相互作用，使其被對接或補充到納米 組裝陣列的表面上。工業實用性如上所述，根據本發明，各種生物活性分子之間的相互作用可通過分析納米組裝 陣列是否通過體內同一場所或系統中生物活性分子之間的相互作用來分析，或者通過分析 生物活性分子是否共同定位在納米組裝陣列上來分析。因此，本發明可被應用到用于體外 和體內檢測“誘餌”與“捕獲物”之間的相互作用的試劑盒或者芯片。雖然已經參照特定特征對本發明進行了詳細描述，對本領域技術人員來說容易想 到的是該描述僅僅用于優選實施方式，而不是限制本發明的范圍。因此，本發明的實際范圍 將由隨附的權利要求書及其等同物來限定。
權利要求
一種測定分子相互作用的方法，包括下列步驟(i)將納米組裝陣列形成物質、誘餌和捕獲物提供到同一場合或者系統；(ii)通過誘餌與捕獲物之間的相互作用形成納米組裝陣列；以及(iii)檢查納米組裝陣列是否形成，由此測定誘餌-捕獲物相互作用。
2.根據權利要求1的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述誘餌與捕獲物之間 的相互作用在步驟(i)中直接或間接發生。
3.根據權利要求1的測定分子相互作用的方法，其特征在于，能夠介導或調節誘餌與 捕獲物之間相互作用的物質在步驟(i)中另外被添加。
4.根據權利要求1的測定分子相互作用的方法，其特征在于，誘餌與捕獲物分別以結 合有標記物的方式被提供。
5.根據權利要求3的測定分子相互作用的方法，其特征在于，能夠介導或調節誘餌與 捕獲物之間的相互作用的物質以結合有標記物的狀態被提供。
6.一種測定分子相互作用的方法，包括下列步驟(i)將媒介(調節)物質和結合有誘餌的納米組裝陣列提供到同一場合或系統；( )通過媒介物質之間的相互作用形成納米組裝陣列；(iii)將捕獲物提供給形成的納米組裝陣列；以及(iv)通過與在形成的納米組裝陣列上存在的誘餌的相互作用測定捕獲物的結合位置 以便確定捕獲物是否與誘餌共同定位，由此測定誘餌_捕獲物分子相互作用。
7.一種測定分子相互作用的方法，包括下列步驟(i)將結合有第一媒介(調節)物質的納米裝配陣列形成物質和結合有第二媒介(調 節)物質的誘餌提供到同一場合或系統；( )通過第一媒介(調節)物質之間的相互作用形成納米組裝陣列，并通過第二媒介 物質之間的相互作用將誘餌結合到形成的納米組裝陣列上；(iii)將捕獲物提供到形成的納米組裝陣列上；以及(iv)通過與結合到形成的納米組裝陣列上的誘餌的相互作用測定捕獲物的結合位置 以便確定捕獲物是否與誘餌共同定位，由此測定誘餌_捕獲物相互作用。
8.根據權利要求6或7的測定分子相互作用的方法，其特征在于，介導或調節媒介(調 節)物質之間的相互作用的物質在步驟(ii)中另外被添加。
9.根據權利要求6或7的測定分子相互作用的方法，其特征在于，介導或調節誘餌與捕 獲物之間的相互作用的物質在步驟(iv)中另外被加入。
10.根據權利要求6或7的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述誘餌、捕獲物和 媒介(調節)物質的每種以其中結合有標記物的狀態被提供。
11.根據權利要求1、6或7任意之一的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述誘 餌、捕獲物和/或媒介(調節)物質為生物活性分子。
12.根據權利要求11的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述生物活性物質選 自下組，包括核酸、核苷酸、蛋白質、縮氨酸、氨基酸、多糖、脂類、維生素和化學化合物。
13.根據權利要求1、6或7任意之一的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述納 米組裝陣列形成物質是具有多種相同或不同結合基序并可通過它們之間的相互作用或者 自組裝形成陣列的物質。
14.根據權利要求13的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述通過自組裝形成 納米組裝陣列的物質選自下組，包括鐵蛋白、鐵蛋白狀蛋白質、磁小體蛋白、病毒蛋白、金納 米粒子、量子點和磁納米粒子。
15.根據權利要求4或5的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述標記物為放射 性標記物、熒光物質或者發光物質。
16.根據權利要求15的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述熒光物質為熒光 染料，四_半胱氨酸基序、熒光蛋白或者熒光納米粒子。
17.根據權利要求10的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述標記物為放射性 標記物、熒光物質和發光物質。
18.根據權利要求17的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述熒光材料為熒光 染料，四_半胱氨酸基序、熒光蛋白或者熒光納米粒子。
19.根據權利要求1、6或7任意之一的測定分子相互作用的方法，其特征在于，其在細 胞、組織或器官中進行。
20.根據權利要求19的測定分子相互作用的方法，其特征在于，所述細胞、組織或器官 選自下組，包括斑馬魚、線蟲、酵母菌，蒼蠅或青蛙、哺乳動物(除人以外)和植物。
21.根據權利要求19的測定分子相互作用的方法，其特征在于，引入細胞、組織或器官 中通過使用選自下組的任何一種進行，包括跨膜肽(或者融合肽)、脂類(或者脂質體)基 因轉運體或其結合復合物；電轉化或者磁轉染。
22.根據權利要求1、6或7任意之一的測定分子相互作用的方法，其特征在于，納米 組裝陣列形成使用下組的任何一種進行檢查，包括光學儀器、掃描儀、放射性標記物檢測裝 置、熒光偏振閱讀儀(FP閱讀儀)、分光光度計、MRI (核磁共振成像)、SQUID、磁共振測量儀、 熒光探測儀，發光探測儀。
23.根據權利要求1、6或7任意之一的測定分子相互作用的方法，其特征在于，通過與 誘餌相互作用的捕獲物的結合位置使用選自下組的任何一種進行測定，包括光學儀器、掃 描儀、放射性標記物檢測裝置、熒光偏振閱讀儀(FP閱讀儀)、分光光度計、MRI (核磁共振成 像)、SQUID、磁共振測量儀、熒光探測儀、發光探測儀。
24.一種測定與誘餌相互作用的目標捕獲物的方法，所述方法包括下列步驟(i)將納米組裝陣列形成物質、誘餌和捕獲物文庫提供到同一場合或者系統；(ii)通過誘餌文庫與捕獲物文庫之間的相互作用形成納米組裝陣列；(iii)檢查納米組裝陣列是否形成，由此測定誘餌-捕獲物相互作用；以及(iv)選擇、分離和識別與誘餌相互作用形成納米組裝陣列的目標捕獲物。
25.一種測定與誘餌相互作用的目標捕獲物的方法，該方法包括下列步驟(i)將媒介(調節)物質和結合有誘餌的納米組裝陣列提供到同一場合或系統；(ii)通過媒介(調節)物質之間的相互作用形成納米組裝陣列；(iii)將捕獲物文庫提供給形成的納米組裝陣列；(iv)通過與在形成的納米組裝陣列上存在的誘餌的相互作用測定捕獲物的結合位置 以便測定捕獲物是否與誘餌共同定位，由此測定誘餌-捕獲物相互作用；以及(v)選擇、分離和識別與誘餌相互作用以便與納米組裝陣列上的誘餌共同定位的目標 捕獲物。
26.一種測定與誘餌相互作用的目標捕獲物的方法，該方法包括下列步驟(i)將結合有第一媒介(調節)物質的納米裝配陣列形成物質和結合有第二媒介(調 節)物質的誘餌提供到同一場合或系統；(ii)通過第一媒介(調節)物質之間的相互作用形成納米組裝陣列，并通過第二媒介 (調節)物質之間的相互作用將誘餌結合到形成的納米組裝陣列上；(iii)將捕獲物文庫提供到形成的納米組裝陣列上；(iv)通過與結合到形成的納米組裝陣列上的誘餌的相互作用測定捕獲物的結合位置 以便確定捕獲物是否與誘餌共同定位，由此測定相互作用；以及(v)選擇、分離和識別與誘餌相互作用以便與納米組裝陣列上的誘餌共同定位的目標 捕獲物。
27.根據權利要求24的測定與誘餌相互作用的目標捕獲物的方法，其特征在于，所述 誘餌與捕獲物之間的相互作用在步驟(i)中直接或間接發生。
28.根據權利要求24測定與誘餌相互作用的目標捕獲物的方法，其特征在于，介導或 調節誘餌與捕獲物之間的物質在步驟(ii)中另外被添加。
29.根據權利要求25或26的測定與誘餌相互作用的目標捕獲物的方法，其特征在于， 能夠介導或調節誘餌與捕獲物之間的物質在步驟(ii)中另外被添加。
30.根據權利要求25或26的測定與誘餌相互作用的目標捕獲物的方法，其特征在于， 介導或調節誘餌與捕獲物之間的相互作用的物質在步驟(iv)中另外被添加。
31.根據權利要求24、25或26任意之一的測定與誘餌相互作用的目標捕獲物的方法， 其特征在于，所述誘餌、捕獲物以及媒介(調節)物質的每一種都以其中結合有標記物的方 式提供。
32.一種用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌與捕獲物之間的相互作用的目標 分子的方法，所述方法包括下列步驟(i)將納米組裝陣列形成物質、誘餌以及捕獲物提供到同一場合或者系統；(ii)在目標候選物的存在下通過誘餌與捕獲物之間的相互作用形成納米組裝陣列；(iii)將捕獲物提供到形成的納米組裝陣列；以及(iv)選擇與在目標候選物不存在下誘餌與捕獲物共同定位的程度相比，在目標候選物 存在下誘餌與捕獲物共同定位的程度被阻斷(抑制)或者活化(誘導)的情況對應的目標 候選物作為目標阻斷劑分子或者目標活化劑分子。
33.一種用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌與捕獲物之間的相互作用的目標 分子的方法，所述方法包括下列步驟(i)將媒介(調節)物質和誘餌結合到納米組裝陣列形成物質并將這些物質提供到同 一場合或者系統；(ii)在目標候選物的存在下通過媒介(調節)物質之間的相互作用形成納米組裝陣列；(iii)將捕獲物提供到形成的納米組裝陣列；以及(iv)選擇與在目標候選物不存在下誘餌與捕獲物共同定位的程度相比，在目標候選物 存在下誘餌與捕獲物共同定位的程度被阻斷(抑制)或者活化(誘導)的情況對應的目標 候選物作為目標阻斷劑分子或者目標活化劑分子。
34.一種用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌與捕獲物之間的相互作用的目標 分子的方法，所述方法包括下列步驟(i)將結合有第一媒介(調節)物質的納米組裝陣列形成物質和結合有第二媒介(調 節)物質的誘餌提供到同一場合或者系統；(ii)在目標候選物的存在下通過第一媒介(調節)物質之間的相互作用形成納米組裝 陣列，并通過第二媒介(調節)物質之間的相互作用將誘餌結合到形成的納米組裝陣列；(iii)將捕獲物提供到形成的納米組裝陣列；以及(iv)選擇與在目標候選物不存在下誘餌與捕獲物共同定位的程度相比，在目標候選物 存在下誘餌與捕獲物共同定位的程度被阻斷(抑制)或者活化(誘導)的情況對應的目標 候選物作為目標阻斷劑分子或者目標活化劑分子。
35.根據權利要求32的用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌與捕獲物之間的相 互作用的目標分子的方法，其特征在于，所述誘餌與捕獲物之間的相互作用在步驟(i)中 直接或間接發生。
36.根據權利要求32的用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌與捕獲物之間的相 互作用的目標分子的方法，其特征在于，介導或調節誘餌與捕獲物之間的物質在步驟(ii) 中另外被添加。
37.根據權利要求33或34的用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌與捕獲物之 間的相互作用的目標分子的方法，其特征在于，介導或調節媒介(調節)物質之間的相互作 用的物質在步驟(ii)中另外被添加。
38.根據權利要求33或34的用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌與捕獲物之 間的相互作用的目標分子的方法，其特征在于，介導或調節誘餌與捕獲物之間的相互作用 的物質在步驟(iv)中另外被添加。
39.根據權利要求32、33或34任意之一的用于測定阻斷(抑制)或活化(誘導)誘餌 與捕獲物之間的相互作用的目標分子的方法，其特征在于，所述誘餌、捕獲物以及媒介(調 節)物質分別以其中結合有標記物的方式提供。
全文摘要
本發明涉及動態測定細胞中各種物質包括生物活性分子之間的相互作用的方法以及測定目標分子的方法。更具體地說，本發明涉及動態測定誘餌-捕獲物相互作用的方法和容易測定阻斷或活化相互作用的目標分子的方法，所述方法包括允許能夠形成納米組裝陣列的物質、誘餌和捕獲物彼此相互作用，并分析在體外或體內納米組裝陣列是否通過誘餌與捕獲物之間的相互作用形成；或者允許能夠形成納米組裝陣列的物質、誘餌和捕獲物彼此相互作用，包括通過媒介(調節)物質在體外或體內形成納米組裝陣列，然后分析捕獲物與誘餌是否共同定位在納米組裝陣列上。
文檔編號G01N33/53GK101821622SQ200880102782
公開日2010年9月1日 申請日期2008年8月14日 優先權日2007年8月17日
發明者何宰石, 李京侯, 李承久, 李相奎, 金太國 申請人:韓國科學技術院;韓國生命工學研究院