蛔蟲糞抗原檢測的制作方法

專利名稱：蛔蟲糞抗原檢測的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測動物中的蛔蟲(roundworm)的組合物、裝置、試劑盒和方法。 更具體地，本發明涉及用于檢測糞便樣品中是否存在蛔蟲的組合物、裝置、試劑盒和方法。 甚至更具體地，本發明涉及用于檢測糞便樣品中是否存在蛔蟲抗原的抗體組合物、裝置、試 劑盒、和方法，所述糞便樣品可能還包括一種或多種鉤蟲(hookworm)、鞭蟲(whipworm)、和 犬心蟲(heartworm)抗原。

背景技術：
腸蛔蟲感染在動物中是常見的，并且如果放任不進行治療，能引起嚴重的疾病，甚 至死亡。雖然診斷感染蛔蟲的動物為患有一些類型的寄生蠕蟲(worm)(腸蟲(helminth)) 感染是相對容易的，但是鑒定蛔蟲具體為致病蠕蟲是顯著更困難的。這是一個難題，因為在 受感染動物的護理人員具有蛔蟲是感染的特定來源的知識時，蛔蟲感染是最好治療的。例 如，此類知識容許護理人員用對蛔蟲有最佳效力的藥物治療動物，因此避免使用通常有效 針對寄生蟲感染、但對蛔蟲不具最佳效果的藥物或藥物混合物。 用于診斷蛔蟲感染的當前方法主要涉及對糞便樣品的顯微鏡檢查，其或是直接在 糞便涂片中或是在通過密度介質中的浮選來濃縮卵和寄生物后進行。盡管此規程被高度采 用，但是該方法具有顯著的缺點。這些顯微術方法是費時的，要求專門的儀器，并且具有低 的特異性。另外，這些方法的結果的準確性高度依賴于操作人員的技術和專長。
—般而言，也可以如下在分子水平進行分類學區別，即測定動物中是否存在針對 特定蠕蟲物種或規定的蠕蟲物種組的一種或多種抗體的一種或多種抗原。例如，Hill等 (Veterinary Parasitology (1997)，第68巻，第91頁-第102頁)披露了一種酶聯免疫 吸附測定法(ELISA)測試，其用于在來自豬動物的血清中檢測對鞭蟲特異性的抗體。雖 然Hill等的測試不與來自感染有蛔蟲或鉤蟲的豬的血清起交叉反應，但是尚未確定該 測試是否與來自感染有犬心蟲的豬的血清起交叉反應。類似地，Yamasaki等(J.Clin. Microbiology (2000)，第38巻，第1409頁-第1413頁)披露了 一種ELISA測試，其利用 重組蛔蟲抗原來檢測人血清中對蛔蟲特異性的抗體。盡管Yamasaki等的測定法已經顯 示了不與鉤蟲或犬心蟲起交叉反應，但是尚未確定其是否與鞭蟲起交叉反應。Bungiro和 C即pello(A. J. Trop. Med. Hyg. (2005)，第73巻，第915頁-第920頁)披露了一種ELISA 以檢測實驗倉鼠模型系統中由鉤蟲斯里蘭卡鉤口線蟲(Ancylostoma ceylanicum)引起的 感染，但是尚未確定他們的測試是否還與蛔蟲、鞭蟲和犬心蟲中的一種或多種起交叉反應。
臨床醫生對使用這些測定法來診斷感染蠕蟲的動物顯示出很少的興趣。尚不采用 這些測定法的一個原因在于研究人員尚未證明它們中的任一種能夠特異性檢測特定類型 的蠕蟲而排除所有其它主要類型的蠕蟲。例如，還沒有人開發出如下測定法，其特異性檢測 蛔蟲，而且還已經顯示出不與鉤蟲、鞭蟲和犬心蟲起交叉反應。這種沒有將動物的感染指向 單一來源的能力會造成診斷的不確定，因此可能會導致次佳治療的施用。
此外，這些測定法中的一些僅已經顯示出對于檢測血清樣品中的抗原或抗體是有 用的。這是限制性的，因為從患病動物獲得血清樣品經常是不切實際的或者是困難的。例如，在不配合的動物的情況中，為了抽取血液的目的而使動物穩定可能是有困難的，而在生 病嚴重的動物的情況中，為了相同目的而將動物運輸至臨床醫生的診所可能是不切實際 的。因此，使用如下動物材料能更好地實施測試是否存在特定的蠕蟲類型，所述動物材料能 容易獲得，而且不需要運輸動物，諸如糞便。存在于糞便樣品中的抗原稱為糞抗原。在作為 本發明主題的寄生蟲抗原的情況中，糞抗原是存在于宿主動物的糞便樣品中的蠕蟲抗原。
這些測定法中的一些的另一項固有限制在于它們涉及特定重組抗原的生成和純 化。具體地，由于生成和純化此類抗原所需要的步驟可以是昂貴且費時的，所以這是限制性 的。 因此所需要的是用于檢測糞便樣品中是否存在蛔蟲的組合物、裝置、試劑盒和方 法。所需要的組合物、裝置、試劑盒、和方法應當進一步能夠特異性檢測糞便樣品中是否存 在蛔蟲，所述糞便樣品含有鉤蟲、鞭蟲、和犬心蟲中的一種或多種。
發明概述 本發明部分基于出乎意料的多克隆抗體特性的發現。具體地，確定了可以使用針 對整條蛔蟲提取物、蛔蟲生殖道提取物、或蛔蟲腸道提取物制備的多克隆抗體來捕捉哺乳 動物中的蛔蟲糞抗原和檢測哺乳動物中是否存在蛔蟲糞抗原，所述哺乳動物寄生有鞭蟲、 犬心蟲和鉤蟲之一種或多種。這種對蛔蟲的特異性是令人驚訝的，因為蛔蟲、鞭蟲、犬心蟲 和鉤蟲均是相關的線蟲(nematodes)，并且預期針對這些蠕蟲之任一種的全部提取物、蛔蟲 生殖道提取物、或蛔蟲腸道提取物制備的多克隆抗體會與其它蠕蟲、宿主抗原、或其它糞便 成分之一種或多種起交叉反應。本發明包括如下測定條件，在該測定條件下可以使用本發 明的抗體來特異性捕捉哺乳動物中的蛔蟲糞抗原和檢測哺乳動物中是否存在蛔蟲糞抗原， 所述哺乳動物可能還寄生有鞭蟲、犬心蟲和鉤蟲之一種或多種。 —方面，本發明是用于檢測哺乳動物(諸如例如犬、貓、牛、或人)的糞便樣品中是 否存在蛔蟲的裝置。本發明進一步提供了一種用于檢測哺乳動物的糞便樣品中是否存在蛔 蟲的裝置，所述哺乳動物可能還感染有鉤蟲、鞭蟲、和犬心蟲之一種或多種。在本發明的一 方面，所述裝置包括固體支持物，其中對一種或多種蛔蟲抗原特異性的一種或多種多克隆 抗體被固定化在固體支持物上。 在本發明的某些方面，本發明的裝置包括側流免疫測定法裝置。在本發明的其它 方面，本發明的裝置包括ELISA裝置。 本發明還包括抗體和抗體組合物。更具體地，本發明涉及能夠特異性結合哺乳動 物中的蛔蟲糞抗原的多克隆抗體，所述哺乳動物可能還感染有鉤蟲、鞭蟲或犬心蟲之一種 或多種。本發明的抗體基本上不結合糞便樣品中的鉤蟲、鞭蟲或犬心蟲抗原。本發明進一 步包括生產此類抗體的方法。 本發明還是一種檢測糞便樣品中是否存在蛔蟲的方法。該方法包括使糞便樣品與 所述抗體接觸，并捕捉該糞便樣品中的蛔蟲糞抗原和檢測該糞便樣品中是否存在蛔蟲糞抗 原。檢測步驟可以包括檢測是否存在抗原/抗體復合物。所述方法可以進一步涉及提供其 能與抗原/抗體復合物中的抗原結合的第二抗體。 本發明進一步包括用于在自哺乳動物獲得的糞便樣品中檢測蛔蟲糞抗原的測定 試劑盒。因此試劑盒可以包括本發明的一種或多種組合物和/或裝置。例如，所述試劑盒 可以包括抗蛔蟲抗體和用于測定所述抗體與樣品中的蛔蟲抗原的結合的手段。在一個具體的例子中，此類試劑盒包括具有固定化的抗蛔蟲抗體的裝置、一種或多種抗原捕捉試劑 (例如非固定化的經標記抗原捕捉試劑和固定化的抗原捕捉試劑)和清洗試劑，以及檢測 劑試劑及陽性和陰性對照試劑(若想要或適當的話)。此類測試試劑盒中可以包括其它成 分諸如緩沖液、對照、等等。試劑盒可以進一步包括關于實施本發明的一種或多種方法的說 明書，包括關于使用與試劑盒一起包括在內的本發明的任何裝置的說明書。
附圖簡述

圖1A顯示了本發明的多孔板裝置。 圖1B顯示了圖1A板的單孔的近視圖及其固定化的抗體的例示。 圖2顯示了第一項實驗中通過遵循本發明的方法從犬糞便樣品獲得的光密度
(0D)值的圖。 圖3顯示了第二項實驗中通過遵循本發明的方法從犬糞便樣品獲得的0D值的圖。
圖4顯示了第三項實驗中通過遵循本發明的方法從犬糞便樣品獲得的0D值的圖。
圖5顯示了第四項實驗中通過遵循本發明的方法從貓糞便樣品獲得的OD值的第 一幅圖。 圖6顯示了第四項實驗中通過遵循本發明的方法從貓糞便樣品獲得的0D值的第 二幅圖。 圖7顯示了第五項實驗中通過遵循本發明的方法從犬糞便樣品獲得的0D值的第 一幅圖。 圖8顯示了第五項實驗中通過遵循本發明的方法從犬糞便樣品獲得的0D值的第 二幅圖。 發明詳述 —方面，本發明是用于在哺乳動物(諸如例如犬、貓、牛、或人)中檢測腸蛔蟲感染 的裝置。該裝置安排成幫助檢測來自哺乳動物的糞便樣品中是否存在蛔蟲糞抗原，所述哺 乳動物可能還感染有鉤蟲、鞭蟲、和犬心蟲之一種或多種。在本發明的一方面，所述裝置包 括固體支持物，其中針對整條蛔蟲提取物、蛔蟲生殖道提取物、和/或蛔蟲腸道提取物制備 的、且對一種或多種蛔蟲抗原特異性的一種或多種多克隆抗體被固定化在所述固體支持物 上。所述固體支持物可以是例如側流裝置中的板或基片。 如圖1A和1B中所顯示的，本發明的裝置是例如多孔板IO，其包括多個孔12。每 個孔12提供固體支持物14，用于在其上固定化對蛔蟲特異性的多克隆抗體16。板10可以 是Immulon 1B 96孔板，但是不限于此。或者，所述裝置可以是側流測定法，諸如記載于美 國專利5， 726,010的。 如下生成在固體支持物14上固定化的多克隆抗體16(—般稱作"抗弓首線蟲 (Toxocara)pAB")，即給動物(諸如例如家兔)施用弓首線蟲物種的整條提取物或弓首線 蟲物種的一部分(諸如整個或部分生殖道或整個或部分腸道)的提取物，自該動物收集血 清，并純化抗弓首線蟲pAB。具體地，通過物理吸附將抗弓首線蟲pAB固定化至板10的孔 12的固體支持物14上。實施抗弓首線蟲pAB在固體支持物14上的固定化以使得抗弓首線 蟲pAB不會被可能實施的任何規程洗掉，而且使得在實施本發明的方法時糞便樣品中的抗 原與抗弓首線蟲PAB的特異性結合不受固體支持物14或其它裝置表面妨礙。本發明的裝 置10適合于通過本發明的方法來檢測蛔蟲抗原，這可以包括實施ELISA測定法。
7
可以使用本發明的方法來檢測樣品中的一種或多種蛔蟲抗原。本發明的方法中所 使用的測試樣品是糞便樣品。可以使用本發明的方法來測試來自任何哺乳動物(諸如例如 犬、貓、牛、或人)的糞便樣品。 可以與本發明的方法一起使用本發明的裝置IO(其包括在固體支持物14上固定 化的抗弓首線蟲pAB)以檢測糞便樣品中的蛔蟲。具體地，可以通過用被固定化在裝置IO 的固體支持物14上的抗弓首線蟲pAB檢測一種或多種蛔蟲糞抗原來診斷動物的活動性蛔 蟲感染。"蛔蟲糞抗原"指糞便樣品中存在的能特異性且穩定地結合抗弓首線蟲pAB的任何 蛔蟲成分。因此，蛔蟲糞抗原可以是整條蛔蟲、蛔蟲卵、蛔蟲碎片、自蛔蟲分泌、排泄或脫落 的產物或其組合。"對...特異性的"或"穩定結合"意味著抗弓首線蟲pAB以比對其它糞抗原(例
如，來自非蛔蟲寄生蟲的糞抗原)更大的親和力識別和結合蛔蟲糞抗原。可以使用本領域
中公知的方法(例如，ELISA或放射性免疫測定法(RIA))來測試結合特異性。在本發明的
方法中，通過ELISA檢測蛔蟲抗原。以下有本發明的ELISA方法的一個具體的實施例。雖
然參照具體的ELISA方法描述了本發明，然而要理解的是，本領域普通技術人員會認識到
備選的、別的或代替的ELISA步驟可以在不背離基本目的的前提下使用。 參照兩個實施例(它們一起包括5次實驗)明確描述了本發明的方法；然而，其不
應解釋為局限于此。 實施例A 使用以下材料和方法來產生下文所描述的實驗1、2、3、和4中所描述的數據。
多克隆抗體制備。在家兔中針對整條蛔蟲(犬弓首線蟲(Toxocara canis))提取 物制備多克隆抗體"抗弓首線蟲pAB" (IgG) (Antibody Systems Inc. ， Hurst， Fexas)，并通 過使用標準方法自血清純化。簡言之，如下制備破裂的整條蛔蟲的提取物，即自受感染的犬 科動物收獲蛔蟲，清洗它們，并將它們在溶液中重懸。然后通過組織均漿化來破壞所重懸的 蠕蟲，通過離心來沉淀，并在溶液中重懸。給家兔施用此重懸液，并自經免疫接種的家兔收 集血清。如下自經免疫接種的家兔的血漿純化抗弓首線蟲pAB，即通過蛋白G親和層析分離 IgG抗體。 犬科和貓科動物的感染和抗腸蟲處理。對于所有四項實驗，通過給健康犬或貓口 服施用約150-300顆蛔蟲(弓首線蟲)、鉤蟲(犬鉤口線蟲(Ancylostoma cani咖))、或鞭蟲 (狐鞭蟲(Trichuris vulpis))的遮掩卵(larvatedcgg)來實現寄生線蟲感染。(具體地， 犬弓首線蟲是給犬施用的蛔蟲，而貓弓首線蟲(Toxocara cati)是給貓施用的蛔蟲。)對 于實驗2，從已知天然感染有犬心蟲(犬惡絲蟲(Dirofilaria immitis))的犬收集糞便樣 品。此夕卜，僅對于實驗3和實驗4，用Interceptor⑧(其是可購自Novartis Animal Health Inc. (Basel, Switzerland)的驅腸蟲藥)依照制造商的方案在感染后第91天時處理犬，而 在感染后第56天時處理貓。本領域普通技術人員公知的是，Interceptor⑧對于從犬科和貓 科動物除去蛔蟲、鉤蟲、鞭蟲和犬心蟲是有效的。通過在自這些犬科和貓科動物獲得的糞便 樣品中顯微鏡觀察蠕蟲卵來證實感染。認為產生通過顯微鏡檢查發現無蠕蟲卵的糞便樣品 的犬和貓是未受感染的。 犬和貓糞便樣品制備。已知無寄生蟲感染或者要用蛔蟲、鉤蟲、鞭蟲或犬心蟲之一
感染的犬科和貓科動物提供糞便樣品的來源。將來自新鮮的、未防腐處理的犬或貓糞便樣品的樣品(約1克)在4ml稀釋劑溶液("稀釋劑溶液"是O. 05M Tris堿；lmM EDTA ;0. 45%Kathon ;16mg/ml硫酸慶大霉素；0. 05% Tween-20 ;40%胎牛血清；10%家兔血清；和5%小鼠血清)中懸浮。以4000rpm離心懸浮液達20分鐘以產生第一上清液。以12000rpm離心第一上清液達5分鐘以產生第二上清液，其在本文中稱為"糞便提取物"。
ELISA測定法。通過物理吸附在Immulon IB 96孔板上于4°C固定化純化的抗弓首線蟲pAB(5ii g/ml ;100 ii 1/孔)過夜。然后用0. 1M Tris pH 7. 0中的1% BSA于4。C封閉板過夜，接著于室溫干燥。將約100 iU糞便提取物添加至每孔，并容許于室溫溫育1小時。依照本領域普通技術人員已知的標準方法用PBS-Tween-20溶液清洗各孔5次。如下用辣根過氧化物酶(HRP)標記游離的抗弓首線蟲pAB，即使用交聯劑琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)來產生偶聯物，并將10 ii g/ml此偶聯物添加至96孔板的每孔。于室溫的30分鐘溫育期后，依照本領域普通技術人員已知的標準方法使用PBS-Tween-20溶液自各孔清洗未結合的偶聯物。然后將50 y 1 TMBLUE⑧過氧化物酶底物(SeraCare Life Sciences, West Bridgewater， MA)添加至每孔，并于室溫溫育板達10分鐘。10分鐘溫育期后用0. 1%十二烷基硫酸鈉(SDS)停止每個酶促反應后，通過使用ELISA讀板儀進行的標準分光光度法技術于A650測量96孔板中每孔的光密度(OD)值。在此安排中，為96孔板的任何特定孔獲得的OD值與該孔中存在的特異性結合的抗原量成正比。 實驗1 :抗弓首線蟲pAB在犬糞便樣品中特異性結合蛔蟲，但沒有特異性結合鉤蟲或鞭蟲。 實驗1的目的是確定抗弓首線蟲pAB是否特異性結合犬中的蛔蟲、鉤蟲、和/或鞭蟲的糞抗原。圖2中顯示了實驗1中所獲得的20份犬糞便樣品的0D測定。具體地，這些糞便樣品自如下犬科動物獲得5只已知無寄生蟲感染的犬科動物(陰LCZ5d62、陰RCZ5d87、陰SBY5d62、陰SVY5d62、和陰TIY5d62) 、5只已知感染有蛔蟲的犬科動物(蛔+鼎25(162、蛔+QKZ5d62j| +RYZ d62、蛔+5 丫5(169、和蛔+WHY5d62) 、5只已知感染有鉤蟲的犬科動物(鉤+1^丫5(162、鉤+06丫5(162、鉤+服丫5(162、鉤+51 5(162、和鉤+SXZ5d62)、和5只已知感染有鞭蟲的犬科動物(鞭+KXZ5d87、鞭+REY5d85、鞭+RQZ5d85、鞭+SEZ d85、和鞭+TGZ d85)。感染后第62天("d62")、第69天("d69")、第85天("d85")、或第87天("d87")時獲得糞便樣品。為每只特定的犬科動物選擇的具體的感染后天數基于蠕蟲卵排出量處于或接近峰水平的天數，如通過顯微鏡檢查所測定的。 未感染的、受鉤蟲感染的、和受鞭蟲感染的樣品所測量的平均OD分別是0. 091、
0. 099、和0. 172 (這些樣品之每份所測量的OD均小于0. 25)，指明抗弓首線蟲pAB沒有特異性結合任何這些樣品中的抗原。相反地，來自受蛔蟲感染的犬的糞便樣品的平均OD是
1. 40，其比為受鞭蟲感染的樣品獲得的平均OD高約8倍，并且比為未感染的和受鉤蟲感染的樣品兩者獲得的平均OD高約15倍。這些數據指明抗弓首線蟲pAB特異性結合一種或多種蛔蟲抗原，但沒有特異性結合任何鉤蟲或鞭蟲糞抗原。 實驗2 :抗弓首線蟲pAB沒有特異性結合犬糞便樣品中的犬心蟲。
實驗2的目的是確定抗弓首線蟲pAB是否特異性結合犬心蟲糞抗原。圖3中顯示了第2項實驗中所獲得的25份犬糞便樣品的OD測定。具體地，圖3顯示了作為測試來自如下犬科動物的糞便樣品的結果獲得的數據3只已知無寄生蟲感染的犬科動物(陰ILS
911、陰ILS 12、和陰ILS 13) 、7只已知天然感染有犬心蟲的犬科動物(陰TRS 403、陰TRS404、陰TRS 405、陰TRS 406、陰TRS 583、陰TRS 749、和陰TRS 868) 、 11只已知感染有蛔蟲的犬科動物(蛔+ILS 10、蛔+ILS 18、蛔+ILS 20、蛔+ILS 22、蛔+ILS 29、蛔+ILS 32、蛔+ILS36J|+ILS 38、蛔+ILS 41、蛔+ILS 67、和蛔+ILS 51) 、2只已知感染有鉤蟲的犬科動物(鉤+ILS 9和鉤+ILS 23)、和2只已知感染有鞭蟲的犬科動物(鞭+ILS 34和鞭+ILS39)。 未感染的、受犬心蟲感染的、受鉤蟲感染的、和受鞭蟲感染的樣品的平均OD分別是0. 058、0. 061、0. 074、和0. 074 (這些樣品之每份所測量的OD均是0. 101或更小)，指明
抗弓首線蟲pAB沒有特異性結合任何這些樣品中的抗原。相反地，來自受蛔蟲感染的犬的
糞便樣品的平均OD是0. 599，其比未感染的和受犬心蟲感染的樣品中所測量的平均OD高
約10倍，并且比受鞭蟲感染的樣品和受鉤蟲感染的樣品的平均0D高約8倍。在進一步證
實抗弓首線蟲pAB特異性結合一種或多種蛔蟲抗原但沒有特異性結合任何鉤蟲或鞭蟲糞
抗原外，此第2項實驗證明抗弓首線蟲pAB沒有特異性結合任何犬心蟲糞抗原。 實驗3 :抗弓首線蟲pAB僅在犬科動物患有活動性蛔蟲感染時在來自該動物的糞
便中檢測出蛔蟲。 —旦確定抗弓首線蟲pAB特異性結合蛔蟲，但沒有特異性結合鉤蟲、鞭蟲或犬心蟲，實施實驗3以確定抗弓首線蟲pAB是否僅在合適的時間(即僅在宿主動物患有活動性蛔蟲感染時)才檢測出蛔蟲。為此目的，自實驗1和實驗2中所描述的所有未感染的犬和受蛔蟲感染的犬獲得ELISA數據。具體地，在感染前l天(及感染后第23天、第31天、第38天、第44天、第48天、第52天、第93天、和第105天時自所有或一些這些受蛔蟲感染的動物獲得糞便樣品，并自所述糞便樣品產生數據。對這些糞便樣品的顯微鏡檢查指明，第38天、第44天、第48天、第52天、和第93天但不是第_1天、第23天、第31天、和第105天時獲得的樣品基本上感染有蛔蟲卵。(第23天和第31天時缺乏實質數目的蛔蟲卵與蛔蟲在犬中的生活周期一致。即，本領域中公知的是，口服施用的蠕蟲卵不以實質數目在犬糞便材料中顯示，直至引入后約l個月。此外，預期第105天時缺乏實質數目的蛔蟲卵是由于第91天時施用的驅腸蟲藥處理。) 如圖4中所顯示的，僅在顯微術確定基本上感染有蛔蟲卵的糞便樣品中(即，僅在第38天、第44天、第48天、第52天、和第93天時獲得的樣品中)通過本發明的方法檢測出蛔蟲。具體地，在第-1天、第23天、第31天、和第105天之每一天從來自受蛔蟲感染的犬的糞便樣品(以顯微術確定其基本上無蛔蟲卵)產生的平均OD值小于0. 180。在第38天、第44天、第48天、第52天、和第93天之每一天從來自受蛔蟲感染的犬的糞便樣品產生的平均OD值是1. 316、 1. 842、 1. 896、2. 295、 1. 104，其表示在OD方面比無卵樣品升高約6倍至約12倍的范圍。 因此實驗3指明，抗弓首線蟲pAB僅在宿主動物患有活動性蛔蟲感染時才特異性結合蛔蟲糞抗原。 實驗4:抗弓首線蟲pAB特異性結合貓糞便樣品中的蛔蟲糞抗原，并且僅在從其中獲得該樣品的貓患有活動性蛔蟲感染時才如此。 實驗4的目的是確定抗弓首線蟲pAB是否特異性結合貓中的蛔蟲糞抗原。 圖5和圖6中分別顯示了為自未感染的貓和受蛔蟲感染的貓獲得的糞便樣品測量的0D值。具體地，圖5顯示了 75天過程里使用來自未感染貓的糞便樣品測量的平均OD值(和標準偏差)。(圖5中所顯示的每個OD值是6次分開的ELISA反應中自同一糞便樣品獲得的6個0D值的平均值。)對于第-l天(即，向受鉤蟲感染的動物施用鉤蟲感染前l天)和第54天及對于其間選定的天數，顯示了來自相同的6只未感染貓(其被稱作C081-N、C098-N、 C118-N、 C091-N、 C097-N、和C106-N)的數據。此外，對于第60天、第68天和第74天之每一天也顯示了來自這6只貓中的3只，即C081-N、 C098-N和C118-N的數據。
圖6顯示了 78天過程里使用自受鉤蟲感染的貓采集的糞便樣品產生的平均OD值(和標準偏差)。(圖6中所顯示的每個OD值是6次分開的ELISA反應中自同一糞便樣品產生的6個OD值的平均值。)對于第-1天(即，向動物施用蛔蟲感染前1天)和第54天及對于其間的選定天數，顯示了來自相同的6只貓科動物(其被稱作C085-R、C087-R、C104-R、C096-R、C100-R和C107-R)的數據。此外，對于第60天和第77天及對于其間選定的天數，顯示了來自這6只貓中的3只，即C085-R、 C087-R和C104-R的數據。 參考圖5，對于第-1天和第74天及其間選定的天數之每一天，為未感染的貓測量的平均0D值的平均值是0. 059或更小。參考圖6，對于第-1天和第34天及其間選定的天數之每一天，為受蛔蟲感染的貓測量的平均0D值的平均值是0. 053或更小。在第40天，為受蛔蟲感染的貓測量的平均0D值的平均值是0. 312，其比在未感染的貓中為第-1天和第74天及其間選定的天數之每一天及在受蛔蟲感染的貓中在第-l天和第34天及其間選定的天數所看到的高約10倍。此外，在感染后第42天、第46天、第48天、第50天和第54天為一些受蛔蟲感染的貓所測量的數個平均0D值比未感染的貓中為第-1天和第74天及其間選定的天數之每一天及在受蛔蟲感染的貓中在第-1天和第34天及其間選定的天數所看到的高數倍。 這些數據指明，抗弓首線蟲pAB特異性結合一種或多種蛔蟲糞抗原。這些數據進一步指明，可以使用抗弓首線蟲pAB來確定貓是否感染有蛔蟲。 實驗4的另一個目的是確定抗弓首線蟲pAB是否僅在貓科動物患有活動性蛔蟲感染時才檢測出蛔蟲。 對感染后第60天自受蛔蟲感染的犬科動物采集的糞便樣品的顯微鏡觀察顯示，樣品適度地無蛔蟲卵，而對感染后第63天、第68天、第70天、第74天和第77天自受鉤蟲感染的動物采集的糞便樣品的顯微鏡檢查顯示，樣品基本上無蛔蟲卵。預期感染后第60天的卵適度減少及感染后第63天、第68天、第70天、第74天和第77天的卵實質減少是由于感染后第56天施用的驅腸蟲藥處理。參考圖6，為受蛔蟲感染的貓所測量的平均0D值的平均值與所觀察到的自這些動物采集的糞便樣品中的卵數目減少一致。具體地，在驅腸蟲藥處理后的天數為這些犬所測量的平均0D值的平均值是0. 063 (第60天)或更小。
這些數據指明，抗弓首線蟲pAB特異性結合一種或多種蛔蟲糞抗原。這些數據進一步指明，可以使用抗弓首線蟲pAB來確定貓是否患有活動性蛔蟲感染。
實施例B 使用以下材料和方法來產生下文所描述的實驗5中所描述的數據。
多克隆抗體制備。在家兔中針對來自蛔蟲(犬弓首線蟲)腸的提取物制備抗弓首線蟲pAB(IgG)的一種制備物，并在家兔中針對來自蛔蟲(犬弓首線蟲)生殖器官的提取物制備抗弓首線蟲pAB(IgG)的第二種制備物，并且這兩種制備物均是通過使用標準方法從
11血清純化的。(為了清楚，針對腸制備的抗弓首線蟲pAB更具體地稱為是"抗TGUT pAB"而針對生殖器官制備的抗弓首線蟲pAB更具體地稱為是"抗TOVA pAB"。)簡言之，如下制備來自剖開的雌性蛔蟲腸或雄性和雌性生殖器官的提取物，即自感染的犬科動物收獲蛔蟲，清洗它們，并解剖所述器官。在液氮中研磨所述器官，并在具有蛋白酶抑制劑的Hanks平衡鹽溶液中懸浮。給家兔施用此懸浮液，并自經免疫接種的家兔收集血清。如下自經免疫接種的家兔的血漿純化抗TGUT pAB和抗T0VA pAB，即通過蛋白G親和層析分離IgG抗體。
犬科動物的感染和抗腸蟲處理。對于實驗5，通過給健康犬口服施用約150-300顆蛔蟲(犬弓首線蟲)、鉤蟲、或鞭蟲的遮掩卵來實現寄生線蟲感染。通過在自這些犬科動物獲得的糞便樣品中顯微鏡觀察蠕蟲卵來證實感染。認為產生通過顯微鏡檢查發現無蠕蟲卵的糞便樣品的犬是未受感染的。 ELISA測定法。通過物理吸附在Immulon 1B 96孔板上于4。C固定化純化的抗TGUTpAB或抗TOVA pAB(3-9 ii g/ml ;100ii 1/孔)過夜。然后用0. 1M TrispH 7. 0中的1% BSA于4t:封閉板過夜，接著于室溫干燥。將約100iU糞便提取物(如上文所描述的那樣制備的)添加至每孔，并容許于室溫溫育1小時。依照本領域普通技術人員已知的標準方法用PBS-Tween-20溶液清洗各孔5次。如下用HRP標記游離的抗TGUT pAB或抗T0VA pAB，即使用SMCC來產生偶聯物，并將3-9 ii g/ml此偶聯物添加至96孔板的每孔。于室溫的30分鐘溫育期后，依照本領域普通技術人員已知的標準方法使用PBS-Tween-20溶液自各孔清洗未結合的偶聯物。然后將50iilTMBLUE⑧過氧化物酶底物(SeraCareLife Sciences,West Bridgewater，MA)添加至每孔，并于室溫溫育板達10分鐘。10分鐘溫育期后用0. 1%SDS停止每個酶促反應后，通過使用ELISA讀板儀進行的標準分光光度法技術于A650測量96孔板中每孔的0D值。在此安排中，為96孔板的任何特定孔獲得的0D值與該孔中存在的特異性結合的抗原量成正比。 實驗5 :抗TGUT pAB和抗TOVA pAB之每一種在犬糞便樣品中特異性結合蛔蟲，但均沒有特異性結合鉤蟲或鞭蟲。 實驗5的目的是確定針對蛔蟲腸道制備的抗體(具體稱為"抗TGUTpAB")和/或針對蛔蟲生殖道制備的抗體(具體稱為"抗TOVA pAB")是否特異性結合蛔蟲、鉤蟲、和/或鞭蟲的糞抗原。圖7和圖8之每一幅中顯示了實驗5中所獲得的16份犬糞便樣品的0D測定。(圖7顯示了使用抗TGUT pAB所獲得的0D值，而圖8顯示了使用抗T0VA pAB所獲得的0D值。)具體地，自如下犬科動物獲得這些糞便樣品4只已知無寄生蟲感染的犬科動物(陰TIY5d62、陰SVY5d62、陰SBY5d62、和陰LCZ5d62) 、4只已知感染有蛔蟲的犬科動物(蛔+QKZ5d62j| +SPY5d62j| +RYZ d69、和蛔+WHY5d69) 、4只已知感染有鉤蟲的犬科動物(鉤+1^丫5(176、鉤+06丫5(176、鉤+5乂25(184、和鉤+SKZ5d69)、和4只已知感染有鞭蟲的犬科動物(鞭+SEZ d62、鞭+1 25(169、鞭+1^25(162、和鞭+REY5d62)。感染后第62天("d62")、第69天("d69")、第76天("d76")、或第84天("d84")時獲得糞便樣品。為每只特定的犬科動物選擇的具體的感染后天數基于蠕蟲卵排出量處于或接近峰水平的天數，如通過顯微鏡檢查所測定的。 具體參考圖7，對于抗TGUT pAB，未感染的、受鉤蟲感染的、和受鞭蟲感染的樣品的所測量的平均OD分別是O. 075、0. 083、和0. 082 (這些樣品之每份所測量的OD小于0. 096)，
指明抗TGUT pAB沒有特異性結合任何這些樣品中的抗原。相反地，來自受蛔蟲感染的犬的
12糞便樣品的平均0D是0. 385，其比為未感染的、受鉤蟲感染的和受鞭蟲感染的樣品所獲得的平均0D高約4.5至5倍。這些數據指明抗TGUT pAB特異性結合一種或多種蛔蟲抗原，但沒有特異性結合任何鉤蟲或鞭蟲糞抗原。 具體參考圖8，對于抗T0VA pAB，未感染的、受鉤蟲感染的、和受鞭蟲感染的樣品的所測量的平均OD分別是O. 588、0. 820、和0. 590 (這些樣品之每份所測量的OD小于0. 916)。相反地，來自受蛔蟲感染的犬的糞便樣品的平均0D是3. 244，其比為未感染的、受鉤蟲感染的和受鞭蟲感染的樣品所獲得的平均OD高約4至5. 5倍。這些數據指明抗TGUT pAB特異性結合一種或多種蛔蟲抗原，但沒有特異性結合任何鉤蟲或鞭蟲糞抗原。
雖然已經參照具體的實施方案和具體的實施例描述了本發明的組合物、裝置和方法，但是要理解的是可以在不背離本發明的精神和范圍的前提下產生本發明的裝置和/或方法的變化形式。例如，要理解的是不同于抗弓首線蟲pAB的多克隆抗體、或單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、或抗體片段可以替換抗弓首線蟲pAB。可以通過例如給動物施用一種或多種對蛔蟲特異性的抗原來制備另一種對蛔蟲特異性的多克隆抗體。此外，雖然抗弓首線蟲pAB是在家兔中制備的，但是也可以在例如人或其它靈長類、小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、豬、牛、綿羊、驢、犬、貓、雞、或馬中制備多克隆抗體。在本發明的裝置中所使用的抗體還可以是任何抗體類，包括例如IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。用于制備和表征抗體的手段是本領域中公知的。參見例如Dean， Methods Mol. Biol. 80 :23-37 (1998) ;Dean，Methods Mol. Biol. 32 :361-79(1994) ;Baileg， Methods Mol. Biol. 32 :381-88(1994);Gullick， Methods Mol. Biol. 32 :389-99(1994) ;Drenckhahn等，Methods Cell. Biol. 37 :7-56(1993) ;Morrison， Ann. Rev. Immunol. 10 :239-65(1992) ;Wright等，Crit. Rev.Immunol. 12 :125-68(1992)。 本發明的裝置、方法和試劑盒中所使用的抗體還可以是單鏈抗體(scFv)、或抗體的抗原結合片段。抗體的抗原結合片段是完整抗體的、包含完整抗體中抗原結合位點或可變區的部分，其中所述部分是沒有完整抗體的Fc區的重鏈恒定域的。抗體片段的例子包括Fab、Fab，、Fab' -SH、F(ab， )2和Fv片段。 可以通過本領域中已知的任何方法來將本發明的裝置中所使用的抗體固定化在固體支持物上，包括例如，共價地或非共價地，直接地或間接地，將所述抗體附著至所述固體支持物。因此，雖然在所描述的實施方案中通過物理吸附(即，在不使用化學接頭的情況中)將抗弓首線蟲pAB附著至固體支持物，但是涵蓋的是，可以通過本領域技術人員容易知道的任何化學結合(即，在使用化學接頭的情況中)方法來將抗弓首線蟲pAB或其它抗體固定化至固體支持物。 所述裝置的固體支持物不限于是聚苯乙烯96孔板。固體支持物可以是任何適合于對蛔蟲特異性的抗體的固定化的材料。例如，固體支持物可以是珠、顆粒、管、？L、探針、浸漬片(dipstick)、吸管尖(pipette tip)、載玻片、纖維、膜、紙、天然的和改良的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、玻璃、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龍、淀粉酶、塑料、磁石(magnetite)或本領域技術人員容易知道的任何其它合適的材料。 本發明的裝置也不限于是適合于實施ELISA測定法的裝置。例如，所述裝置可以是適合于實施側流測定法的裝置。對于實施在本發明中有用的側流測定法有用的例示性裝置記載于美國專利號5， 726，010，本文通過提及而收錄其全部內容。因此用于實施側流測定法的裝置可以是SNAP⑧裝置，其可購自IDEXX Laboratories, Inc. (Westbrook， ME)。
任選地，所述裝置可以包括一種或多種經標記的抗原捕捉試劑，其可以在對本發明的裝置應用之前與糞便樣品混合。在包括經標記的抗原試劑時，可以在所述裝置的固體表面上沉積或干燥經標記的抗原捕捉試劑，或者不這樣做。"抗原捕捉"指對感興趣抗原特異性的任何化合物。經標記的抗原捕捉試劑(無論添加至糞便樣品還是預先沉積在所述裝置上)可以是例如對蛔蟲抗原特異性的經標記抗體。例如，與辣根過氧化物酶偶聯的蛔蟲特異性抗體可以作為經標記的抗原捕捉試劑使用。 任選地，所述裝置還可以包括液體試劑，其自反應區(固相)運離(諸如例如在該裝置包括SNAP⑧裝置時)或有助于除去(諸如例如在該裝置包括96孔板時)未結合的材料(例如未反應的糞便樣品和未結合的抗原捕捉試劑)。液體試劑可以是清洗試劑，并僅用來自反應區除去未結合的材料，或者它可以包括檢測劑試劑，并用來除去未結合的材料和促進抗原檢測。例如，在偶聯有酶的抗原捕捉試劑的情況中，檢測劑試劑包括在反應區(固相)與酶-抗體偶聯物反應后產生可檢測信號的底物。或者，在偶聯有放射性的、熒光的、或吸收光的分子的經標記抗原捕捉試劑的情況中，檢測劑試劑僅起清洗溶液的作用，其通過洗去未結合的經標記試劑來促進對反應區復合物形成的檢測。 液體試劑可以進一步包括有限數量的"抑制劑"，即，阻斷可檢測的終產物形成的物質。有限數量定義為是足以阻斷終產物形成直至大部分或全部過量的、未結合的材料被運離第二區域(此時產生可檢測的終產物)的抑制劑量。 本發明的裝置還可以包括在與抗原捕捉試劑不同的位置處固定化的各種結合試劑。例如，可以包括識別經標記抗體或抗原捕捉試劑的物種特異性(例如，蠕蟲特異性)抗體部分或酶標記的試劑的酶部分的免疫試劑(抗體、抗原或肽)作為陽性對照以評估試劑在裝置內的耐久性(viability)。例如，陽性對照可以是抗辣根過氧化物酶抗體，其在例如山羊或小鼠中制備。另外，可以包括自衍生抗原-抗體復合物的抗體部分的物種的非免疫成員分離的試劑(例如，抗體)作為陰性對照以評估免疫復合物(即，抗原-抗體復合物)形成的特異性。 在被設計成檢測糞便樣品中的蛔蟲外，任選地，可以將本發明的裝置設計成容許實施一種或多種其它診斷測試。例如，固體支持物還可以包括用于檢測一種或多種非蛔蟲蠕蟲寄生物、一種或多種非蠕蟲寄生物、一種或多種病毒、或一種或多種細菌的試劑。用于檢測一種或多種非蛔蟲蠕蟲寄生物、一種或多種非蠕蟲寄生物、一種或多種病毒或一種或多種細菌的試劑可以是例如由對一種或多種非蛔蟲蠕蟲寄生物、一種或多種非蠕蟲寄生物、一種或多種病毒或一種或多種細菌特異性的抗體所識別的一種或多種抗原或一種或多種抗體。 在本發明的方法中，通過檢測糞便樣品中是否存在一種或多種蛔蟲抗原來實現蛔蟲感染的檢測。可以通過本領域中已知的任何方案來收集要測試的糞便樣品的可溶性部分。例如，在上文所描述的特定方案外，可以使用過濾、離心、或者簡單混合接著進行重力沉降(gravimetric settling)來收集樣品的可溶性部分。 所述方法包括在容許抗原/抗體復合物，即免疫復合物形成的條件下使糞便樣品與對一種或多種蛔蟲抗原特異性的一種或多種抗體接觸。即，抗體特異性結合糞便樣品中存在的蛔蟲抗原。本領域技術人員會熟悉用于檢測抗原/抗體復合物結合的測定法和條
14件。例如，可以使用結合抗原/抗體復合物的二抗來檢測抗原/抗體復合物。可以使用本領域中已知的任何適合的方法來檢測蛔蟲抗原和抗蛔蟲抗體之間的復合物在樣品中的形成。此外，可以通過本領域中已知的方法來測定抗體-抗原復合物的量。比對照樣品中形成的水平高的水平指明蛔蟲感染。 本發明方法的備選步驟可以包括向本發明的裝置(其包括固定化的對蛔蟲抗原特異性的抗體)應用糞便樣品，并檢測糞便樣品中是否存在蛔蟲抗原。可以將對蛔蟲抗原特異性的抗體直接或間接附著至固體支持物或基片諸如微量滴定孔、磁珠、非磁性珠、柱、基質、膜、由合成的或天然的纖維(例如，玻璃或基于纖維素的材料或熱塑性聚合物，諸如聚乙烯、聚丙烯、或聚酯)構成的纖維毯片(fibrous mat)、由顆粒材料(例如，玻璃或各種熱塑性聚合物)構成的燒結結構、或由硝酸纖維素、尼龍、聚砜等(一般而言，本質上是合成的)構成的澆鑄膜薄膜。可以以合適的形狀(諸如薄膜、片、或板)使用所有這些基片材料，或者可以將它們包被至合適的惰性載體(諸如紙、玻璃、塑料薄膜、或織物)上、或者與合適的惰性載體鍵合、或者覆蓋惰性載體。適合于將肽固定化在固相上的方法包括離子、疏水、共價相互作用等。 然而，本發明的方法不需要包括固相或基片的使用。例如，所述方法可以包括免疫沉淀方法，其不需要固相或基片的使用。 在本發明的一些實施方案中，在指示劑試劑諸如酶偶聯物(其被結合至抗體)催化可檢測反應時檢測出抗原/抗體復合物。任選地，可以在容許可檢測的抗原/抗體/指示劑復合物形成的條件下向抗原/抗體復合物應用包括信號產生化合物的指示劑試劑。任選地，可以在形成抗原/抗體復合物前用指示劑試劑標記抗體。 具體地，可以通過輻射度測量、色度測量、熒光測量、大小分離、或沉淀方法來檢測本發明的一些方法中的抗原/抗體復合物或抗原/抗體/指示劑復合物的形成。也可以通過添加與包括信號產生化合物的指示劑試劑偶聯的二抗來實現抗原/抗體復合物的檢測。包括與多肽/抗體復合物結合的信號產生化合物(標記物)的指示劑試劑可以使用上文所描述的方法來檢測，并且可以包括顯色劑、催化劑諸如酶偶聯物、熒光化合物諸如熒光素和羅丹明(rhodamine)、化學發光化合物諸如二氧烷(dioxetane)、吖啶鹽(acridinium)、菲啶鹽(phenanthridinium)、釕、和魯米諾(luminol)、放射性元素、直接可見的標記物，以及輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。酶偶聯物的例子包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P _半乳糖苷酶等。特定標記物的選擇不是至關重要的，但是它要能夠單獨地或與一種或多種別的物質一起產生信號。 可以用本領域中已知的任何類型的標記物(包括例如熒光的、化學發光的、放射性的、酶、膠體顆粒、放射性同位素和生物發光的標記物)來標記抗體(包括二抗)。在本發明的各種實施方案中，用酶、膠體顆粒、放射性核素或熒光體來標記本發明的一種或多種抗體。顆粒標記物可以是例如，與對蛔蟲抗原特異性的抗體偶聯的有色乳膠顆粒、染料溶膠、或金溶膠。 本發明的方法包括但不限于那些基于競爭、直接反應或三明治型測定法的，包括但不限于ELISA、RIA、免疫熒光測定法(IFA)、血凝(HA)、熒光偏振免疫測定法(FPIA)、和微量滴定板測定法(在微量滴定板的一個或多個孔中進行的任何測定法)。本發明的一種測定法包括可逆流層析結合測定法，其可以通過例如使用SNAP⑧裝置來實施。參見美國專利號5， 726， 010。 本發明的方法便于三明治或競爭型特異性結合測定法。在三明治式測定法中，在反應區中固定化抗原捕捉試劑。這些抗原捕捉試劑可以特異性結合所測試糞便樣品中的抗原。具體地，這些抗原捕捉試劑特異性結合來自蛔蟲的抗原(若存在于糞便樣品中的話)。結合來自樣品的抗原后，通過任何合適的方法來檢測抗原捕捉試劑/抗原復合物。例如，所述復合物可以與經標記的特異性結合試劑(例如，酶-抗體偶聯物)起反應，并檢測抗原(例如，在與底物反應后)。 在本發明方法的其它實施方案中，實施競爭測定法。在競爭測定法中，在反應區固定化抗原捕捉試劑，并同時與來自樣品的抗原和經標記的抗原(例如抗原-酶偶聯物)接觸。在反應區檢測出的標記物量與樣品中的抗原量成反比。 在本發明的一些實施方案中，將對一種或多種蛔蟲抗原特異性的抗體附著至固相或基片。將潛在包括來自蛔蟲的抗原的糞便樣品添加至基片。添加能特異性結合蛔蟲的抗體。抗體可以是固相上使用的相同抗體，或者它們可以來自不同來源或物種。此外，可以將這些抗體與指示劑試劑諸如酶偶聯物連接。可以在每次添加前實施清洗步驟。可以添加生色團或酶底物，并且可以容許顯現顏色。可以停止顏色反應，并可以使用例如分光光度計來量化該顏色。 在本發明的其它實施方案中，將對一種或多種蛔蟲抗原特異性的抗體附著至固相或基片。將潛在包括蛔蟲抗原的糞便樣品添加至基片。添加能特異性結合蛔蟲抗原的第二抗物種抗體。這些第二抗體來自不同于固相抗體的物種。添加第三抗物種抗體，其特異性結合第二抗體，并且不會特異性結合固相抗體。第三抗體可以包括指示劑試劑，諸如酶偶聯物。可以在每次添加前實施清洗步驟。可以添加生色團或酶底物，并且可以容許顯現顏色。可以停止顏色反應，并可以使用例如分光光度計來量化該顏色。 在一個具體的例子中，如下與裝置(其是側流測定法裝置) 一起實施本發明的方法，即向該裝置在第一區(樣品應用區)的流動基質(flow matrix)添加制備好的糞便樣品。制備好的糞便樣品在液體流動路線中通過毛細管作用被攜帶至流動基質的第二區，在那里顆粒標記物能夠與糞便樣品中的抗原結合并形成第一復合物。顆粒標記物可以是例如與對蛔蟲抗原特異性的抗體偶聯的有色乳膠顆粒、染料溶膠、或金溶膠。第一復合物被攜帶至流動基質的第三區，在那里特異性結合蛔蟲抗原的抗體被固定化在獨特位置。在固定化的抗體和第一復合物之間形成第二復合物。可以直接顯現第二復合物一部分的顆粒標記物。 蛔蟲抗體可以是反應區(固相)中的固定化抗原捕捉試劑。可以將第二抗原捕捉試劑，即，已經與標記物偶聯的第二蛔蟲抗體添加至樣品，之后將樣品添加至裝置，或者可以將第二抗原捕捉試劑摻入裝置中。例如，可以在提供樣品應用區和固相間液體交流的液體流動路線上沉積并干燥經標記抗原捕捉試劑。經標記抗原捕捉試劑與測試樣品的接觸能導致經標記抗原捕捉試劑的溶解。 本發明進一步包括用于檢測糞便樣品中的蛔蟲的測定試劑盒(例如，制品)。因此，試劑盒可以包括本發明的一種或多種裝置。例如，試劑盒可以包括抗蛔蟲抗體和用于測定所述抗體對樣品中的蛔蟲抗原的結合的手段。在一個具體的例子中，此類試劑盒包括具有固定化抗蛔蟲抗體的裝置、一種或多種抗原捕捉試劑(例如，非固定化的經標記抗原
16捕捉試劑和固定化的抗原捕捉試劑)和清洗試劑，以及檢測劑試劑及陽性和陰性對照試劑(若想要或合適的話)。本領域普通技術人員已知的其它成分諸如緩沖液、對照等可以包括在此類測試試劑盒內。各種試劑的相對量可以有所變化，以提供試劑溶液中的各個濃度，其充分優化測定法的靈敏性。具體地，可以以干粉(通常是凍干的)提供試劑，其溶解后會提供具有適合于與樣品組合的濃度的試劑溶液。本發明的抗體、測定法、和試劑盒在例如患者中蛔蟲感染的各個病例的診斷，以及蛔蟲爆發的流行病學研究中是有用的。試劑盒可以進一步包括關于實施本發明的一種或多種方法的說明書，包括關于使用與試劑盒一起包括在內的本發明的任何裝置的說明書。 用于檢測蛔蟲感染的本發明的方法可以與其它診斷測定法組合以檢測其它生物體或疾患的存在。例如，本發明的測定法可以與檢測一種或多種非蛔蟲蠕蟲糞便寄生物、一種或多種非蠕蟲糞便寄生物、一種或多種病毒、一種或多種細菌、一種或多種血液傳播的寄生物或潛血/隱血或其組合的試劑組合。通過在單一測定裝置中提供兩個或更多個獨特的結合位點(諸如例如，SNAP⑧測定裝置上的兩個獨特點)，本發明容許檢測來自單一樣品的兩種或更多種生物體。在一個實施方案中，有3個獨特點(所述點是抗原或抗體結合試劑)，其用于檢測來自單一樣品的3種生物體的過去或現在的感染(S卩，相同的、單一樣品被呈遞至單一裝置上的3種捕捉試劑)。 本文中合適地例示性描述的發明可以在缺乏未在本文中明確公開的任何一種或多種元件、一項或多項限制的情況中實施。如此，例如在本文中的每種情況中，術語"包含"、"主要由...組成"和"由...組成"之任一項可以被其它兩項之任一替換，同時保留它們普通的意義。已經被采用的術語和表述作為描述的術語使用而并非限制，使用此類術語和表述并不意圖排除所顯示和描述的特征或其部分的任何等同物，而是認識到在本發明所要求保護的范圍內的各種修飾是有可能的。如此，應當理解的是，盡管已經通過優選的實施方案明確地公開了本發明，但是本領域技術人員可以采取任選的特征、本文中公開的概念的修飾和變化，并且此類修飾和變化被認為是在說明書和所附的權利要求書所限定的本發明的范圍內的。 另外，在按馬庫什組或其它備選分組描述本發明的特征或方面時，本領域技術人員會認可本發明也由此是以馬庫什組或其它組的任何成員個體或成員亞組的方式描述的。
已經描述了許多實施例來幫助闡明本發明。然而，要理解的是，可以在不背離本發明的精神和范圍的前提下進行各種修飾。因而，其它實施方案也在本文所附權利要求書的范圍內。
權利要求
一種對一種或多種蛔蟲抗原特異性的抗體，所述抗體不與自下組的至少一種成員衍生的糞抗原起交叉反應鉤蟲、鞭蟲和犬心蟲。
2. 權利要求l的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
3. 權利要求l的抗體，其中所述抗體是通過用整條蛔蟲的提取物、蛔蟲腸的提取物或 蛔蟲生殖器官的提取物進行的免疫接種而獲得的。
4. 權利要求3的抗體，其中衍生所述整條蛔蟲的提取物、所述蛔蟲腸的提取物和所述 蛔蟲生殖器官的提取物的蛔蟲是犬弓首線蟲。
5. 權利要求l的抗體，其中所述一種或多種蛔蟲抗原是自犬弓首線蟲或貓弓首線蟲衍 生的。
6. —種用于檢測哺乳動物的糞便樣品中是否存在蛔蟲的裝置，其包含固體支持物，其 中對一種或多種蛔蟲抗原特異性的一種或多種抗體被固定化在所述固體支持物上。
7. 權利要求6的裝置，其中所述對一種或多種蛔蟲抗原特異性的一種或多種抗體對自 下組衍生的任何糞抗原不是特異性的鉤蟲、鞭蟲、和犬心蟲。
8. 權利要求6的裝置，其中所述一種或多種抗體是通過用整條蛔蟲的提取物、蛔蟲腸 的提取物或蛔蟲生殖器官的提取物進行的免疫接種而獲得的。
9. 權利要求8的裝置，其中衍生所述整條蛔蟲的提取物、所述蛔蟲腸的提取物和所述 蛔蟲生殖器官的提取物的蛔蟲是犬弓首線蟲。
10. 權利要求6的裝置，其中所述一種或多種抗體是多克隆的。
11. 權利要求6的裝置，其中所述一種或多種抗體之一種或多種是經過標記的。
12. 權利要求6的裝置，其中所述裝置是酶聯免疫吸附測定法裝置。
13. 權利要求12的裝置，其中所述酶聯免疫吸附測定法裝置是側流免疫測定法裝置。
14. 權利要求6的裝置，其中所述哺乳動物是犬或貓。
15. 權利要求6的裝置，其中所述裝置進一步包括用于檢測下組之一種或多種的一種 或多種試劑一種或多種非蛔蟲蠕蟲寄生物、一種或多種非蠕蟲寄生物、一種或多種病毒、 和一種或多種細菌。
16. 權利要求6的裝置，其中所述一種或多種蛔蟲抗原是自犬弓首線蟲或貓弓首線蟲 衍生的。
17. —種檢測哺乳動物的糞便樣品中是否存在蛔蟲的方法，包括a. 使所述糞便樣品與對一種或多種蛔蟲抗原特異性的一種或多種抗體接觸；并b. 檢測是否存在所述一種或多種蛔蟲抗原，或者檢測是否存在一種或多種蛔蟲抗體/ 抗原復合物。
18. 權利要求17的方法，其中所述一種或多種抗體是通過用整條蛔蟲的提取物、蛔蟲 腸的提取物或蛔蟲生殖器官的提取物進行的免疫接種而獲得的。
19. 權利要求17的方法，其中衍生所述整條蛔蟲的提取物、所述蛔蟲腸的提取物和所 述蛔蟲生殖器官的提取物的蛔蟲是犬弓首線蟲。
20. 權利要求17的方法，其中所述一種或多種抗體是多克隆的。
21. 權利要求17的方法，其中所述哺乳動物是犬或貓。
22. 權利要求17的方法，其中所述檢測是否存在一種或多種抗體/抗原復合物進一步 包括如下步驟，即提供與所述一種或多種抗體/抗原復合物結合的二抗。
23. 權利要求17的方法，其中所述一種或多種抗體之一種或多種是經過標記的。
24. 權利要求23的方法，其中所述二抗是經過標記的。
25. 權利要求17的方法，其中所述一種或多種抗體被固定化在固體支持物上。
26. 權利要求25的方法，其中所述固體支持物形成酶聯免疫吸附測定法裝置的一部分。
27. 權利要求26的方法，其中所述酶聯免疫吸附測定法裝置是側流免疫測定法裝置。
28. 權利要求17的方法，其進一步包括如下步驟，即使所述糞便樣品與一種或多種試 劑接觸以檢測下組之一種或多種一種或多種非蛔蟲蠕蟲寄生物、一種或多種非蠕蟲寄生 物、一種或多種病毒、和一種或多種細菌。
29. 權利要求28的方法，其中所述用于檢測所述一種或多種非蛔蟲蠕蟲寄生物、所述 一種或多種非蠕蟲寄生物、所述一種或多種病毒和所述一種或多種細菌之任一種或所有的 試劑是由對所述一種或多種非蛔蟲蠕蟲寄生物、所述一種或多種非蠕蟲寄生物、所述一種 或多種病毒或所述一種或多種細菌特異性的抗體識別的一種或多種抗原或一種或多種抗 體。
30. 權利要求17的方法，其中所述一種或多種蛔蟲抗原是自犬弓首線蟲或貓弓首線蟲 衍生的。
31. —種診斷哺乳動物中的腸蛔蟲感染的方法，該方法包括以下步驟a. 自所述哺乳動物獲得糞便樣品；b. 使所述糞便樣品與對一種或多種蛔蟲抗原特異性的一種或多種抗體接觸；c. 檢測是否存在所述一種或多種蛔蟲抗原，或者檢測是否存在一種或多種蛔蟲抗體/ 抗原復合物；并d. 基于是否存在所述一種或多種蛔蟲抗原的檢測或者是否存在一種或多種蛔蟲抗體 /抗原復合物的檢測來診斷所述哺乳動物為患有或者為不患有所述蛔蟲感染。
32. 權利要求31的方法，其中所述一種或多種抗體是通過用整條蛔蟲的提取物、蛔蟲 腸的提取物或蛔蟲生殖器官的提取物進行的免疫接種而獲得的。
33. 權利要求32的方法，其中衍生所述整條蛔蟲的提取物、所述蛔蟲腸的提取物和所 述蛔蟲生殖器官的提取物的蛔蟲是犬弓首線蟲。
34. 權利要求31的方法，其中所述一種或多種抗體是多克隆的。
35. 權利要求31的方法，其中所述哺乳動物是犬或貓。
36. 權利要求31的方法，其中所述檢測是否存在一種或多種抗體/抗原復合物進一步 包括如下步驟，即提供與所述一種或多種抗體/抗原復合物結合的二抗。
37. 權利要求31的方法，其中所述一種或多種抗體之一種或多種是經過標記的。
38. 權利要求37的方法，其中所述二抗是經過標記的。
39. 權利要求31的方法，其中所述一種或多種抗體被固定化在固體支持物上。
40. 權利要求39的方法，其中所述固體支持物形成酶聯免疫吸附測定法裝置的一部分。
41. 權利要求40的方法，其中所述酶聯免疫吸附測定法裝置是側流免疫測定法裝置。
42. 權利要求31的方法，其進一步包括如下步驟，即使所述糞便樣品與一種或多種試 劑接觸以檢測下組之一種或多種一種或多種非蛔蟲蠕蟲寄生物、一種或多種非蠕蟲寄生物、一種或多種病毒、和一種或多種細菌。
43. 權利要求42的方法，其中所述用于檢測所述一種或多種非蛔蟲蠕蟲寄生物、所述 一種或多種非蠕蟲寄生物、所述一種或多種病毒和所述一種或多種細菌之任一種或所有的 試劑是由對所述一種或多種非蛔蟲蠕蟲寄生物、所述一種或多種非蠕蟲寄生物、所述一種 或多種病毒或所述一種或多種細菌特異性的抗體識別的一種或多種抗原或一種或多種抗 體。
44. 權利要求31的方法，其中所述一種或多種蛔蟲抗原是自犬弓首線蟲或貓弓首線蟲 衍生的。
45. —種用于在哺乳動物的樣品中檢測一種或多種蛔蟲糞抗原的試劑盒，該試劑盒包 含權利要求6-15任一項的裝置，和足以檢測所述一種或多種抗原的一種或多種試劑。
46. 權利要求45的試劑盒，其中所述一種或多種試劑選自下組一種或多種指示劑試 劑、一種或多種抗體標記化合物、一種或多種抗體、一種或多種抗原捕捉試劑、一種或多種 抑制劑、和一種或多種清洗試劑。
全文摘要
一種用于檢測糞便樣品中是否存在蛔蟲的組合物、裝置、試劑盒和方法。本發明的組合物、裝置、試劑盒和方法可用于證實來自哺乳動物的糞便樣品中是否存在蛔蟲，所述哺乳動物可能還感染有一種或多種鉤蟲、鞭蟲、和犬心蟲。
文檔編號G01N33/543GK101779126SQ200880102765
公開日2010年7月14日 申請日期2008年6月12日 優先權日2007年6月15日
發明者勞里·A·弗林, 戴維·A·埃爾斯莫爾 申請人:艾德克斯實驗室公司