新型as160-樣蛋白質、包括其的用于鑒定2型糖尿病治療劑的檢測系統、方法和用途的制作方法

專利名稱：：新型as160-樣蛋白質、包括其的用于鑒定2型糖尿病治療劑的檢測系統、方法和用途的制作方法新型AS160-樣蛋白質、包括其的用于鑒定2型糖尿病治療劑的檢測系統、方法和用途本發明涉及新型AKT底物160kDA_樣蛋白質(AS160-樣蛋白質)；鑒定改變細胞的葡萄糖攝入的物質的方法，包括將包含新型AKT底物160kDa樣蛋白質(AS160樣蛋白質)的檢測系統與測試物質接觸，并且通過檢測指示改變的細胞的葡萄糖攝入的信號來鑒定測試物質為改變細胞的葡萄糖攝入的物質；包含編碼AKT底物160kDa-樣蛋白質(AS160-樣蛋白質)的基因和提供基因的可控表達的誘導型啟動子的檢測系統；檢測系統用于鑒定提高至細胞內的葡萄糖攝入的物質的用途；以及AS160-樣蛋白質在2型糖尿病模型中的用途。糖尿病是以高血糖和其他病征為特征的代謝障礙，這與單個的疾病或病況不同。世界衛生組織公認3種主要形式的糖尿病1型、2型和妊娠糖尿病(在妊娠期間發生的)，它們具有相似的病征、癥狀和后果，但具有不同的病因和群體分布。最后，所有形式都是因胰腺的β細胞不能產生足夠的胰島素來防止高血糖而引起。1型通常因產生胰島素的胰腺β細胞的自身免疫性破壞而導致。2型的特征在于廣泛的組織(tissue-wide)胰島素抗性，特別地包括脂肪組織、肝和骨骼肌的胰島素敏感性組織的胰島素抗性，并且變化很廣泛；其有時發展至β細胞功能喪失。妊娠糖尿病與2型糖尿病相似，因為其牽涉由妊娠的激素引起的胰島素抗性。1型和2型是難治的慢性病況，但卻是可治療的并且通常用食療和藥物(包括胰島素補充)的組合來控制。糖尿病可引起許多并發癥例如低血糖、酮癥酸中毒或非酮癥高滲性昏迷。嚴重的長期并發癥包括心血管疾病(兩倍的風險)、慢性腎功能衰竭(糖尿病腎病是發達國家成年人中透析的主要原因)、視網膜損害(其可導致失明并且是發達國家的非老年人中的成人失明的最主要原因)、神經損害(幾種類型的)和微血管損害，其可引起勃起機能障礙(陽痿)和愈合不良。創傷特別是腳上的愈合不良可導致可能需要截肢的壞疽_發達國家成年人中非創傷截肢的首要原因。因為胰島素是調節葡萄糖從血液至大多數細胞(主要是肌肉和脂肪細胞)內的攝入的主要激素，因此胰島素的缺乏或其受體的無敏感性在所有形式的糖尿病中起著中心作用。胰島素通過胰腺中的β細胞響應升高的血糖水平(例如，在進餐后)而被放入血液。胰島素使大多數身體細胞(通常估計大約2/3，包括肌肉細胞和脂肪組織)能夠從血液吸收葡萄糖。2型糖尿病因缺陷型胰島素分泌與胰島素抗性或胰島素敏感組織(特別地脂肪組織、肝和骨骼肌)的減小的胰島素靈敏性的組合而引起。在早期，主要異常是減小的胰島素敏感性，其特征在于血液中升高的胰島素水平。在該階段，高血糖癥可通過提高胰島素敏感性或通過肝減少葡萄糖產生的各種措施和藥物治療來逆轉，但隨著疾病發展，胰島素分泌的損害惡化，從而胰島素的治療性替代通常變得很有必要。通常，2型糖尿病首先通過嘗試改變體力活動、飲食(通常減少碳水化合物攝入)和體重損失來治療。必要時，通常下一步是使用口服抗糖尿病藥的治療。由于胰島素的產生在2型糖尿病患者中最初只是適度受損，口服藥物仍然可用于促進胰島素的產生，調節肝臟對葡萄糖的不適當釋放以及大大減弱胰島素抗性。早期階段中糖尿病的適當治療，特別是提高脂肪組織、肝和骨骼肌的胰島素靈敏性可延長、延緩和/或阻止疾病的發展。因此，本發明的第一目的是更好地理解參與葡萄糖代謝的分子背景，從而幫助更好地尋找提高(improve)細胞(特別地為主要胰島素敏感性組織的骨骼肌、脂肪組織和/或肝)的細胞的胰島素敏感性的新型潛在藥物。令人驚訝的是，本發明者現已鑒定AKT底物160kDa(AS160，也稱為Tbc1D4或AS160，同種型1)的兩個新型同種型(同種型2和3)。在下文中，術語“AS160樣蛋白質”是指AS160的新型同種型中的任一個或兩個，即指同種型2和/或3。根據一個實施方案，術語“AS160樣蛋白質”是指兩個同種型，根據另一個實施方案，其指同種型2，根據另一個實施方案中，其指同種型3。根據優選實施方案，術語“AS160樣蛋白質”是指同種型2。AS160，同種型AS160，同種型2在6種主要胰島素敏感性組織即脂肪組織、肝、骨骼肌、心臟、腦和胰腺組織中表達(參見圖2A、B)。與此相反，AS160的同種型1主要在骨骼肌和心臟中被檢測至丨J。第三種同種型(AS160，同種型3)，缺少AS160的外顯子12(圖1)，也主要在心臟和骨骼肌中表達。(圖2C)。由于無效胰島素作用是2型糖尿病的標志，因此AS160樣蛋白質提供了研究胰島素敏感性組織中胰島素抗性的分子基礎的新型靶。此外，AS160樣蛋白質可用于鑒定可提高葡萄糖攝入，從而在相關組織中提高胰島素敏感性的物質。已鑒定參與AS160樣蛋白質的細胞內信號轉導途徑的組分，這使得能夠在不同水平上研究物質與各信號轉導途徑的相互作用。其可顯示與AS160樣蛋白質相關的胰島素刺激的信號轉導包括AS160和AKT的磷酸化、PI3K(PI3激酶)和MEKK/ERK激酶的參與。令人出乎意料地，本發明者發現AS160樣的過表達導致增加的GLUT4至質膜的轉運和葡萄糖攝入的增加。他們還發現包含AS160樣蛋白質的檢測系統可用于研究在高葡萄糖條件下細胞對葡萄糖的攝入。這對于糖尿病模型或對于鑒定用于治療和/或預防糖尿病的適當的治療可能是特別重要的，因為該疾病以血液中增加的葡萄糖水平為特征。因此，檢測能夠在該條件(高葡萄糖)下改變，特別地提高，葡萄糖攝入的物質可有利于新治療的鑒定。因此，AS160樣蛋白質可用于鑒定改變，特別地增加，細胞的葡萄糖攝入，從而具有治療或預防2型糖尿病的潛能的物質的方法。因此，本發明在第一方面提供了鑒定改變細胞的葡萄糖攝入和/或GLUT4轉運的物質的方法，其包括(a)將包含AKT底物160kDa樣蛋白質(AS160樣蛋白質)的檢測系統與測試物質接觸，和(b)通過檢測指示改變的細胞的葡萄糖攝入的信號來將測試物質鑒定為改變細胞的葡萄糖攝入和/或GLUT4轉運的物質。在本發明的上下文中“改變細胞的葡萄糖攝入”意指改變，增加或減少細胞的葡萄糖攝入。優選增加細胞的葡萄糖攝入。在本發明的上下文中，如果與(測試)物質接觸的細胞的葡萄糖攝入比對照(例如未與所述(測試)物質接觸的相同細胞)的葡萄糖攝入顯著更低或更高，那么細胞的葡萄糖攝入與對照相比發生改變，即分別減少或增加。本領域技術人員知道評估兩個值彼此之間是否具有顯著差異的統計學方法例如學生氏t-檢驗或卡方檢驗(關于適當的檢測方法，也參見實施例)。在增加的葡萄糖攝入的優選實施方案中，細胞的葡萄糖攝入總計達到對照的至少110%，優選達到至少125%，更優選達到至少150%、160%、170%、180%或190%，仍更優選達到至少200%和最優選達到至少300%。如上所詳述的，對于2型糖尿病的治療或預防，特別重要的是改變胰島素敏感性組織的葡萄糖攝入。因此，優選本發明的方法使得能夠鑒定改變(優選增加)，在至少1個，優選至少2個，更優選至少3個或至少4個或至少5個或至少6個胰島素敏感性組織中葡萄糖攝入的物質。胰島素敏感性組織的實例包括但不限于脂肪組織、肝、骨骼肌、胰腺組織、心肌、血管平滑肌和活性乳腺。然而，6個主要胰島素敏感性組織是脂肪組織、肝、骨骼肌、心臟、腦和胰腺組織。因此，物質優選改變更優選增加至少1、2、3、4、5或6或更多個此類組織，S卩脂肪組織、骨骼肌、心臟、腦、胰腺組織和/或肝中的葡萄糖攝入。如果在1個組織中改變優選增加葡萄糖攝入，則該組織可以例如是脂肪組織、肝、心臟、腦、胰腺組織或骨骼肌中的任一個。如果在2個組織中改變優選增加葡萄糖攝入，則該這兩個組織可以是例如，脂肪組織和肝；脂肪組織和骨骼肌；或肝和骨骼肌，或如上所列的6個主要胰島素敏感性組織中的2個的任何其他組合。如果在3個組織中改變優選增加葡萄糖攝入，則這3個組織可以是例如，脂肪組織、肝和骨骼肌或上面所列的6個主要胰島素敏感性組織中的3個的任何其他組合。如果在4個組織中改變優選增加葡萄糖攝入，則這4個組織可以是例如，脂肪組織、肝、骨骼肌和腦或上面所列的6個主要胰島素敏感性組織中的4個的任何其他組合。如果在5個組織中改變優選增加葡萄糖攝入，則這5個組織可以是例如，脂肪組織、肝、骨骼肌、腦和心臟或上面所列的6個主要胰島素敏感性組織中的5個的任何其他組合。存在于脂肪組織、肝、心臟、腦、胰腺組織和骨骼肌中的主要細胞類型分別是脂肪細胞、肝細胞、心肌細胞、神經元細胞、胰腺細胞、β細胞和骨骼肌細胞。因此，物質優選改變更優選增加這些細胞類型(即脂肪細胞、肝細胞和/或骨骼肌細胞)中的至少1、2或3種細胞中的葡萄糖攝入。如果在1個細胞類型中改變，優選增加葡萄糖攝入，則該類型可以是例如，脂肪細胞、肝細胞、心肌細胞、神經元細胞、胰腺細胞、β細胞或骨骼肌細胞。如果在2個細胞類型中改變，優選增加葡萄糖攝入，則這兩個細胞類型可以是，例如，脂肪細胞和肝細胞；脂肪細胞和骨骼肌細胞；或肝細胞和骨骼肌細胞或存在于如上所列的6種主要胰島素敏感性組織中的主要細胞類型的任何其他組合。如果在3個細胞類型中改變，優選增加葡萄糖攝入，則這3個細胞類型可以是，例如，脂肪細胞，肝細胞和骨骼肌細胞或存在于如上所列的6種主要胰島素敏感性組織中的如上所列的主要細胞類型的任何其他組合。如果在4、5或更多個如上所列的6個胰島素敏感性組織的主要細胞類型中改變，優選增加葡萄糖攝入，則可以是4、5或更多個此類細胞類型的任何組合。如上所詳述的，本發明的方法涉及包含AS160樣蛋白質的檢測系統。根據一個實施方案(AS160的同種型2)，AS160樣蛋白質源自AKT底物160kDa(AS160)，其中與AS160相比較，AS160的外顯子11和12編碼的序列在AS160樣蛋白質中缺失(也參見圖1)。根據另一個實施方案(AS160的同種型3)，AS160樣蛋白質源自AKT底物160kDa(AS160)，其中與AS160相比較，該序列缺少外顯子12。此外，如下所詳述的，可存在其他突變。AS160(AKT底物160kDa;ΝΜ_014832(EMBL))最初被鑒定為3T3脂肪細胞中的蛋白質激酶AKT的底物(Kane等，2002)。另外的研究證明AS160也在小鼠、大鼠和人的骨骼肌中起作用。胰島素、contraction或AICAR(5-氨基咪唑-4-氨甲酰1β-D-核糖核苷，cAMP-依賴的蛋白激酶(cAMPK)激活物)在兩個位點(Ser588和Thr642)上增加AS160的磷酸化，所述兩個位點位于就AKT磷酸化而預測的特征基序(RXRXXS/T)中(Kane等，同上)。AS160的突出特征是存在Rab蛋白質的GTP酶激活結構域。此類小G蛋白是膜運輸所必需的。在本上下文中，最近的數據提供了AS160將AKT下游的信號與GLUT4的胰島素刺激的轉運相聯系的證據(Sano等，2003)。AS160的激活在II型糖尿病患者中減少，這導致GLUT4轉運受損(Karlsson等，2005b)。全長AS160在脂肪細胞中的過表達不改變GLUT4的基礎或胰島素刺激的表面至整體(surface-to-total)的分布，表明AS160的量似乎不是限速的(Zeigerer等，2004；Sano等，2003)。使用突變體AS160(包含4個突變的磷酸化位點)的實驗顯示GLUT4的轉運顯著減少(Sano等，2003)。此外，AS160的功能性GAP(GTP酶-激活蛋白質)結構域是GLUT4轉運所必需的。AS160，同種型2在編碼AS160的新型同種型2的基因中，與全長AS160基因相比較，缺失外顯子11和12(參見實施例1和2)。在人基因的情況下，與如由序列NM_014832(參見EMBL數據庫)定義的人全長AS160相比較，編碼氨基酸678至740的核苷酸缺失。此夕卜，在位置nt606(沉默)和nt3827(Ala-Val)上鑒定了兩個錯配。此外，實施例2的克隆包含3bp缺失(nt2594-2596)，該缺失也在人胎盤cDNA中但非在人腦cDNA中被發現。對于實施例中所用的缺少外顯子11和12的同種型的表達克隆，將缺失的3bp序列再導入以使更能與NM_014832(EMBL)的全長序列相似。所得的編碼AS160的同種型2的DNA序列(SEQIDNO1)示于下列編碼AS160的同種型2的DNA序列(SEQIDNO1)ATGGAGCCGCCCAGCTGCATTCAGGATGAGCCGTTCCCGCACCCCCTGGAGCCCGAGCCGGGCGTCTCAGCTCAGCCCGGCCCCGGGAAGCCAAGCGATAAGCGGTTCCGGCTGTGGTACGTTGGGGGGTCGTGCCTGGACCACAGGACCACGCTGCCTATGCTGCCCTGGCTCATGGCCGAGATCCGCAGGCGCAGCCAGAAGCCCGAGGCGGGCGGCTGCGGGGCGCCGGCGGCCCGAGAGGTGATCCTGGTGCTCAGCGCGCCCTTCCTGCGTTGCGTCCCCGCGCCGGGCGCTGGGGCCTCGGGGGGCACTAGTCCGTCGGCCACGCAGCCCAACCCGGCGGTATTCATCTTCGAGCACAAGGCGCAGCATATCTCGCGCTTCATCCACAACAGCCACGACCTCACCTACTTTGCCTACCTGATCAAGGCGCAGCCCGACGACCCCGAGTCGCAGATGGCCTGCCACGTTTTCCGCGCCACAGACCCCAGCCAGGTTCCTGATGTTATTAGCAGCATAAGGCAATTATCTAAAGCGGCCATGAAAGAGGATGCCAAACCCAGCAAAGATAATGAGGACGCCTTTTACAACTCTCAGAAGTTTGAAGTCCTGTACTGTGGAAAGGTGACCGTGACCCACAAGAAGGCCCCCTCAAGCCTCATCGATGACTGCATGGAGAAGTTCAGCCTGCACGAACAGCAGCGCCTGAAGATCCAAGGCGAGCAGCGCGGTCCGGACCCAGGAGAGGACCTGGCTGACTTGGAGGTGGTGGTGCCCGGGTCCCCCGGAGACTGCCTGCCGGAGGAGGCTGACGGCACCGACACCCACCTTGGCTTACCTGCCGGGGCCAGCCAGCCTGCCCTGACCAGCTCTCGGGTCTGCTTCCCTGAGCGGATTTTGGAAGATTCTGGCTTTGATGAGCAGCAGGAGTTTCGGTCTCGGTGCAGCAGTGTCACCGGCGTGCAACGGAGAGTTCACGAGGGCAGCCAGAAATCCCAGCCGCGACGGAGACACGCGAGCGCACCCAGTCACGTCCAGCCCTCGGACTCGGAGAAGAACAGGACCATGCTCTTCCAGGTTGGGCGATTTGAGATTAACCTTATCAGTCCAGACACTAAATCAGTTGTGCTAGAAAAGAATTTTAAAGATATCTCCTCTTGTTCTCAGGGTATAAAGCATGTGGATCACTTTGGCTTTATCTGCCGGGAGTCTCCAGAGCCTGGACTTAGCCAGTATATTTGTTATGTATTCCAGTGTGCCAGCGAATCTCTGGTTGATGAGGTAATGCTGACTCTGAAACAGGCCTTCAGTACGGCGGCTGCCCTGCAGAGTGCCAAGACGCAGATTAAACTGTGTGAGGCCTGCCCGATGCACTCTTTGCATAAGCTCTGTGAAAGGATTGAAGGTCTCTACCCACCAAGAGCCAAGCTGGTGATACAGAGGCATCTCTCATCACTGACAGATAATGAGCAAGCTGACATCTTTGAAAGAGTTCAGAAAATGAAGCCAGTCAGTGACCAGGAAGAAAATGAACTTGTGATTTTACACCTGAGGCAGCTGTGTGAAGCCAAGCAGAAGACACACGTGCACATCGGGGAAGGCCCTTCTACTATTTCAAATAGTACAATCCCAGAAAATGCAACAAGCAGTGGAAGGTTCAAACTTGACATTCTGAAAAATAAAGCTAAGAGATCCTTAACTAGCTCCCTGGAAAATATCTTCTCAAGGGGAGCTAACAGAATGAGAGGTCGGCTTGGAAGTGTGGACAGTTTTGAACGGTCCAACAGTCTTGCTTCAGAGAAGGACTACTCACCAGGGGATTCTCCACCAGGGACACCGCCAGCGTCCCCACCGTCCTCAGCTTGGCAAACGTTTCCCGAAGAGGATTCCGACTCCCCGCAGTTTCGAAGACGGGCACACACGTTCAGCCACCCACCTTCAAGCACAAAGAGAAAGCTGAATTTGCAGGATGGGAGGGCTCAGGGTGTGCGTTCCCCTCTGCTGAGGCAGAGCTCCAGTGAACAGTGCAGTGATGGAGAAGGGAGAAAAAGGACCTCATCTACCTGCAGCAATGAGTCCCTAAGTGTGGGAGGAACCTCTGTCACTCCTCGCCGGATCTCCTGGCGGCAGCGCATTTTCCTCAGGGTTGCTTCTCCCATGAACAAATCTCCCTCAGCAATGCAACAGCAAGATGGATTGGACAGGAACGAGCTGCTGCCACTGTCCCCCCTCTCTCCAACCATGGAGGAGGAACCGCTGGTTATATTCCTGTCTGGGGAGGATGACCCAGAAAAGATTGAAGAAAGAAAGAAATCAAAAGAACTGAGGAGCTTGTGGAGAAAAGCTATACACCAACAAATCTTGTTACTTCGAATGGAAAAAGAAAACCAGAAACTTGAAGGAGCAAGCAGAGATGAACTCCAGTCCAGAAAAGTTAAATTAGACTATGAAGAAGTTGGTGCATGTCAGAAAGAGGTCTTAATAACTTGGGATAAGAAGTTGTTAAACTGCAGAGCTAAAATCAGATGTGATATGGAAGATATTCATACTCTTCTTAAAGAAGGAGTTCCCAAAAGTCGACGAGGAGAAATTTGGCAGTTTCTGGCTTTACAGTACCGACTCAGACACAGATTGCCTAATAAACAACAGCCTCCTGACATATCCTATAAGGAACTTTTGAAGCAGCTCACTGCTCAGCAGCATGCGATTCTCGTGGATTTAGGAAGGACGTTTCCTACTCACCCTTACTTTTCAGTACAGCTTGGGCCAGGACAGCTGTCACTGTTTAACCTCCTGAAAGCCTATTCTTTGCTGGACAAAGAAGTGGGATACTGTCAGGGGATCAGCTTTGTGGCTGGAGTCCTGCTTCTGCACATGAGTGAAGAGCAAGCCTTTGAAATGCTGAAATTCCTCATGTATGACCTCGGCTTCCGCAAGCAGTACAGACCTGACATGATGTCGCTGCAGATTCAAATGTACCAGCTGTCCAGGCTCCTTCATGACTATCACAGAGATCTCTACAATCACCTTGAAGAAAATGAAATCAGCCCCAGTCTTTATGCTGCCCCCTGGTTCCTCACATTGTTTGCCTCTCAGTTTTCATTAGGATTTGTAGCCAGAGTTTTTGATATTATTTTTCTTCAGGGAACTGAAGTTATATTCAAGGTTGCACTCAGCCTACTGAGCAGCCAAGAGACACTTATAATGGAATGTGAGAGCTTTGAAAATATTGTTGAGTTTCTTAAAAACACGCTACCTGATATGAATACCTCTGAAATGGAAAAAATTATTACCCAGGTTTTTGAGATGGATATTTCTAAGCAGTTGCATGCCTATGAGGTGGAATATCATGTGCTACAGGATGAGCTTCAGGAATCTTCATATTCCTGTGAGGATAGTGAAACTTTGGAGAAGCTGGAGAGGGCCAATAGCCAACTGAAAAGACAAAACATGGACCTCCTAGAAAAATTACAGGTAGCTCATACTAAAATCCAGGCCTTGGAATCAAACCTGGAAAATCTTTTGACGAGAGAGACCAAAATGAAGTCTTTAATCCGGACCCTGGAACAAGAAAAAATGGCTTATCAAAAGACAGTGGAGCAACTCCGGAAGCTGCTGCCCGCGGATGCTCTAGTCAATTGTGACCTGTTGCTGAGAGACCTAAACTGCAACCCTAACAACAAAGCCAAGATAGGAAATAAGCCAS160的新型同種型2的通過EditSeq(Lasergene)翻譯的氨基酸序列(SEQIDNO3)示于下列MEPPSCIQDEPFPHPLEPEPGVSAQPGPGKPSDKRFRLWYVGGSCLDHRTTLPMLPWLMAEIRRRSQKPEAGGCGAPAAREVILVLSAPFLRCVPAPGAGASGGTSPSATQPNPAVFIFEHKAQHISRFIHNSHDLTYFAYLIKAQPDDPESQMACHVFRATDPSQVPDVISSIRQLSKAAMKEDAKPSKDNEDAFYNSQKFEVLYCGKVTVTHKKAPSSLIDDCMEKFSLHEQQRLKIQGEQRGPDPGEDLADLEVVVPGSP⑶CLPEEADGTDTHLGLPAGASQPALTSSRVCFPERILEDSGFDEQQEFRSRCSSVTGVQRRVHEGSQKSQPRRRHASAPSHVQPSDSEKNRTMLFQVGRFEINLISPDTKSVVLEKNFKDISSCSQGIKHVDHFGFICRESPEPGLSQYICYVFQCASESLVDEVMLTLKQAFSTAAALQSAKTQIKLCEACPMHSLHKLCERIEGLYPPRAKLVIQRHLSSLTDNEQADIFERVQKMKPVSDQEENELVILHLRQLCEAKQKTHVHIGEGPSTISNSTIPENATSSGRFKLDILKNKAKRSLTSSLENIFSRGANRMRGRLGSVDSFERSNSLASEKDYSP⑶SPPGTPPASPPSSAWQTFPEEDSDSPQFRRRAHTFSHPPSSTKRKLNLQDGRAQGVRSPLLRQSSSEQCSDGEGRKRTSSTCSNESLSVGGTSVTPRRISWRQRIFLRVASPMNKSPSAMQQQDGLDRNELLPLSPLSPTMEEEPLVIFLSGEDDPEKIEERKKSKELRSLWRKAIHQQILLLRMEKENQKLEGASRDELQSRKVKLDYEEVGACQKEVLITWDKKLLNCRAKIRCDMEDIHTLLKEGVPKSRRGEIWQFLALQYRLRHRLPNKQQPPDISYKELLKQLTAQQHAILVDLGRTFPTHPYFSVQLGPGQLSLFNLLKAYSLLDKEVGYCQGISFVAGVLLLHMSEEQAFEMLKFLMYDLGFRKQYRPDMMSLQIQMYQLSRLLHDYHRDLYNHLEENEISPSLYAAPWFLTLFASQFSLGFVARVFDIIFLQGTEVIFKVALSLLSSQETLIMECESFENIVEFLKNTLPDMNTSEMEKIITQVFEMDISKQLHAYEVEYHVLQDELQESSYSCEDSETLEKLERANSQLKRQNMDLLEKLQVAHTKIQALESNLENLLTRETKMKSLIRTLEQEKMAYQKTVEQLRKLLPADALVNCDLLLRDLNCNPNNKAKIGNKPAs160,同種型3在編碼AS160的新型同種型3的基因中，與全長AS160基因相比較，缺失外顯子12。該外顯予對應于NM_014832(參見EMBL數據庫)的氨基酸733至740。所得的編碼AS160的同種型3的DNA序列(SEQIDNO22)示于下列編碼AS160的同種型3的DNA序列(SEQIDNo22)ATGGAGCCGCCCAGCTGCATTCAGGATGAGCCGTTCCCGCACCCCCTGGAGCCCGAGCCGGGCGTCTCAGCTCAGCCCGGCCCCGGGAAGCCAAGCGATAAGCGGTTCCGGCTGTGGTACGTTGGGGGGTCGTGCCTGGACCACAGGACCACGCTGCCTATGCTGCCCTGGCTCATGGCCGAGATCCGCAGGCGCAGCCAGAAGCCCGAGGCGGGCGGCTGCGGGGCGCCGGCGGCCCGAGAGGTGATCCTGGTGCTCAGCGCGCCCTTCCTGCGTTGCGTCCCCGCGCCGGGCGCTGGGGCCTCGGGGGGCACTAGTCCGTCGGCCACGCAGCCCAACCCGGCGGTATTCATCTTCGAGCACAAGGCGCAGCATATCTCGCGCTTCATCCACAACAGCCACGACCTCACCTACTTTGCCTACCTGATCAAGGCGCAGCCCGACGACCCCGAGTCGCAGATGGCCTGCCACGTTTTCCGCGCCACAGACCCCAGCCAGGTTCCTGATGTTATTAGCAGCATAAGGCAATTATCTAAAGCGGCCATGAAAGAGGATGCCAAACCCAGCAAAGATAATGAGGACGCCTTTTACAACTCTCAGAAGTTCGAAGTCCTGTACTGTGGAAAGGTGACCGTGACCCACAAGAAGGCCCCCTCAAGCCTCATCGATGACTGCATGGAGAAGTTCAGCCTGCACGAACAGCAGCGCCTGAAGATCCAAGGGGAGCAGCGCGGTCCGGACCCAGGAGAGGACCTGGCTGACTTGGAGGTGGTGGTGCCCGGGTCCCCCGGAGACTGCCTGCCGGAGGAGGCTGACGGCACCGACACCCACCTTGGCTTACCTGCCGGGGCCAGCCAGCCTGCCCTGACCAGCTCTCGGGTCTGCTTCCCTGAGCGGATTTTGGAAGATTCTGGCTTTGATGAGCAGCAGGAGTTTCGGTCTCGGTGCAGCAGTGTCACCGGCGTGCAACGGAGAGTTCACGAGGGCAGCCAGAAATCCCAGCCGCGACGGAGACACGCGAGCGCACCCAGTCACGTCCAGCCCTCGGACTCGGAGAAGAACAGGACCATGCTCTTCCAGGTTGGGCGATTTGAGATTAACCTTATCAGTCCAGACACTAAATCAGTTGTGCTAGAAAAGAATTTTAAAGATATCTCCTCTTGTTCTCAGGGTATAAAGCATGTGGATCACTTTGGCTTTATCTGCCGGGAGTCTCCAGAGCCTGGACTTAGCCAGTATATTTGTTATGTATTCCAGTGTGCCAGCGAATCTCTGGTTGATGAGGTAATGCTGACTCTGAAACAGGCCTTCAGTACGGCGGCTGCCCTGCAGAGTGCCAAGACGCAGATTAAACTGTGTGAGGCCTGCCCGATGCACTCTTTGCATAAGCTCTGTGAAAGGATTGAAGGTCTCTACCCACCAAGAGCCAAGCTGGTGATACAGAGGCATCTCTCATCACTGACAGATAATGAGCAAGCTGACATCTTTGAAAGAGTTCAGAAAATGAAGCCAGTCAGTGACCAGGAAGAAAATGAACTTGTGATTTTACACCTGAGGCAGCTGTGTGAAGCCAAGCAGAAGACACACGTGCACATCGGGGAAGGCCCTTCTACTATTTCAAATAGTACAATCCCAGAAAATGCAACAAGCAGTGGAAGGTTCAAACTTGACATTCTGAAAAATAAAGCTAAGAGATCCTTAACTAGCTCCCTGGAAAATATCTTCTCAAGGGGAGCTAACAGAATGAGAGGTCGGCTTGGAAGTGTGGACAGTTTTGAACGGTCCAACAGTCTTGCTTCAGAGAAGGACTACTCACCAGGGGATTCTCCACCAGGGACACCGCCAGCGTCCCCACCGTCCTCAGCTTGGCAAACGTTTCCCGAAGAGGATTCCGACTCCCCGCAGTTTCGAAGACGGGCACACACGTTCAGCCACCCACCTTCAAGCACAAAGAGAAAGCTGAATTTGCAGGATGGGAGGGCTCAGGGTGTGCGTTCCCCTCTGCTGAGGCAGAGCTCCAGTGAACAGTGCAGCAATCTTTCGTCAGTTCGACGCATGTACAAGGAGAGTAATTCTTCCTCCAGTCTTCCAAGTCTTCACACTTCCTTCTCTGCCCCTTCCTTCACTGCCCCCTCTTTCCTGAAAAGCTTTTACCAGAATTCAGGTAGACTGTCCCCACAGTATGAAAATGAAATCAGACTGATGGAGAAGGGAGAAAAAGGACCTCATCTACCTGCAGCAATGAGTCCCTAAGTGTGGGAGGAACCTCTGTCACTCCTCGCCGGATCTCCTGGCGGCAGCGCATTTTCCTCAGGGTTGCTTCTCCCATGAACAAATCTCCCTCAGCAATGCAACAGCAAGATGGATTGGACAGGAACGAGCTGCTGCCACTGTCCCCCCTCTCTCCAACCATGGAGGAGGAACCGCTGGTTGTATTCCTGTCTGGGGAGGATGACCCAGAAAAGATTGAAGAAAGAAAGAAATCAAAAGAACTGAGGAGCTTGTGGAGAAAAGCTATACACCAACAAATCTTGTTACTTCGAATGGAAAAAGAAAACCAGAAACTTGAAGCAAGCAGAGATGAACTCCAGTCCAGAAAAGTTAAATTAGACTATGAAGAAGTTGGTGCATGTCAGAAAGAGGTCTTAATAACTTGGGATAAGAAGTTGTTAAACTGCAGAGCTAAAATCAGATGTGATATGGAAGATATTCATACTCTTCTTAAAGAAGGAGTTCCCAAAAGTCGACGAGGAGAAATTTGGCAGTTTCTGGCTTTACAGTACCGACTCAGACACAGATTGCCTAATAAACAACAGCCTCCTGACATATCCTATAAGGAACTTTTGAAGCAGCTCACTGCTCAGCAGCATGCGATTCTCGTGGATTTAGGAAGGACGTTTCCTACTCACCCTTACTTTTCAGTACAGCTTGGGCCAGGACAGCTGTCACTGTTTAACCTCCTGAAAGCCTATTCTTTGCTGGACAAAGAAGTGGGATACTGTCAGGGGATCAGCTTTGTGGCTGGAGTCCTGCTTCTGCACATGAGTGAAGAGCAAGCCTTTGAAATGCTGAAATTCCTCATGTATGACCTCGGCTTCCGCAAGCAGTACAGACCTGACATGATGTCGCTGCAGATTCAAATGTACCAGCTGTCCAGGCTCCTTCATGACTATCACAGAGATCTCTACAATCACCTTGAAGAAAATGAAATCAGCCCCAGTCTTTATGCTGCCCCCTGGTTCCTCACATTGTTTGCCTCTCAGTTTTCATTAGGATTTGTAGCCAGAGTTTTTGATATTATTTTTCTTCAGGGAACTGAAGTTATATTCAAGGTTGCACTCAGCCTACTGAGCAGCCAAGAGACACTTATAATGGAATGTGAGAGCTTTGAAAATATTGTTGAGTTTCTTAAAAACACGCTACCTGATATGAATACCTCTGAAATGGAAAAAATTATTACCCAGGTTTTTGAGATGGATATTTCTAAGCAGTTGCATGCCTATGAGGTGGAATATCATGTGCTACAGGATGAGCTTCAGGAATCTTCATATTCCTGTGAGGATAGTGAAACTTTGGAGAAGCTGGAGAGGGCCAATAGCCAACTGAAAAGACAAAACATGGACCTCCTAGAAAAATTACAGGTAGCTCATACTAAAATCCAGGCCTTGGAATCAAACCTGGAAAATCTTTTGACGAGAGAGACCAAAATGAAGTCTTTAATCCGGACCCTGGAACAAGAAAAAATGGCTTATCAAAAGACAGTGGAGCAACTCCGGAAGCTGCTGCCCGCGGATGCTCTAGTCAATTGTGACCTGTTGCTGAGAGACCTAAACTGCAACCCTAACAACAAAGCCAAGATAGGAAATAAGCCATAATTGAAG(SEQIDNO22)AS160的新型同種型3的通過EditSeq(Lasergene)翻譯的氨基酸序列(SEQIDNO23)示于下列MEPPSCIQDEPFPHPLEPEPGVSAQPGPGKPSDKRFRLWYVGGSCLDHRTTLPMLPWLMAEIRRRSQKPEAGGCGAPAAREVILVLSAPFLRCVPAPGAGASGGTSPSATQPNPAVFIFEHKAQHISRFIHNSHDLTYFAYLIKAQPDDPESQMACHVFRATDPSQVPDVISSIRQLSKAAMKEDAKPSKDNEDAFYNSQKFEVLYCGKVTVTHKKAPSSLIDDCMEKFSLHEQQRLKIQGEQRGPDPGEDLADLEVVVPGSP⑶CLPEEADGTDTHLGLPAGASQPALTSSRVCFPERILEDSGFDEQQEFRSRCSSVTGVQRRVHEGSQKSQPRRRHASAPSHVQPSDSEKNRIMLFQVGRFEINLISPDTKSVVLEKNFKDISSCSQGIKHVDHFGFICRESPEPGLSQYICYVFQCASESLVDEVMLTLKQAFSTAAALQSAKTQIKLCEACPMHSLHKLCERIEGLYPPRAKLVIQRHLSSLTDNEQADIFERVQKMKPVSDQEENELVILHLRQLCEAKQKTHVHIGEGPSTISNSTIPENATSSGRFKLDILKNKAKRSLTSSLENIFSRGANRMRGRLGSVDSFERSNSLASEKDYSP⑶SPPGTPPASPPSSAWQTFPEEDSDSPQFRRRAHTFSHPPSSTKRKLNLQDGRAQGVRSPLLRQSSSEQCSNLSSVRRMYKESNSSSSLPSLHTSFSAPSFTAPSFLKSFYQNSGRLSPQYENEIRLMEKGEKGPHLPAAMSP.VWEEPLSLLAGSPGGSAFSSGLLLP.TNLPQQCNSKMDWTGTSCCHCPPSLQPWRRNRWLYSCLGRMTQKRLKKERNQKN.GACGEKLYTNKSCYFEffKKKTRNLKQAEMNSSPEKLN.TMKKLVHVRKRS..LGIRSC.TAELKSDVIWKIFILFLKKEFPKVDEEKFGSFWLYSTDSDTDCLINNSLLTYPIRNF.SSSLLSSMRFSWI.EGRFLLTLTFQYSLGQDSCHCLTS.KPILCffTKKffDTVRGSALffLESCFCT.VKSKPLKC.NSSCMTSASASSTDLT.CRCRFKCTSCPGSFMTITEISTITLKKMKSAPVFMLPPGSSHCLPLSFH.DL.PEFLILFFFRELKLYSRLHSAY.AAKRHL.WNVRALKILLSFLKTRYLI.IPLKWKKLLPRFLRWIFLSSCMPMRWNIMCYRMSFRNLHIPVRIVKLWRSWRGPIAN.KDKTWTS.KNYR.LILKSRPffNQTffKIF.RERPK.SL.SGPffNKKKffLIKRQffSNSGSCCPRML.SIVTCC.ET.TATLTTKPR.EISHN.(SEQIDNO23)術語“AS160樣蛋白質”是指AS160的同種型2或3的兩個或任一個。術語“AS160的同種型2”是指其基因是AS160基因的天然發生的變體的蛋白質，在所述基因中缺失外顯子11和12。術語“AS160的同種型3”是指其基因是AS160基因的天然發生的變體的蛋白質，在所述基因中與全長AS160相比較缺少外顯子12。此外，如果將AS160樣蛋白質的序列與AS160的序列相比較，短的錯配可存在于AS160樣蛋白質。短的錯配意味著涉及達到5個毗連的氨基酸，優選達到4個，更優選達到3個，更優選達到2個，最優選達到1個毗連的氨基酸的添加、缺失或置換。在天然發生的AS160樣蛋白質內，與AS160相比較，可以存在達到5個添加、缺失和/或置換，優選達到4個，更優選達到3、2或1個添加、缺失和/或置換。示例性缺失和置換是上面提及的缺失和置換，即在對應于由人AS160基因的nt2594-2596編碼的位置的位置上1個氨基酸的缺失，或在對應于由人AS160基因的nt3827-3829編碼的位置的位置上的置換(例如Ala—Val)。要指出的是期望AS160樣蛋白質或編碼其的核酸還可來自除了人以外的物種，包括但不限于哺乳動物，例如猴子、嚙齒類動物(例如，小鼠或大鼠)、狗、貓、牛、豬、馬、綿羊、山羊；或禽類例如雞；或兩棲類動物，例如蛙；然而，哺乳動物或人氨基酸和核酸序列是優選的。對應于本文中指定的人序列的位置的非人物種的AS160或AS160樣蛋白質序列中的位置可通過本領域技術人員已知的序列比對來確定。在本發明的一個實施方案中，AS160樣蛋白質包含下述或由下述組成天然發生的AS160樣蛋白質的序列(例如SEQIDNO:3或SEQIdNO23)和C-和/或N-末端添力口，例如與如下文所示的蛋白質異源的最多30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個氨基酸的短C-和/或N末端序列。因此，特征“AS160樣蛋白質”涉及，例如1)由包含或具有與根據SEQIDNO1或SEQIDNO22的核酸序列90%或更多，優選95%或更多，更優選97%或更多，更優選99%或更多的序列同源性的核酸編碼的蛋白質，2)由包含或具有根據SEQIDNO:1或SEQIDNO22的核酸序列的核酸編碼的蛋白質，或3)由在嚴格條件下與具有根據SEQIDNO:1或SEQIDNO22的核酸序列的核酸雜交的核酸編碼的蛋白質，或4)具有根據SEQIDNO:3或SEQIDNO23的氨基酸序列的蛋白質，或5)具有與SEQIDNO:3或SEQIDNO23的95%或更多，優選97%或更多，更優選98%或更多，更優選99%或更多以及優選99.5%或更多的序列同源性的氨基酸序列的蛋白質，6)具有已知的AS160的氨基酸序列(優選，人AS160的氨基酸序列和更優選根據序列NM_014832(參見EMBL數據庫)的AS160的氨基酸序列)但當與該AS160氨基酸序列相比較時缺少氨基酸600至800，優選缺少氨基酸650至770，更優選缺少氨基酸670至750，更優選氨基酸675至745和最優選缺少氨基酸678至740的蛋白質，或7)具有已知的AS160的氨基酸序列(優選，人AS160的氨基酸序列和更優選根據序列NM_014832(參見EMBL數據庫)的AS160的氨基酸序列)但缺少由外顯子12編碼的氨基酸(優選缺少氨基酸733至740)的蛋白質，8)如上在1至7下所定義的AS160樣蛋白質之一的功能性片段或功能性衍生物，上述蛋白質優選具有至少一個如上和如下說明的AS160樣蛋白質的功能性特征。片段是當與全長蛋白質相比較時，攜帶1個或更多個的末端(η-和/或C-末端)或內部缺失(1個、2個或更多個氨基酸的缺失)的蛋白質。蛋白質的功能性片段是該蛋白質的任何片段，其具有至少一個，以及優選2個或更多個全長蛋白質的功能性特征。術語蛋白質的衍生物與天然發生的形式相比較(在本申請上下文中，特別地與根據SEQIDNO3或SEQIDNO23的AS160樣相比較)包含非缺失的任何類型的蛋白質修飾。蛋白質的功能性衍生物是該蛋白質的任何衍生物，其具有至少1個，以及優選2個或更多個未修飾的蛋白質的功能性特征。本發明還包括AS160樣蛋白質的片段的功能性衍生物。氨基酸或核酸序列的同源性的測定可以例如通過使用程序GAP(GCGProgramPackage,GeneticComputerGroup1991)或本領域內已知的任何其他程序來進行。分離的多核苷酸和寡核苷酸可用于在不同嚴格性條件下雜交。當兩個分子的單鏈形式在適當的反應(“退火”或雜交)條件(取決于周圍介質的溫度和離子強度)下可退火形成新的雙鏈核酸分子時，核酸分子可與另一個核酸分子雜交。雜交需要兩個退火的核酸分子包含互補序列。取決于選擇的退火條件，嚴格性條件，有可能發生堿基間的錯配而不阻止雙鏈形成。術語嚴格性描述了影響兩個單鏈核酸分子的雜交的特異性或退火的反應條件。嚴格性，和從而反應的特異性取決于用于反應的溫度和緩沖液條件等嚴格性，并且因此特異性可以例如通過增加反應溫度和/或降低反應緩沖液的離子強度來增加。用于核酸雜交的適當的嚴格性條件取決于核酸的長度、類型和它們的互補程度。可變因素在本領域內是已知的。兩個退火核酸序列之間的相似性或同源性的程度越大，則具有這些序列的核酸的雜交產物的解鏈溫度越高。核酸雜交的相對穩定性依賴形成雙鏈的單鏈核酸的類型RNA:RNA>DNA:RNA>DNAiDNA0對于長度大于100個核苷酸的雜交產物，用于計算解鏈溫度的公式在本領域內是已知的。對于更短的雜交產物(例如，寡核苷酸)，解鏈溫度的計算取決于長度，其中錯配變得更重要。例如，如果雜交在室溫下于2xSSC溶液中進行，則低嚴格性(和從而低反應和雜交特異性)的條件存在。高嚴格性條件包括例如在68°C下于0.IxSSC和0.SDS溶液中的雜交反應。在本發明的上下文中，術語“在嚴格性條件下雜交”是指進行雜交反應和隨后的清洗過程的條件，在該條件下具有一定互補性的核苷酸序列通常保持雜交。對于給定的核酸組的這樣的條件的選擇在普通技術人員的能力范圍內，適當的方案可見于關于標準方法的熟知的文獻例如"CurrentProtocolsinMolecularBiology，，，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989),6.3.1至6.3.6中。在本發明的不同方面內的嚴格性條件下的雜交優選理解為將標記的探針與待分析的核酸樣品在65°C下，或在寡核苷酸探針的情況下，在比由寡核苷酸和樣品組成的雙鏈體的退火或解鏈溫度(退火和解鏈溫度在下面理解為同義詞)低5°C下于50mMTrispH7.5、IMNaCl、1%SDS、10%硫酸葡聚糖，0.5mg/ml變性的鮭精或鯡精DNA中雜交過夜。在室溫下于2xSSC中清洗10分鐘。在65°C(或在寡核苷酸的情況下比退火溫度低5°C)下于lxSSC/0.1%SDS中清洗30分鐘。在65°C(或在寡核苷酸的情況下比退火溫度低5°C)下于0.lxSSC/0.1%SDS中清洗30分鐘。在一個實施方案中，AS160樣蛋白質由包含、基本上由或由SEQIDNO:1或SEQIDNO:23的序列組成的核酸編碼。“基本上由......組成”涉及編碼蛋白質的核酸，所述蛋白質由SEQIDNO:1或23編碼的序列和短C-和/或N-末端序列組成，所述段C-和/或N-末端序列為與蛋白質同源或異源的至多30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1個氨基酸。這些序列可因遺傳操作例如特定限制性位點的使用而產生，或可以是純化蛋白質所需要的，例如標簽例如His-標簽、Strep-標簽、Arg-標簽、c-myc-標簽或Flag-標簽。特征“異源氨基酸”或“與蛋白質異源的氨基酸”是指任何氨基酸，所述氨基酸與位于緊鄰天然發生的AS160樣蛋白質、AS160蛋白質或其剪接變體的氨基酸不同。因此，包含至少1個異源氨基酸的AS160樣蛋白質是指與任何天然發生的AS160蛋白質或其剪接變體不同的蛋白質。新型AS160樣蛋白質的功能性特征可以是本文中詳細說明的AS160樣蛋白質的任何特征。此類功能性特征的實例包括但不限于例如其組織分布、其在胰島素刺激的信號轉導調控中的參與(所述調控例如胰島素刺激的葡萄糖攝入的調控、尤其是刺激；AS160和AKT的磷酸化的調控、尤其是刺激；PI3K(PI3激酶)和MEKK/ERK激酶的活性的調控，尤其是刺激；GLUT4至質膜的轉運的調控、尤其是刺激)、AS160樣蛋白質與其他蛋白質的相互作用(例如AS160樣蛋白質和GLUT4的相互作用)以及任何其他其的功能性特征，特別地如本申請的上下文和下面所示的實驗結果中所描述的特征。根據優選實施方案，檢測系統在細胞中。基于細胞的系統是有利的，因為其允許通過繁殖細胞容易地擴增檢測系統，并且允許細胞機制例如胰島素的下游或AS160樣蛋白質的下游或上游的信號轉導組分，因為這些可用于檢測指示改變的細胞的葡萄糖攝入的信號。適合于本發明的背景的細胞的實例包括但不限于L6細胞、3T3脂肪細胞、HEK293、745-A、A-431、心房肌細胞、BxPC3、C5N、Caco-2、Capan-1、CC531、CFPAC、CHO,CHOΚΙ、C0S-1、C0S-7、CV-I、EAHY,ΕΑΗΥ926、F98、GH3、GP&envAM12、H-295R、Η-4-ΙΙ-Ε、HACAT,HACATA131、HEK、HEL、HeLa、H印G2、HighFive、Hs766T、HT29、HUV-ECR24、HUV-EC-C、IEC17、IEC18,Jurkat,K562、KARPAS-299、L929、LIN175、MAt-LYLU、MCF-7、MNEL、MRC-5、MT4、N64、NCTC2544、NDCKII、Neuro2A、NIH3T3、NT2/D1、P19、原代神經元細胞、原代樹突細胞、原代人或哺乳動物成肌細胞、原代脂肪細胞、原代角質形成細胞、SF9、SK-UT-1、ST、Sff480、SWU-20S、U-373、U-937、橫紋肌肉瘤(RD)和Y_l。其他適當的細胞對于本領域技術人員來說是已知的。然而，優選檢測系統在胰島素依賴性組織(例如脂肪組織、肝、骨骼肌、心肌、血管平滑肌和活性乳腺，優選骨骼肌、脂肪或肝)的細胞中，因為這些細胞是哺乳動物體內的主要胰島素依賴性細胞類型。特別適合的細胞包括骨骼肌細胞、脂肪細胞和/或肝細胞，因為此類細胞在2型糖尿病相關組織中可能最好地反映對物質的應答。直接從動物或人培養的細胞已知為原代細胞。除了一些來源于腫瘤的細胞系外，大多數原代細胞培養物具有有限的生命期。在一定次數的群體倍增后，細胞經歷衰老過程并停止分裂，盡管通常保持存活力。已建立的或無限增殖化的細胞系已通過隨機突變或有意修飾例如人工表達端粒酶基因獲得無限增殖的能力。存在許多代表特定細胞類型的良好建立的細胞系并且選擇適當的細胞系在技術人員的知識范圍之內。因此，在本發明的優選實施方案中，細胞是細胞系。細胞系是在培養中增殖的細胞群體，其來源于單個共同的祖先細胞，從而在遺傳上與共同的所述祖先細胞一致。優選細胞系是L6細胞(參見實施例)、HEK293細胞(原代人胚腎)、3T3細胞(鼠胚成纖維細胞)、CHO細胞(中國倉鼠卵巢)、C0S-7細胞(非洲綠猴細胞系)、HeLa細胞(人上皮樣宮頸癌)、JURKAT細胞(人T-細胞白血病)、BHK21細胞(倉鼠正常腎，成纖維細胞)和MCF-7細胞(人乳腺癌)。優選骨骼肌、肝或脂肪組織的細胞系包括但不限于骨骼肌L6細胞(也參見實施例)、C2C12(小鼠)，優選DSMACC2853(參見下面)。脂肪組織3T3脂肪細胞、棕色脂肪細胞細胞系ΗΙΒ-1Β)，品系F44-2A、美國專利6，071，747中公開的細胞系。肝:BNLCL.2(小鼠，BALB/c)、BNLSVΑ.8(小鼠)、RLC-18(大鼠)WRL68。特別優選細胞系(L6-GLUT4myC-tetR-AS160樣)(其包含處于四環素響應啟動子系統控制之下的編碼AS160的同種型2的基因)于2007年6月20日在國際承認用于專利稈序的微牛物保存布汰佩斯條約下以登錄號DSMACC2853(稱為L6-GLUT4myc_tetR-AS160樣)保藏在"DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，，(DSMZ),Inhoffenstra^e7B,38124Braunschweig，GERMANY。為了篩選AS160樣蛋白質，和特別地AS160的同種型2介導的效應，可將使用上述細胞系獲得的結果與使用相同的但缺乏編碼AS160樣蛋白質的基因的導入的細胞系(L6-GLUT4myc-tetR)(該細胞系也于2007年6月20日在國際承認用于專利稈序的微牛物保存布汰佩斯條約下以登錄號DSMACC2852(稱為L6-GLUT4myc-tetR)保藏在“DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，，(DSMZ),Inhoffenstra^e7B,38124Braunschweig,GERMANY)獲得的結果相比。已如實施例2中所述制備兩種細胞系(L6-GLUT4myc-tetR_AS160樣和L6-GLUT4myc-tetR)。簡而言之，從pCDNA3.1(+)/TR(Invitrogen)分離四環素阻抑物(TR)，將其克隆入圖3中所示的pIRESpuro2的NheI和NotI位點以獲得pIRESpuro2/TR，將pIRESpuro2/TR轉染入穩定表達GLUT4myc的L6細胞(大鼠骨骼肌細胞)(L6_GLUT4myc，描述于Wang等1998中)。對于L6-GLUT4myc_tetR-AS160樣細胞，額外地將包含AS160的同種型2基因的pCDNA5載體(Invitrogen)導入細胞。類似地，可按照本領域技術人員已知的標準方案使用相似的方法制備表達AS160樣蛋白質的同種型3的細胞系。關于培養，可將細胞系于細胞培養箱中培養并且維持在適當的溫度下和氣體混合物(通常，37°C，5%CO2)中。培養條件對于每一種細胞類型來說變化很廣泛，用于特定細胞類型的條件的變化可導致不同的表達的表型。除了溫度和氣體混合物以外，培養系統中最常改變的因素是生長培養基。生長培養基的配方可在PH、葡萄糖濃度、生長因子和其他營養成分的存在上發生改變。還可向生長培養基中加入抗生素。其中對培養細胞進行的常見操作是培養基更換和傳代細胞。然而，適當條件的選擇對于本領域技術人員來說是已知的。細胞或細胞系可被遺傳改造從而包括本發明的檢測系統。檢測系統可位于瞬時或穩定轉染的細胞或細胞系中。用于將轉基因導入受體細胞的方法稱為轉染。使用DNA的轉染產生穩定的以及不穩定的(瞬時的)細胞或細胞系。瞬時細胞系反映轉染的DNA以染色體外形式存在；穩定的細胞系由至基因組內的整合產生。可通過對于本領域技術人員來說是已知的和經改造適合于各細胞類型的許多方法將轉基因導入細胞。本領域熟知的用于導入和表達核酸分子的重組DNA克隆技術可用于導入和表達轉基因。可使用任何適當的方法，包括病毒載體、化學轉染劑、電穿孔、磷酸鈣共沉淀和DNA的直接擴散來轉染細胞。用于將檢測系統導入受體細胞的的適當的方法詳述于實施例2中并且可經改造以適用于各受體細胞。如本文中所使用的，載體是將轉基因運至細胞的物質，其可包含適當的轉錄和翻譯控制信號例如啟動子。載體可以是質粒、病毒或本領域已知的其他載體。啟動子可以是誘導型或組成型啟動子，一般(general)或細胞特異性啟動子，核或細胞質特異性啟動子。啟動子、載體和其他元件的選擇是在本領域普通技術人員的水平以內的常規設計問題。許多此類元件描述于文獻中并且可通過商業提供者獲得。通常，轉移的方法包括選擇標記至細胞的轉移。適當的啟動子和載體公開于實施例和本說明書中。通常，利用任何上述方法轉染細胞系，其中轉基因與選擇標記有效連接。在轉染后，在富集培養基中培養細胞例如進行數天，然后變換到選擇培養基中。轉染的細胞展現對選擇的抗性并且能夠生長，然而未轉染的細胞通常死亡。選擇標記的實例包括嘌呤霉素、zeocin、新霉素(Iieo)和潮霉素B(其分別賦予對嘌呤霉素，zeocin,氨基糖苷G-418和潮霉素的抗性)，和/或實施例中所使用的任何選擇標記。然而，本領域技術人員已知的其他選擇方法也可以是適合的。在本發明的方法的步驟b)中，通過檢測指示改變的細胞的葡萄糖攝入的信號將測試物質鑒定為改變細胞的葡萄糖攝入的物質。信號可以是指示改變的細胞的葡萄糖攝入的任何適當的信號；然而，信號可以是與AS160樣蛋白質相關的胰島素刺激的信號轉導的任何組分或部分。特別地，其可以是AS160或AKT的磷酸化程度、PI3K(PI3激酶)或MEKK/ERK激酶的活性、GLUT4至質膜的轉運或細胞的葡萄糖攝入的增加。用于測量AS160樣蛋白質信號轉導途徑的前述組分的適當方法在本領域內是已知的并且也在實施例中進行了詳述。優選，可檢測的信號是在細胞中表達的AS160樣蛋白質(同種型2和/或3)的量、磷酸化的ΑΚΤ、磷酸化的AS160樣蛋白質、GLUT4至質膜的轉運、GLUT4在細胞中的分布或細胞對葡萄糖的攝入。如可在實施例中所顯示的，所有這些信號都與細胞，優選胰島素敏感性組織的細胞的葡萄糖攝入相關。可檢測信號可以是細胞中AS160樣蛋白質的量，因為該蛋白質的量指示葡萄糖的攝入。如果該蛋白質的量增加，細胞特別是胰島素敏感性細胞的葡萄糖攝入也增加。測定特定蛋白質的量的方法對于本領域技術人員來說是已知的，其包括例如Western印跡法和使用特異性抗體的檢測，可如實施例中所述進行所述方法。實施例中也提供了特異性抗體。備選地，抗AS160樣單克隆或多克隆抗體可根據本領域技術人員的知識來產生，和利用酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)和熒光激活細胞分選術(FACS)來檢測。本領域內已知的許多其他技術可用于定量給定的蛋白質的量。此類技術包括但不限于免疫學技術例如ELISA或RIA或定量分析技術例如分光術或火焰色譜法(flamechromatography)。備選地，可通過雜交法或核酸擴增法測量AS160樣-mRNA的量而非蛋白質的量。此類方法對于技術人員來說是已知的，其包括斑點雜交法、Northern雜交法或RT-PCR法。備選可檢測的信號可以是磷酸化的AKT和/或磷酸化的AS160樣蛋白質的量，因為此類蛋白質的磷酸化程度指示葡萄糖的攝入。如果磷酸化的量或程度增加，則細胞特別是胰島素敏感性細胞的葡萄糖攝入也增加。測定磷酸化的量或程度的方法對于技術人員來說是已知的并且包括此類磷酸化蛋白質的特異性抗體的使用，如實施例中所描述的。其他可檢測信號可以是GLUT4至質膜的轉運或GLUT4在細胞中的分布，因為GLUT4的轉運程度指示葡萄糖的攝入。如果質膜中GLUT4的量增加，則細胞，特別是胰島素敏感性細胞的葡萄糖攝入也增加。測定GLUT4至質膜的轉運或GLUT4在細胞中的分布的方法對于技術人員來說是已知的并且包括在胞內Western技術或ACUMEN技術中使用myc-標記的GLUT4。可如實施例中所述進行此類方法。備選地，細胞的葡萄糖攝入可以例如通過使用標記的葡萄糖或標記的葡萄糖衍生物來測定。適當的標記包括例如可檢測的標簽、放射性同位素例如3H或14C或熒光標記。此類標記的葡萄糖或標記的葡萄糖衍生物包括但不限于2-氟-2-脫氧-D-葡萄糖、2-脫氧[14C]葡萄糖和[14C]甲基葡萄糖。優選，使用放射性標記的2-脫氧葡萄糖。可如實施例中所述進行該方法。如上所述的，本發明的方法可用于物質在高葡萄糖條件下進行檢測，所述高葡萄糖條件更好地反映了糖尿病患者的狀況。高葡萄糖條件是具有升高的葡萄糖濃度的條件。人血中葡萄糖的正常/安全水平在3.5和7.SmM之間。因此，高葡萄糖條件是葡萄糖濃度高于正常水平的條件。具體地，用于本發明的方法的葡萄糖濃度可以是至少10mM，優選至少15mM,更優選至少25mM葡萄糖。使用本發明的方法檢測的物質可以是任何測試物質或任何化學性質的測試化合物。其可以是已知的用于除了2型糖尿病以外的疾病的藥物或藥劑。備選地，其可以是已知的但仍然不知具有療效的化合物。在另一個實施方案中，化合物可以是新型的或到目前為止未知的化合物。在另一個本發明的篩選方法的實施方案中，以化合物文庫的方式提供測試物質。化合物文庫包含多種化合物并且已經由任何多個來源匯集而成，包括化學合成的分子和天然產物，或已經通過組合化學技術產生。它們特別適合于高通量篩選。它們可包含特定結構的化合物或特定生物例如植物的化合物。在使用本發明的背景中，化合物文庫優選是包含蛋白質和多肽或小分子的文庫。有利地，在機器人系統(roboticssystem)(例如包括機器人涂板和機器人液體轉移系統，例如使用微觀流體的，即通道結構化的(charmelledstructured))中進行本發明的方法。在本發明的另一個實施方案中，以高通量篩選系統的形式進行方法。在這樣的系統中，有利地使篩選方法自動化和小型化；特別地其使用小型化的孔和受機制人控制的微觀流體。高通量篩選(HTS)是進行特別地用于藥物發現和與生物和化學領域相關的科學實驗的方法。HTS允許研究者在短時時內，通常通過現代機器人、數據處理和控制軟件、液體操作裝置和靈敏的檢測器的組合有效地進行數百萬個生物化學、遺傳學或藥理學檢測。通過該方法，人們可快速鑒定調節特定生物分子途徑的活性化合物；特別是改變細胞的葡萄糖攝入的物質。本質上，HTS使用在相對短的時間內收集大量關于許多物質對于特定靶的作用的實驗數據的方法。篩選，在該背景中，是可隨后將所有這些數據用于其的更大的實驗，其唯一目的通常是檢測科學假設。關于HTS，可將包含AS160樣蛋白質或編碼所述蛋白質的核酸的細胞接種在組織板，例如多孔板，例如96孔板中。然后將板中的細胞與測試物質接觸，進行足以刺激和產生如上定義的適當的可檢測信號的時間。測試物質在整個板上不同的孔之間可以是不同的。在允許產生信號的溫育時間過后，通過人工或利用機器對所有板上的孔進行測量。當研究者將使用顯微鏡檢查法(例如)尋找孔中測試化合物的變化，從而尋找計算機本身不能容易測定的作用時，可能必需進行人工測量。否則，專門的自動化分析機器可在孔上進行許多實驗(例如分析特定頻率的光)。在該情況下，機器例如以數值網格的形式輸出各實驗的結果，其中各數字映射獲自單個孔的值。依賴于該第一測定的結果，研究者可通過使用將與被鑒定為活性(即改變細胞的葡萄糖攝入)的物質相似的物質用于新測定板內在相同的篩選內進行追蹤觀察測定，然后再進行實驗以收集進一步的數據，對化合物的結構進行最優化以提高化合物對細胞的作用。自動化是HTS的有效性的重要因素。專業化的機器人通常在單個測定板從產生至最終的分析的整個時限中負責許多過程。HTS機器人通常可同時制備和分析許多板，從而進一步加速數據收集過程。本發明的另外的目的涉及用于鑒定提高葡萄糖至細胞內的攝入的物質的檢測系統，所述檢測系統包括編碼AKT底物160kDa樣蛋白質(AS160樣蛋白質)或其功能變體的基因；和提供基因的可控表達的誘導型啟動子，其中AS160樣蛋白質的激活產生可檢測的信號。要指出的是，該檢測系統的所有特征可如對于本發明的方法所詳細描述的那樣進行進一步定義。該檢測系統特別有用，因為其允許鑒定提高(即增加)細胞的葡萄糖攝入的物質或用作研究2型糖尿病的模型。AS160樣蛋白質和提供基因的受控表達的誘導型啟動子的組合使得能夠測定具有和不具有AS160樣蛋白質的相同細胞中的效應。因此，可將與不表達AS160樣蛋白質的細胞相比在表達AS160樣蛋白質的細胞中獲得的信號轉導的差異歸因于AS160樣蛋白質。由于AS160樣蛋白質可用于鑒定2型糖尿病(如上所詳述的)的新型潛在藥物或作為主要胰島素敏感性組織中的關鍵的蛋白質，因而此類檢測系統可用于獲得關于2型糖尿病的病理生理學和治療的新見解。優選，本發明的檢測系統位于細胞，特別地遺傳改造的細胞中。細胞可以是本發明的方法的上下文中公開的任何細胞。特別地，可將基因和/或啟動子導入遺傳改造的細胞。本發明的檢測系統包含提供基因的受控表達的誘導型啟動子。基因的受控表達意指在對檢測系統化學或物理刺激時表達可被誘導或阻抑，所述刺激可以如研究者或實驗者所期望的那樣被應用。啟動子代表了可與其他調控區(增強子、沉默子、邊界元件/隔離子)合作作用指導給定的基因的轉錄水平的至關重要的元件。誘導型啟動子在對特定化合物即誘導物(化學刺激物)的存在或對確定的物理條件例如升高的溫度(物理刺激)的響應中被激活。誘導型啟動子是基因工程中非常有效的工具，因為與其有效連接的基因的表達可根據需要被打開或關閉。存在系列化學調控的啟動子，包括其轉錄活性受醇、四環素、類固醇、金屬和其他化合物的存在或不存在調控的啟動子。物理調控的啟動子包括其轉錄活性受光和低溫或高溫的存在或不存在調控的啟動子。優選，化學調控的啟動子應當來源于在進化上遠離其中需要其作用的細胞的生物。因此，有待用于哺乳動物細胞中的啟動子大部分來源于生物體例如酵母、大腸桿菌(E.coli)或果蠅。具體的實例是醇調控的啟動子系統(醇脫氫酶I(alcA)基因啟動子和反式激活蛋白AlcR)；四環素調控的啟動子系統(四環素阻遏蛋白質(TetR)，四環素操縱子序列(tetO)，四環素反式激活融合蛋白(tTA)，其為TetR和單純皰疹病毒蛋白質16(VP16)激活序列的融合蛋白質，實施例2中公開的啟動子系統)；類固醇調控的啟動子系統(類固醇應答啟動子，例如，基于大鼠糖皮質激素受體(GR)的啟動子或基于人雌激素受體(ER)的啟動子)；或來源于酵母、小鼠和人的金屬硫蛋白質基因的金屬調控的啟動子。然而，誘導型啟動子優選是四環素誘導型啟動子，更優選實施例2中所述的啟動子系統。本發明的其他方面涉及包含AS160樣蛋白質的檢測系統用于鑒定改變，特別地提高葡萄糖至細胞內的攝入的物質的用途，如已在本方法的背景中對于本發明的檢測系統所詳細描述的那樣。所使用的檢測系統可如上面關于本發明的方法或檢測系統所述的那樣進行進一步詳細說明。也根據上述公開內容，AS160樣蛋白質可用于2型糖尿病的模型中，其中將相應地應用關于本發明的方法或檢測系統的上述詳細內容。本發明的其他實施方案涉及由或基本上由下述組成的多肽根據SEQIDNO3或23的氨基酸序列或根據SEQIDNO:1或22的序列所編碼的氨基酸序列。在另一個實施方案中，本發明涉及由或基本上由下述組成的多核苷酸根據SEQIDNO:1或22的多核苷酸序列或編碼根據SEQIDNO:3或23的多肽的多核苷酸序列。本發明的另一個實施方案涉及特異性結合下述多肽的抗體或其功能性片段，所述多肽由或基本上由根據SEQIDNO:3或23的氨基酸序列或根據SEQIDNO:1或22的序列所編碼的氨基酸序列組成。適當的抗體或其功能性片段的制備在本領域內是熟知的，例如，通過用AS160樣蛋白質或其片段(必要時在例如弗氏佐劑和/或氫氧化鋁凝膠存在的情況下)免疫哺乳動物，例如兔子(參見，例如，Diamond,B.Α.等(1981)TheNewEnglandJournalofMedicine=1344-1349)0隨后可使用熟知的方法從血液分離作為免疫反應的結果在動物中形成的多克隆抗體，并且例如，通過柱層析進行純化。產生單克隆抗體的適當的方法在本領域內也是熟知的(參見例如Winter，G.&Milstein，C.(1991)Nature，349，293-299和下面所列的關于標準方法的文獻)。在本發明的上下文中，術語抗體或抗體片段還包括重組抗體或其抗原結合部分，例如嵌合抗體、人源化抗體、多功能抗體、雙特異性抗體、寡特異性抗體或單鏈抗體或抗體F(ab)或F(ab)2片段(參見例如EP-B1-0368684，WO88/01649,WO93/06213,WO98/24884，US4，816，567或US4,816,397)。根據本發明的特異性抗AS160樣抗體在標準實驗室條件下(例如在Western印跡法等中)與AS160樣蛋白質的相互作用應當比與AS160的同種型1的相互作用更強。根據一個實施方案，特異性抗AS160樣抗體在標準實驗室條件下與AS160的新型同種型2(如本文中所鑒定的)的相互作用比與AS160蛋白質的同種型1或3中的一個或兩者的相互作用更強(即特異性AS160，同種型2抗體)。根據另一個實施方案，根據本發明的特異性抗AS160樣抗體在標準實驗室條件下與AS160的同種型3的相互作用比與AS160蛋白質的同種型1或2的一個或兩者的相互作用更強(即特異性AS160，同種型3抗體)。根據另一個實施方案，本發明涉及異源表達多肽的細胞或用多核苷酸穩定地或瞬時地轉染的細胞，所述多肽由或基本上由根據SEQIDNO:3或23的氨基酸序列或根據SEQIDNO:1或22的序列所編碼的氨基酸序列組成，所述多核苷酸由或基本上由根據SEQIDNO:1或22的多核苷酸序列或編碼根據SEQIDNO3或23的多肽的多核苷酸序列組成。細胞可以是能夠用核酸載體穩定或瞬時轉染的且能夠表達異源基因的任何原核或真核細胞。此類細胞主要包括原代細胞以及來自細胞培養物的細胞，優選真核細胞培養物(其包括來源于多細胞生物體和組織的細胞(例如HeLa、CHO,COS、SF9或3T3細胞)或來源于單細胞生物體例如酵母的細胞(例如粟酒裂殖酵母(s.pombe)或釀酒酵母(s.cerevisiae)))；或原核細胞培養物(優選畢赤酵母屬(Pichia)或大腸桿菌細胞)。來源于組織和樣品可利用熟知的技術例如血液采集、組織穿刺(tissuepunction)或外科手術技術獲得。本發明的另一方面涉及SiRNA(小抑制RNA)，其能夠負干擾任何AS160樣同種型2和/或3的表達和/或活性，例如對于SEQIDNO1或SEQIDNO.22的DNA序列的至少部分是特異性的或部分與其互補術語“siRNA”是指誘導RNA干擾(RNAi)途徑(關于RNAi干擾途徑，參見例如Elbashir等，GenesandDevelopment(2001)15188-200,Tuschl.等，(1999)，GenesandDevelopment,13:ρ·3191-3197或Zamore等，Cell(2000)第101卷，p.25-33)的小抑制RNA。在本發明的上下文中，術語“siRNA”包括兩條分開的鏈的雙鏈體以及可形成包含雙鏈體區域的發夾結構的單鏈，即所謂的shRNA-短發夾RNA。siRNA分子在長度上可不同(長度通常15至35、18至30或20至25個核苷酸)；然而，適當長度的選擇在本領域內是熟知的。此外，siRNA可在它們與在反義鏈中其靶mRNA的互補程度上發生變化。互補性的適當程度的選擇在本領域也是熟知的。siRNA可在有義鏈和/或反義鏈的5’和/或3’末端具有未配對的突出端堿基。針對給定的cDNA序列的siRNA的設計和制備在本領域是熟知的，參見，例如Elbashir等(2001)Nature411:494_498(關于siRNA的制備和siRNA至細胞內的轉染，特別地參見P.497，右欄)和Tuschl等(1999)GenesandDevelopment13:3191-3197)。siRNA的應用方法包括化學合成或體外轉錄的siRNA，例如雙鏈體或shRNA，所述siRNA隨后被轉染入或注射入細胞或轉基因動物。還可在細胞或轉基因動物中從表達載體或PCR產物表達siRNA，其中術語表達載體是指任何類型的用于驅動siRNA(雙鏈體或shRNA)的表達的載體系統，包括穿梭載體以及病毒，例如逆轉錄病毒載體和慢病毒載體，如本領域內所熟知的。根據另一個方面，本發明涉及AS160樣蛋白質(同種型2和/或3)或其核酸序列的用途，其用于產生能夠負干擾AS160樣蛋白質(同種型2和/或3)的表達和/或活性的siRNA(雙鏈體或shRNA)。下列圖和實施例將舉例說明本發明，但不應當被理解為限定本發明的范圍。附1顯示AS160的3種不同的同種型的比較。已基于定量RTPCR(Taqman)(對于同種型2使用引物SEQIDNO7、8、9)鑒定了新型AS160樣蛋白質(同種型2和新型同種型3)。全長AS160(使用引物SEQIDN019、20和21擴增的)描述于(A)中，缺少外顯子11和12的AS160樣蛋白質，同種型2描述于⑶中。同種型3示于(C)中(使用引物SEQIDNO16、17、18擴增的)。顯示了磷酸化位點Ser-588和Thr-642(下劃線標的)和錯配T202和T1275(斜體)。圖2(Α和B)顯示AS160同種型的表達(Taqman)。通過使用特異性引物(對于全長AS160而言引物SEQIDNO4、5、6和/或19、20、21，對于AS160樣使用引物SEQIDNO7、8、9以及對于同種型3使用引物16、17、18)檢查3種不同同種型的表達。針對內源RPL37amRNA(使用引物SEQIDNO10、11、12擴增的)的表達標準化AS160同種型的mRNA水平。數據代表5個不同人供體。圖3顯示克隆AS160的同種型2的克隆策略的示意圖。將來源于ρ⑶NA3.1(+)/TR的tet-阻抑物克隆入pIRESpuro2的NheI和NotI位點，從而產生pIRESpuro2/TR。圖4顯示L6_GLUT4myc細胞中AS160的同種型2的表達是tet-誘導型的。使用SDS-PAGE和western印跡分析法分析RIPA(放射性免疫測定)提取物。在多西環素不存在的情況下(_同種型2)或多西環素存在的情況下(+同種型2)溫育細胞48小時。用特異性AS160抗體(Upstate,CatNo.:07_741)檢測AS160樣的表達。圖5顯示在AS160的同種型2的表達存在或不存在的情況下，L6_GLUT4myc細胞中胰島素刺激的AKT激活。使用抗pAKT(Ser473)抗體(Biosource,CatNo.:44_621G)確認AKT在Ser473上的磷酸化。圖6顯示AKT和AS160的同種型2的磷酸化(胞內western)。在96孔板中進行胞內western分析。用多西環素預處理細胞48小時來誘導AS160的同種型2(+AS160的同種型2)表達。將胰島素溫育20分鐘。磷酸-AKT抗體(Biosource,CatNo.:44_621G)檢測AKT在Ser473上的磷酸化。磷酸-AS160抗體(BiosourceCatNo.:44_1071G)對于Thr642上的磷酸化位點是特異性的。標準偏差代表8個讀數點。*P值<0.OOlvs.-AS160樣。RU表示相對單位。圖7顯示AS160的同種型2對胰島素刺激的葡萄糖攝入的作用。測量響應胰島素的2-脫氧葡萄糖的攝入。將胰島素溫育20分鐘。標準偏差代表8個讀數點。<0.OOlvs.-AS160樣的同種型2值。圖8顯示葡萄糖攝入的劑量依賴性。觀察包含AS160的同種型2的L6_GLUT4myC細胞的2-脫氧葡萄糖的攝入的多西環素依賴性。將多西環素溫育48小時。將胰島素溫育20分鐘。標準偏差代表8個讀數點。圖9顯示AS160的同種型2對IGF-I和AICAR刺激的葡萄糖攝入的作用。測量響應IGF-I(A)和AICAR(B)的2-脫氧葡萄糖的攝入。將IGF-I溫育20分鐘。將AICAR溫育2小時。標準偏差代表4至8個讀數點。*P<0.05vs.-同種型2-值。圖10顯示AS160的同種型2對二甲雙胍(metformin)刺激的葡萄糖攝入的作用。測量響應胰島素(左)和二甲雙胍(右)的2-脫氧葡萄糖的攝入。在饑餓期間(3小時)溫育二甲雙胍，溫育胰島素20分鐘。標準偏差代表4個讀數點。*P<0.05vs.-AS160樣值，**P<0.OOlvs.-AS160樣值。圖11顯示AKT抑制劑的作用。通過SDS-PAGE分離10μgRIPA提取物，然后使用pAKT(Ser473)特異性抗體(Biosource，CatNo.:44_621G)通過western印跡法進行分析(A)。將細胞與渥曼青霉素(200nM;Upstate，CatNo.12-338)或AKT抑制劑Calb.(50μM,Calbiochem，CatNo.=124005)一起預溫育1小時，然后用胰島素(IOnM)刺激20分鐘。測量響應單獨的胰島素和AICAR以及渥曼青霉素加胰島素或AICR(Biomol)的組合的2-脫氧葡萄糖的攝入(B)。溫育胰島素20分鐘，溫育AICAR2小時。*P<0.OOlvs.-IOnmol胰島素。圖12顯示葡萄糖攝入的時間依賴性。在5、15、30分鐘后測量2-脫氧葡萄糖的攝入。為了誘導AS160樣蛋白質的表達，用多西環素預處理細胞，或不作處理。標準偏差獲自8個獨立的值。圖13顯示MEKK/ERK抑制劑對葡萄糖攝入的作用。用多西環素誘導AS160的同種型2的表達，進行48小時(+AS160樣)。饑餓細胞4小時。在饑餓培養基中溫育MEKK/ERK抑制劑U0126(10μΜ、20μM，UpstateCatNo.19-147)。然后，在指定的胰島素濃度下刺激細胞，進行20分鐘。*P<0.05vs.-AS160樣。圖14顯示胰島素抗性的誘導(葡萄糖攝入)。為了誘導胰島素抗性，在高葡萄糖和胰島素存在的情況下(右)溫育細胞過夜或在正常條件下(左)溫育細胞過夜。通過溫育多西環素進行48小時來進行同種型2表達的誘導。將胰島素溫育20分鐘。標準偏差代表8個讀數點。<0.05vs.-AS160的同種型2。圖15顯示胰島素抗性的誘導(胞內western)。為了誘導胰島素抗性，在高葡萄糖加胰島素存在的情況下溫育細胞過夜或在正常條件下溫育細胞。通過溫育多西環素48小時來進行同種型2表達的誘導。使用識別Ser473的抗體(BiosourceCatNo.:44_621G)測定AKT的活化。磷酸-AS160抗體直接針對Thr642位點。*P<0.05vs.在正常條件下的IOOnM胰島素。圖16顯示二甲雙胍對葡萄糖攝入的作用。用多西環素誘導所有孔中AS160的同種型2的表達，進行48小時。誘導胰島素抗性，進行過夜。將二甲雙胍(800μM)溫育過夜。使細胞饑餓4小時，然后用不同的胰島素濃度在指定的條件下進行刺激。*P<0.05vs.在無化合物下的適當的值。圖17顯示二甲雙胍對AKT和AS160，同種型1的磷酸化的作用(胞內Western)。用多西環素誘導所有孔中AS160的同種型2的表達，進行48小時。誘導胰島素抗性，進行過夜。將二甲雙胍(800μΜ)溫育過夜。使細胞饑餓4小時，然后用不同的胰島素濃度在指定的條件下進行刺激。RU表示相對單位。圖18顯示GLUT4轉運的分析(ACUMEN)。將細胞與多西環素一起溫育以誘導AS160樣蛋白質的表達或不作處理。將胰島素溫育20分鐘。標準偏差獲自8個單個的值。<0.05vs.L6-GLUT4-myc+100nM胰島素。#P<0.05vs.-AS160的同種型2+100nM胰島素。圖19顯示GLUT4分布(ACUMEN)的示意圖。基于在不同的條件后的激光掃描熒光細胞計量術獲得直方圖。曲線代表總細胞計數(DNA標記)。以淺灰色顯示的箭頭左邊的細胞對于myc-GLUT4染色是陰性的。以淺灰色顯示的箭頭右邊的細胞代表細胞群體，其展現被轉運在質膜上的myc-標記的GLUT4。圖20顯示用于從人睪丸cDNAPCR克隆AS160的同種型2的正向和反向引物在同種型2-編碼序列(SEQIDNO13)的DNA序列上游和下游上的位置。引物以粗體打印并且以虛線下劃標示；AS160樣編碼序列以實線下劃標示。圖21顯示在基礎和胰島素刺激的條件下myc-GLUT4和AS160的同種型2的細胞內定位的基于免疫熒光的分析。在處理以進行免疫熒光顯微鏡檢查之前將大鼠成肌細胞與胰島素(IOOnM)—起溫育20分鐘。實施例實施例1:AS160同種型在不同組織中的表達EST的生物信息學分析顯示存在3種AS160的同種型(圖1A、B、C)。圖1顯示AS160和鑒定的新型同種型的示意圖概述。使用定量RT-PCR在不同的組織中觀察這些不同AS160-同種型的表達。使用TaqmanPCR，利用特異性引物對(對于全長AS160SEQIDNO:4、5和6，(或備選地19、20和21)，對于AS160樣SEQIDNO:7、8和9，對于同種型3SEQNO:16、17和18)反轉錄和檢查可商購獲得的5個不同人供體的RNA。為此，將總細胞RNA的等分試樣進行第一鏈DNA合成。反轉錄的cDNA用作擴增的模板。使用共同的探針測定胰島素敏感性組織(脂肪、肌肉、肝、心臟、腦)中總ASieom表達。核糖體基因RPL37a(人(Homosapiens)核糖體蛋白質L37a，mRNA,cDNA克隆MGC26772)的內源mRNA表達用于標準化mRNA水平(SEQIDNO:10、11和12)。基于特異性引物對，可區分不同同種型的表達。利用5δCT法(Yuan等，2006)計算相對mRNA表達法。使用下列引物和探針特異性I-SEQ^IDNO~同種型1(全For5'-ATTCAGGTAGACTGTCCCCACAGTAT19長AS160)Rev5'-CCTTCTCCATCACTTGATTCTGAAG20探針FAM-MGBNFQ215‘-ATGAAATCAGACAAGACACTG~同種型2For5'-GCGTTCCCCTCTGCTGAG7(AS160-樣)Rev5'-ACTCATTGCTGCAGGTAGATGAG8<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>該RT-PCR的結果示于圖2中。同種型1(NM_014832_vl；EMBL)代表全長AS160。全長AS160以及同種型3主要在心臟和骨骼肌中表達(圖2A和B)。代表AS160樣的同種型2大部分在腎上腺和甲狀腺中表達，但也在肺、腎和腦中表達(圖B)。也在脂肪組織和肝中檢測到表達(圖2A)。與全長AS160和同種型3相比較，AS160樣只是少量地在骨骼肌中表達。數據可能表明不同同種型在不同組織中的特定功能。在下列實驗中，本發明者集中于同種型2(AS160樣)的檢查，因為其是新型的且在大多數組織中顯示最高的總體表達。實施例2新型AS160樣蛋白質表達構建體的克隆和四環素誘導型AS160樣蛋白質表達系統的建立使用根據圖21的引物(SEQIDs14禾口15)從人睪丸cDNA(Clontech，Cat#7117_l；Lot#2100009)擴增AS160樣插入片段(SEQIDNO:1)；所獲得的PCR片段(參見圖21，插入片段以下劃線標示)用作模板用于產生相應于具有用于克隆的gateway序列的編碼序列的片段。將插入片段克隆入PD0NR221(Irwitrogen)，然后通過標準方法克隆入表達載體PCDNA5-T0(Invitrogen)。序列分析顯示與全長AS160(NM_014832；EMBL)相比較，在AS160樣中缺少外顯子11和12(圖1)。在位置nt606(沉默)和nt3827(Ala—Val)上鑒定了兩個錯配。此外，該克隆包含也在人胎盤cDNA但非在人腦cDNA中發現的3bp缺失(nt2594-2596)。對于缺少外顯了11和12的同種型的表達克隆，重新修復該3bp缺失以使更能與ΝΜ_014832(EMBL)的全長序列相似。穩定地表達具有導向外表面(exofacially)的myc-標簽(GLUT4myc)的葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)的L6成肌細胞(大鼠骨骼肌細胞)(L6_GLUT4myC，描述于Wang等1998中)隨后用于AS160樣蛋白質的四環素(tet)誘導型表達。為此目的，使用來自Invitrogen的T-REx系統。該系統中的調控質粒控制處于CMV(巨細胞病毒)啟動子控制之下的tet-阻抑物(tet-R)的組成型表達。在四環素(或多西環素)不存在的情況下，阻抑物結合特異性四環素-操縱子序列(Tet02)，從而阻抑表達。四環素(或多西環素)的加入誘導了目的蛋白質的表達。為了使tet-系統能夠在L6-GLUT4myc細胞中穩定整合，從ρ⑶NA3.1(+)/TR(Invitrogen)分離tet-阻抑物，并且將其克隆入如圖3所示的pIRESpuro2的NheI和NotI位點。以下如SEQIDNO:2所示，給出pIRES-puro2/TetR的序列。序列pIRES-puro2/TetR(SEQIDNO2)GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCGATATCTGCGGCCTAGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTACCATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCCGCGTACAGCGGATCCCGGGAATTCAGATCTTATTAAGCGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGAATTAATTCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACAATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCCACAAGGAGACGACCTTCCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGTGCCCGAAGGACCGCGCGACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGACGCCCGCCCCACGACCCGCAGCGCCCGACCGAAAGGAGCGCACGACCCCATGGCTCCGACCGAAGCCGACCCGGGCGGCCCCGCCGACCCCGCACCCGCCCCCGAGGCCCACCGACTCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGAGTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC然后將pIRESpuro2/TR轉染入L6_GLUT4myc細胞。用0.5μg/ml嘌呤霉素(InvivoGen)選擇穩定地表達調控質粒的克隆。將含有AS160樣的L6_GLUT4myC細胞培養在補充有10%胎牛血清(FCS)(PAA，無tet)、2yg/ml殺稻瘟素(Calbiochem)、0.5μg/ml嘌呤霉素(InvivoGen)、200μg/ml潮霉素(Invitrogen)的MEMα(PAN)中。用四環素誘導型GFP表達質粒(pCDNA5/T0-GFP)控制tet-阻抑物的功能性。在四環素(或多西環素)不存在的情況下，只有少數細胞表達GFP。多西環素的加入使表達GFP的細胞的數量增加大約10倍(數據未顯示)。為了獲得AS160的同種型2的tet-誘導型表達，使用來自Invitrogen的含有AS160的同種型2的基因的pCDNA5載體。使用潮霉素(200μg/ml,Invitrogen)進行穩定克隆的選擇。通過western印跡分析，利用識別全長AS160和AS160的同種型2的AS160特異性抗體檢查AS160的同種型2的表達。用1μg/ml多西環素(Sigma)誘導AS160的同種型2的表達。通過加入多西環素(1μg/ml,Sigma)，然后進行western印跡分析來研究tet-阻抑物的功能性。對于所有實施例，將含有AS160的同種型2的L6_GLUT4myC細胞培養在補充有10%胎牛血清(FCS)(PAA,無tet)、2μg/ml殺稻瘟素(Calbiochem)、0.5μg/ml嘌呤霉素(InvivoGen),200μg/ml潮霉素(Invitrogen)的MEMa(PAN)。用1μg/ml多西環素(Sigma)誘導AS160的同種型2的表達。將L6-野生型(wt)(ATCC:CRL_1458)細胞培養在補充有10%FCS(PAA，無tet)和青霉素/鏈霉素(PAA)的MEMα+GlutaMax(Gibco)中。將L6-GLUT4myc細胞培養在補充有10%FCS(PAA,無tet)、1%青霉素/鏈霉素(PAA)和2μg/ml殺稻瘟素(Calbiochem)的MEMα+GlutaMax(Gibco)中。將所有細胞在37°C和5%CO2下培養。在進行各實驗之前將含有AS160的同種型2的L6-GLUT4myc細胞在饑餓培養基(MEMα)中溫育3至4小時。為了進行Western印跡分析，將蛋白質在SDS-PAGE凝膠(4-12%分離膠，Invitrogen)上分離，轉移至PVDF膜(Roche)，用Roti-Block(Roth)封閉1小時。將膜與一抗一起溫育過夜。抗AS160抗體來自Upstate。在TBST中清洗膜，將其與適當的第二辣根過氧化物酶綴合的抗體(SantaCruz)—起溫育。用LumiLight(Roche)顯現免疫反應條帶，并用Lumi-Imager(BiihringerIngelheim)進行檢測。tet-阻抑物的功能性的分析顯示AS160的同種型2只在多西環素存在的情況下表達(圖4)。為了檢查AS160蛋白質的同種型2在含有AS160樣的L6_GLUT4myc細胞中的四環素和胰島素依賴性表達，進行western印跡分析。如上所述，用1μg/ml多西環素誘導AS160樣蛋白質的表達，進行48小時。然后，用胰島素(5nM至50nM;Sanofi-AventiS)刺激所述細胞，進行20分鐘。如上所述，制備細胞提取物，利用SDS-PAGE分離，并轉移至PVDF膜。圖4顯示了含有AS160樣轉錄物的L6_GLUT4myc細胞中AS160樣蛋白質的多西環素誘導型表達的代表性western印跡。與胰島素的溫育誘導了AKT的磷酸化(Ser473)(圖5)。AS160的同種型2的表達對AKT的激活沒有作用。實施例3=AKT和AS160的磷酸化為了研究AKT和AS160的磷酸化，使用實施例2中所述的細胞。通過至關重要的基序(RXRXXS/T)上的磷酸化激活AS160。AS160中的已知的磷酸-位點是Ser570、Ser588、Thr642和Thr751(Sano等，2003)。負責AS160的激活的一個激酶是AKT(Kane等，2002)。為了測定AS160的同種型2的激活狀態，使用胞內western印跡技術。該方法使得能夠在96孔板中直接檢測特定蛋白質而無需制備細胞提取物。該測定中所用的特異性抗體識別AS160和AS160樣蛋白質的磷酸化的Thr642磷酸化位點。為此，將細胞接種入96孔板(黑色，Nunc)并且培養48小時。用含有2%馬血清(Cambrex)的MEMa(PAN)饑餓細胞，進行3至4小時。在移去培養基后，將細胞在3.7%新配制的多聚甲醛(Sigma)中固定20分鐘。用PBS+0.1%Triton-X-IOO透化細胞。使用Odyssey封閉緩沖液(Licor)在4°C下進行封閉過夜。在室溫下溫育一抗2小時。抗磷酸AKT(Ser473，CatNo.:44_621G)和抗磷酸AS160(Thr642，CatNo.:44_1071G)購自Biosource。在一抗溫育后，用PBS+0.1%Tween20清洗細胞。將第二抗兔-IgG-800-CW抗體(RocklandCatNo.:611_131_122)溫育1小時。為了檢測DNA，使用T0-PR03染料(MolecularProbes,CatNo.:T3605)。熒光信號(圖6)以相對單位(RU)表示。作為對照，在相同實驗設置中測定AKT在Ser473上的劑量依賴性磷酸化/激活。胰島素以劑量依賴性的方式誘導AKT磷酸化及AS160的全長或同種型2的磷酸化(圖6Α和B)。在無AS160樣蛋白質的多西環素誘導型表達的細胞中未觀察到AS160或AS160蛋白質的同種型2的磷酸化。實施例4:AS160蛋白質的同種型2對葡萄糖攝入的作用為了檢查細胞的葡萄糖攝入，將各細胞涂板在96孔Cytostar-T閃爍微量滴定板(Amersham)中。在48小時后，對細胞進行血清饑餓(3_4小時)，然后如所指定的用抑制劑進行處理。如已描述的(Voss等，2005)的那樣進行2-脫氧葡萄糖(0.0IMBq/孔，Amersham)的攝入。在40μM松胞菌素B(Calbiochem)存在的情況下測定非特異性攝入。從所有其他值中減去該值。在WallacMicrobeta計數器(PerkinElmer)中進行測量。2_脫氧葡萄糖的攝入被表示為每百萬計數(countspermillion)(cpm)。檢查響應胰島素的表達AS160的同種型2的L6_GLUT4myC細胞中2_脫氧葡萄糖的攝入(圖7)。數據顯示在用胰島素(50nM的胰島素濃度)刺激后，AS160的同種型2的表達使葡萄糖的攝入增加至高達4倍。在AS160的同種型2的表達不存在情況下，胰島素誘導葡萄糖攝入達到最大2倍。多西環素以劑量依賴性的方式在此類細胞中誘導葡萄糖攝入的增加(圖8)，所述劑量依賴性方式的多西環素與AS4160蛋白質的同種型2的水平相關。根據文獻，已知IGF-I(胰島素樣生長因子，R&D系統，CatNo.:291_G1)和AMPK(5-AMP-激活的蛋白質激酶)激活物AICAR(5-氨基咪唑-4-氨甲酰1-β-D-呋喃核糖苷(ribofuranoside)，BiomolCatNo.:E1_330)也刺激骨骼肌細胞中葡萄糖攝入(Ciaraldi等，2002)。因此，我們檢查了AS160的同種型2的表達對IGF-I和AICAR刺激的葡萄糖攝入的影響(圖9)。在AS160的同種型2不存在的情況下，與胰島素相比，用IGF-I刺激的細胞中的葡萄糖的攝入比在用胰島素(2倍)刺激后的更高(3倍)(圖9A)。用AICAR刺激的細胞中的葡萄糖的攝入比用胰島素刺激的細胞的攝入更低(1.5倍)(圖9B)。AS160蛋白質的同種型2的表達在用IGF-I刺激后進一步增加葡萄糖的攝入(達到5倍)，然而在用AICAR刺激后未觀察到AS160的同種型2的表達的額外效應。這些數據表明葡萄糖攝入的刺激可通過AMPK以不依賴于AS160的同種型2的方式發生和通過AKT以同種型2依賴性的方式發生。從而所述細胞系統可用于區分同種型2依賴性作用和不依賴于其的作用。實施例5二甲雙胍對葡萄糖攝入的作用二甲雙胍(二甲基二胍)在2型糖尿病中的降葡萄糖作用已得到良好地證明(Karlsson等，2005a)；然而，其確切作用機制依然不清楚，盡管已知其治療益處。我們檢查了在用不同濃度的二甲雙胍刺激后，AS160蛋白質的同種型2對葡萄糖攝入的作用，其中如上所述進行檢測(圖10)。與胰島素相比，AS160蛋白質的同種型2的表達對葡萄糖攝入沒有增加作用。該作用似乎可與在用AICAR刺激后觀察到的作用相比較。這些數據表明二甲雙胍_誘導的作用也是不依賴于AS160蛋白質的同種型2的，并且可能由AMPK介導。實施例6=AKT抑制劑的作用為了獲得導致AS160的同種型2的激活的信號級聯放大的更詳細的分析，使用兩種不同的抑制劑。渥曼青霉素(UpstateCatNo.12-338)是已良好確定的化合物，已知其在PI3激酶(PI3K)的水平產生抑制作用，隨后導致減少的AKT磷酸化，其傳導PI3激酶下游的信號(Okada等，1994)。所使用的第二化合物是1L-6-羥甲基-手性-肌醇2-(R)-2-0-甲基-3-0-十八烷基碳酸酯(縮寫為AKT抑制劑Calb.；CalbiochemCatNo.124005)。該化合物被描述為只微弱地干擾PI3K的AKT的選擇性抑制劑(Hu等，2000)。如所預期的，Western印跡分析顯示渥曼青霉素完全消除了AKT(Ser473)的磷酸化(圖11A)。AKT抑制劑Calb.對AKT(Ser473)的磷酸化沒有作用(圖11A)。為了檢查AKT抑制劑Calb.的功效，需要進行AKT下游的信號傳導分子的分析，因為AKT的磷酸化可能不與AKT的活性直接相關。使用來自Biosource的磷酸-特異性抗體(CatNo.:44_621G)檢測AKT在Ser473上的磷酸化。渥曼青霉素也能夠完全消除表達AS160的同種型2的L6_GLUT4myC細胞的葡萄糖攝入，然而AICAR刺激的細胞的葡萄糖攝入幾乎保持未變(圖11B)。到目前為止，葡萄糖攝入過程似乎由PI3K-AKT信號傳導途徑介導。實施例7表達AS160的同種型2的L6-GLUT4_myC細胞的葡萄糖攝入的時間依賴性AS160的同種型2促成提高的葡萄糖攝入的貢獻可能是GLUT4至質膜的轉運的加速、膜上更高的GLUT4蛋白質總量或受損的內吞作用。為了闡明該機制，在誘導或不誘導AS160的同種型2的情況下在表達AS160的同種型2的細胞中進行葡萄糖攝入的時間依賴性分析。研究在3個不同時間點(5、15、30分鐘)上葡萄糖攝入。用兩個不同胰島素濃度(10nM,50nM)刺激細胞。圖12顯示在用50ηΜ胰島素刺激5分鐘后，已觀察到葡萄糖攝入的最大值。未檢測到表達AS160的同種型2的L6-GLUT4myc細胞與無AS160的同種型2表達的細胞之間的差異。這些數據表明AS160的同種型2在檢查的時間點內不加速葡萄糖攝入。在AS160的同種型2存在的情況下增強的葡萄糖的攝入的另一個潛在原因可能是增加的GLUT4在質膜上的量。GLUT4的轉運是葡萄糖攝入的誘導中的至關重要的事件。實施例8:MEKK/ERK抑制劑U0126的作用為了研究促分裂原活化激酶(MAPK)在骨骼肌細胞中在胰島素信號轉導的負調控中以及對胰島素抗性的貢獻中的作用，我們檢查了常用MEKK/ERK抑制劑U0126(UpstateCatNo.:19-147;DeSilva等，1998)對葡萄糖-攝入的作用。細胞與MEKK/ERK抑制劑υ0126(10μΜ，20μΜ)的溫育顯示在用5ηΜ胰島素進行另外的刺激后葡萄糖的攝入顯著增力口。該作用主要在表達AS160的同種型2的細胞中發生(圖13)。該發現表明MEKK/ERK激酶在所使用的細胞模型中也以同種型2依賴性方式負影響胰島素信號傳導和葡萄糖攝入。J.Zierath小組(Bouzakri和Zierath，2007)最近公布了關于TNF-α誘導的胰島素抗性細胞模型的相似數據，其推測，尤其地MAPK4的沉默可以是恢復骨骼肌細胞中適當的胰島素信號傳導的新方法。實施例9胰島素抗性細胞模型的建立由于在II型糖尿病中外周胰島素抗性變成內在性的，因此我們著眼建立基于細胞的胰島素抗性模型，該模型使得能夠研究胰島素抗性的分子基礎并且同時使得能夠開發恢復胰島素敏感性的策略。已對脂肪細胞(Nelson等，2002；Greene等，2001)和L6肌管(Walgren等，2003)良好地建立了基于細胞培養的胰島素抗性模型。在該模型中，在高葡萄糖/胰島素條件(25mM葡萄糖+IOnM胰島素)下培養細胞過夜以誘導胰島素抗性(Walgren等，2003)。與在正常葡萄糖條件(圖14，左)下培養的細胞相比較，用高葡萄糖和胰島素處理的細胞的葡萄糖攝入顯著減少(圖14，右)。AS160的同種型2的表達稍微提高了葡萄糖攝入，但不能恢復胰島素敏感性。胞內western印跡分析顯示同樣在高葡萄糖+胰島素的條件下，AKT(Ser473，BiosourceCatNo.:44_621G)和AS160(Thr642,BiosourceCatNo.:44_1071G)仍然以劑量依賴性的方式被磷酸化(圖15)。然而與未處理的條件(正常Glc)相比，磷酸化信號被降低至72%。此外，檢查在高葡萄糖條件下二甲雙胍的作用。為此目的，在正常條件下以及平行地在高葡萄糖+胰島素條件(25mM葡萄糖+IOnM胰島素)下將二甲雙胍(800μM)溫育過夜。在所有孔中都誘導了同種型2-表達。圖16顯示在正常條件下二甲雙胍顯著增強基礎葡萄糖攝入。除了IOOnM胰島素外，使用不同胰島素濃度進行的額外刺激在正常條件下都沒有進一步提高葡萄糖的攝入，這表明二甲雙胍沒有致敏效應。在高葡萄糖+胰島素條件下，二甲雙胍顯著增加基礎葡萄糖攝入以及在使用5、10和50ηΜ胰島素刺激后的葡萄糖攝入(圖16，右)。然而，在胰島素抗性條件下，在二甲雙胍刺激后葡萄糖攝入的最大值不超過基礎水平，再次證明二甲雙胍在肌肉中的作用不依賴于胰島素刺激的葡萄糖處置(disposal)。在正常和胰島素抗性條件下AKT和AS160的磷酸化狀態的平行檢查顯示使用二甲雙胍處理細胞對AKT或AS160的活化沒有作用(圖17)。這些數據表明二甲雙胍介導的作用不依賴于AKT或AS160的活化。實施例10:GLUT4轉運的檢查雖然基于細胞的葡萄糖攝入具有非常好的重現性并且使得能夠進行化合物的高靈敏性篩選，但其仍有待改進以適用于高通量篩選(HTS)。該背景中的一個限速步驟是放射性標記的葡萄糖在攝入實驗中的使用。為了為該測定在HTS篩選中提供改進的基礎，我們檢查了增加的葡萄糖攝入與GLUT4至質膜的轉運之間的相關性。為此目的，使用適合于化合物篩選的技術。激光掃描熒光微量平板細胞計量術(Laser-scanningfluorescencemicroplatecytometry)(ACUMEN技術，LIT)使得會邑夠進行微量平板中單熒光細胞的不同的多參數分析(Bowen和Wylie，2006)。為了進行激光掃描熒光微量平板細胞計量術(Acumen)，將細胞涂板在96孔板(Biocat，black)中。如所示，處理血清饑餓細胞。簡而言之，將細胞在3.75%多聚甲醛(Sigma)中固定20分鐘。然后，用IOOnMNH4Cl進行猝滅。用足夠的封閉溶液封閉細胞，進行最少1小時。將一抗(單克隆抗-myc9E10,SantaCruz,sc-40)溫育1小時。在Sytox-orange存在的情況下溫育第二山羊_抗小鼠IgG(AlexaFluor488,MolecularProbes)，進行1小時(Bowen禾口Wylie，2006)。基于該高靈敏性方法，可能篩選不同的細胞數目來進行基于質膜的GLUT4-myc-展示。用DNA染料(SytoxOrange)復染細胞以確認相等的細胞數目。作為另外的對照，親代細胞系L6_wt和L6-GLUT4_myc包括在本實驗中。ACUMEN實驗顯示顯著增加的GLUT4至質膜的轉運(大約15%)(圖18)。如所預期的，在用單獨的IOOnM胰島素刺激后，已少量地誘導GLUT4轉運。轉運也在包含AS160樣表達盒的細胞中得到增加，但不被多西環素誘導。該現象很可能是由于滲漏啟動子造成的。利用激光掃描熒光微量平板細胞計量術(ACUMEN)獲得的GLUT4轉運的圖示示于圖19中。在這些直方圖中，曲線代表檢測到的用DNA標記(SytoxOrange)染色的細胞的總數。以淺灰色顯示的箭頭左邊的細胞不展現質膜結合的GLUT4。以淺灰色顯示的箭頭右邊的細胞代表細胞群體，其在質膜上展現myc-標記的GLUT4。實施例11:GLUT4和AS160的同種型2的定位將基于免疫熒光的分析用于檢測GLUT4-myc和AS160樣在大鼠成肌細胞系L6-GLUT4-myc-tetR-AS160樣中的定位。將細胞在無菌蓋玻片上培養于12孔板中。用多西環素處理48小時來誘導AS160的同種型2的表達。用IOOnM胰島素處理血清饑餓細胞20分鐘或不作處理。在刺激后，將細胞在3.75%多聚甲醛(Sigma)中固定20分鐘。然后，用0.1%的PBS中的TritonXlOO(IconBiomedicals)透化細胞，或不進行透化(如所示)，在室溫下進行5分鐘。透化過程使得能夠檢測細胞內定位的區室。在不透化細胞的情況下顯現膜結合蛋白質。在PBS+1%BSA(USB)中封閉細胞，進行最短時間1小時。將一抗(單克隆抗_myc，SantaCruz,sc-40和多克隆抗-ASieOUpstate)溫育過夜。所使用的二抗是檢測AS160的同種型2的抗-兔Alexa488和檢測GLUT4_myC的抗-小鼠A546。溫育進行1小時(黑暗處)。將細胞置于15μ1DakoCytomationFluorescentMounting培養基(DakoCytomation)中，通過使用LeicaDMIRE2的共聚焦激光掃描顯微鏡檢查法進行檢查，使用LeicaDMSDK軟件進行分析。獲得的圖示于圖21中。數據表明在基礎條件下，AS160的同種型2和GLUT4_myC都定位在細胞的核周區室中。胰島素剌激(IOOnM)誘導GLUT4-myc至質膜的轉運。AS160蛋白質的同種型2仍保留在核周區室中。參考文獻表BouzakriiK.禾口Zierath，J.R.(2007).MAP4K4genesilencinginhumanskeletalmusclepreventsTNF-alpha-inducedinsulinresistance.JBiolChem.282,7783-7789Bowen,W.P.禾口Wylie，P.G.(2006).Applicationoflaser-scanningfluorescencemicroplatecytometryinhighcontentscreening.Assay.DrugDev.Technol.4，209—221.Ciaraldi，T.P.，Carter，L，Rehman,N.，Mohideen，P.，Mudaliar，S.，禾口Henry，R.R.(2002).Insulinandinsulin-likegrowthfactor-1actiononhumanskeletalmuscle-preferentialeffectsofinsulin-likegrowthfactor—lintype2diabeticsubjects.Metabolism.51，1171-1179.DeSilva，D.R.，Jones，E.A.，Favata，M.F.，Jaffee，B.D.，MagoIda,R.L.，Trzaskos,J.M.，禾口Scherle，P.A.(1998).Inhibitionofmitogen-activatedproteinkinasekinaseblocksTcellproliferationbutdoesnotinduceorpreventanergy.JImmunol.160,4175-4181.ElbashirS.M.，HarborthJ.，LendeckelW.，YalcinΑ.，WeberK.，禾口TuschlΤ.(2001).Duplexesof21-nucleotidesRNAsmediateRNAinterferenceinmammaliancellculture.Nature.411.494-498Greene，E.L，Nelson，B.A.，Robinson,K.A.，禾口Buse，Μ.G.(2001).alpha-Lipoicacidpreventsthedevelopmentofglucose-inducedinsulinresistancein3T3—L1adipocytesandacceleratesthedeclineinimmunoreactiveinsulinduringcellincubation.Metabolism.50，1063-1069.Hu,Y.，Qiao，L.，Wang,S.，Rong，S.B.，Meuillet，E.J.，Berggren，M.，Gallegos，A.，Powis，G.，禾口Kozikowski，A.P.(2000).3-(Hydroxymethyl)-bearingphosphatidylinositoletherlipidanaloguesandcarbonatesurrogatesblockPI3-K，Akt，andcancercellgrowth.JMedChem.43,3045-3051.Kane,S.，Sano，H.,Liu,S.C.,Asara,J.Μ.,Lane,W.S.,Garner,C.C.，禾口Lienhard，G.E.(2002).Amethodtoidentifyserinekinasesubstrates.AktphosphorylatesanoveladipocyteproteinwithaRabGTPase-activatingprotein(GAP)domain.JBiol.Chem.277,22115-22118.KarIsson,H.K.，Hallsten，K.，Bjornholm，M.，Tsuchida，H.，Chibalin，A.V.，Virtanen，K.A.，Heinonen，0.J.，Lonnqvist,F.，Nuutila，P.，禾口Zierath，J.R.(2005a).Effectsofmetforminandrosiglitazonetreatmentoninsulinsignalingandglucoseuptakeinpatientswithnewlydiagnosedtype2diabetes:arandomizedcontrolledstudy.Diabetes.54，1459-1467.Karlsson，H.K.，Zierath，J.R.，Kane，S.，Krook，A.，Lienhard，G.E.，禾口WalIberg-Henriksson,H.(2005b).Insulin-stimulatedphosphorylationoftheAktsubstrateAS160isimpairedinskeletalmuscleoftype2diabeticsubjects.Diabetes.54,1692-1697.Nelson，B.A.，Robinson,K.A.，禾口Buse，M.G.(2002).DefectiveAktactivationisassociatedwithglucose—butnotglucosamine-inducedinsulinresistance.Am.JPhysiolEndocrinolMetab.282,E497-E506.Okada,T.，Kawano,Y.，Sakakibara，Τ.，Hazeki，0.，禾口Ui，Μ.(1994).Essentialroleofphosphatidylinositol3一kinaseininsulin-inducedglucosetransportandantilipolysisinratadipocytes.Studieswithaselectiveinhibitorwortmannin.JBiol.Chem.269,3568-3573.Sano,H.，Kane，S.，Sano,Ε.，Miinea，C.P.，Asara，J.Μ.，Lane，W.S.，Garner，C.W.，禾口Lienhard，G.Ε.(2003).Insulin-stimulatedphosphorylationofaRabGTPase-activatingproteinregulatesGLUT4translocation.JBiol.Chem.278，14599-14602.TuschT.，ZamorePD.，LehmannR.，BartelDP.禾口SharpPA(1999).TargetedmRNAdegradationbydouble-strandedRNAinvitro.GenesandDevelopment13.3191-3197Voss，M.D.，Beha，A.，Tennagels,N.，Tschank，G.，Herling，A.W.，Quint，M.，Gerl,Μ.，Metz-Weidmann,C.，Haun,G.，禾口Korn，Μ.(2005).GeneexpressionprofilinginskeletalmuscleofZuckerdiabeticfattyrats!implicationsforaroleofstearoyl-CoAdesaturase1ininsulinresistance.Diabetologia.48,2622-2630.Walgren,J.L.，Vincent，T.S.，Schey，K.L.，禾口Buse，M.G.(2003).HighglucoseandinsulinpromoteO-GlcNAcmodificationofproteins，includingalpha-tubulin.Am.JPhysiolEndocrinolMetab.284,E424-E434.WangQ.，KhayatΖ.，KishiY.，EbinaY.，和KlipΑ.(1998).GLUT4translocationbyinsulininintactmusclecells-detectionbyafastandquantitativeassay.FEBSLett.427(2)，193-197Yuan，J.S·，Reed，A.，Chen，F.，禾口Stewart，C.N.，Jr.(2006).Statisticalanalysisofreal-timePCRdata.BMCBioinformatics.7:85.,85.Zeigerer,A.，McBrayer,Μ.K.，禾口McGraw，Τ.Ε.(2004).InsulinstimulationofGLUT4exocytosis,butnotitsinhibitionofendocytosis，isdependentonRabGAPAS160.Mol.Biol.Cell.15，4406-4415.如果未另外指出，標準實驗室方法可以根據本領域已知的標準方法進行，例如如下列實驗室標準文獻中所描述的Sambrook等人(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual.Secondedition.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NY.545pp；CurrentProtocolsinMolecularBiology；周期性更新，例如卷2000；Wiley&Sons,Inc；編輯FredΜ.Ausubel,RogerBrent,RobertEg.Kingston,DavidD.Moore,J.G.Seidman，JohnA.Smith，KevinStruhl.CurrentProtocolsinHumanGenetics；；Wiley&Sons,IncNicholasC·Dracopoli，HonathanLHaines，BruceR.Korf,CynthiaC.Morton,ChristineE.Seidman,J.G.Seigman，DouglasR.Smith.CurrentProtocolsinProteinScience；；Wiley&Sons,IncJohnΕ.Coligan,BenΜ.Dunn,HiddeLPloegh，DavidW.Speicher,PaulT.Wingfield.MolecularBiologyoftheCell；第三片反；Alberts，B.，Bray,D.，Lewis,J.，Raff，Μ.，Roberts，K.，Watson,J.D.；GarlandPublishing，Inc.NewYork&London，1994；ShortProtocolsinMolecularBiology,第五片反，FrederickΜ.Ansubel(編^)，RogerBrent(㈱)，RobertΕ.Kingston(㈱)，DavidD.Moore(㈱)，J.G.Seidman(編輯)，JohnA.Smith(編輯)，KevinStruhl(編輯)，2002年10月，JohnWiley&Sons,Inc.，NewYork“Genetargeting:APracticalApproach,%2JoynerAL,^2000.IRLPressatOxfordUniversityPress，NewYork權利要求鑒定改變細胞的葡萄糖攝入的物質的方法，其包括(a)將包含AKT底物160kDa樣蛋白質(AS160樣蛋白質)或其功能性變體的檢測系統與測試物質接觸，和(b)通過檢測指示改變的細胞的葡萄糖攝入的信號來將測試物質鑒定為改變葡萄糖攝入和/或GLUT4至細胞質膜的轉運的物質。2.權利要求1的方法，其中細胞的葡萄糖攝入增加或減少，優選增加。3.權利要求1或2的方法，其中所述物質在至少一個、二個或三個胰島素敏感性組織中改變葡萄糖攝入和/或GLUT4至質膜的轉運。4.權利要求3的方法，其中所述胰島素敏感性組織是脂肪組織，骨骼肌和/或肝。5.權利要求1至4的任一項的方法，其中所述物質改變肝細胞、脂肪細胞和/或骨骼肌細胞的葡萄糖攝入和/或GLUT4至質膜的轉運。6.權利要求1至5的任一項的方法，其中所述AS160樣蛋白質是哺乳動物的AS160樣蛋白質，并且優選人AS160樣蛋白質。7.權利要求1至6的任一項的方法，其中所述AS160樣蛋白質是AS160的同種型2。8.權利要求1至6的任一項的方法，其中所述AS160樣蛋白質是AS160的同種型3。9.權利要求1至8的任一項的方法，其中所述AS160樣蛋白質包含SEQIDNO1或22編碼的序列或由所述序列組成。10.權利要求1至9的任一項的方法，其中所述檢測系統在細胞中。11.權利要求10的方法，其中所述細胞是骨骼肌細胞、脂肪細胞和/或肝細胞，特別地骨骼肌細胞。12.權利要求10或11的方法，其中所述細胞是來自細胞系的細胞。13.權利要求1至12的任一項的方法，其中所述可檢測信號是在細胞中表達的AS160樣蛋白質的量、磷酸化的AKT、磷酸化的AS160樣蛋白質、GLUT4至質膜的轉運、GLUT4在細胞中的分布或細胞對葡萄糖的攝入。14.權利要求1至13的任一項的方法，其中以化合物文庫的形式提供所述測試化合物。15.權利要求1至14的任一項的方法，其中在機器人系統中進行所述方法。16.權利要求1至15的任一項的方法，其中所述方法是高通量篩選的方法。17.用于鑒定提高細胞的葡萄糖攝入和/或GLUT4至質膜的轉運的物質的檢測系統，所述檢測系統包含編碼AKT底物160kDa樣蛋白質(AS160樣蛋白質)或其功能性變體的基因；和提供所述基因的可控表達的誘導型啟動子，其中AS160樣蛋白質或其功能性變體的激活影響可檢測的信號。18.權利要求17的檢測系統，其中所述檢測系統位于細胞，特別地遺傳改造的細胞中。19.權利要求18的檢測系統，其中所述基因和/或啟動子被導入遺傳改造的細胞。20.權利要求17至19的任一項的檢測系統，其中所述誘導型啟動子是四環素誘導型啟動子。21.權利要求17至20的任一項的檢測系統，其中所述檢測系統如在權利要求3至11的任一項中所進一步定義的。22.包含AS160樣蛋白質的檢測系統的用途，其用于鑒定改變，特別地提高細胞的葡萄糖攝入和/或GLUT4至質膜的轉運的物質。23.權利要求22的用途，其中所述檢測系統如在權利要求3至13和14至21的任一項中所進一步定義的。24.AS160樣蛋白質或其功能性變體在2型糖尿病的模型中的用途。25.異源表達AS160樣蛋白質或其功能性變體的細胞作為2型糖尿病的模型或在2型糖尿病的模型中的用途。26.權利要求24或25的用途，其中所述用途包括如權利要求3至13和14至21的任一項中所定義的檢測系統。27.根據前述權利要求9至26的任一項的方法、用途或檢測系統，其中所述AS160樣蛋白質是AS160蛋白質的同種型2或同種型3。28.多肽，其由或基本上由下述氨基酸序列組成根據SEQIDNO:3或23的氨基酸序列或根據SEQIDNO:1或22的序列所編碼的氨基酸序列。29.多核苷酸，其由或基本上由下述多核苷酸序列組成根據SEQIDN0:1或22的多核苷酸序列或編碼根據SEQIDNO3或23的多肽的多核苷酸序列。30.特異性結合根據權利要求28的多肽的抗體。31.異源表達根據權利要求28的多肽的細胞。32.用根據權利要求29的多核苷酸穩定地或瞬時轉染的細胞。33.能夠負干擾AS160樣蛋白質的表達和/或活性的siRNA。34.編碼AS160樣蛋白質的核酸或AS160樣蛋白質的核酸序列用于產生siRNA的用途。35.根據權利要求33的siRNA或根據權利要求35的用途，其中所述AS160樣蛋白質是AS160蛋白質的同種型2或3。全文摘要本發明涉及新型AKT底物160kDa樣蛋白質(AS160樣蛋白質)，涉及鑒定改變細胞的葡萄糖攝入和/或GLUT4至質膜的轉運的物質的方法，所述方法包括將包含AKT底物160kDa樣蛋白質(AS160樣蛋白質)的檢測系統與測試物質接觸，并且通過檢測指示改變的細胞的葡萄糖攝入的信號來鑒定測試物質為改變細胞的葡萄糖攝入的物質；涉及包含編碼AKT底物160kDa-樣蛋白質(AS160-樣蛋白質)的基因和提供基因的可控表達的誘導型啟動子的檢測系統；檢測系統用于鑒定提高細胞的葡萄糖攝入和/或GLUT4至質膜的轉運的物質的用途；以及AS160-樣蛋白質在2型糖尿病模型中的用途。文檔編號G01N33/68GK101815943SQ200880101474公開日2010年8月25日申請日期2008年7月23日優先權日2007年8月1日發明者D·鮑斯,K·赫梅爾,N·特納格爾斯,W·迪特里希申請人:塞諾菲-安萬特股份有限公司